Tüm Blood adlı ultrasensitive Protein Algılama için Tam Otomatik Santrifüj mikroakışkan Cihazı

Özet

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Özet

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO₂ nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO₂ NF mat; transfer-printing of TiO₂ NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

Giriş

Hastalık tanısı için çeşitli platformlar ^1,2 gibi nanotellerin, ³ nanopartiküller, ⁴ nanotüpler, ⁵ ve nano (NF'ler) ^6-8 olarak nano ölçekli malzemelere dayanan geliştirilmiştir. Bu nano kendi benzersiz fizikokimyasal özellikleri nedeniyle son derece hassas biyoanalizlere için yeni teknolojilerin tasarımı mükemmel umutları sunuyoruz. Örneğin, gözenekli bir çinko oksit nanolifler meme kanseri biyobelirteçlerinin femto-mol hassas bir şekilde tespit kullanılmaktadır. ^9. Son zamanlarda, kimyasal stabilitesini göz önüne biyoanalitik ^{edecektir 10} araştırılmıştır _(TiO2) titanyum dioksit esaslı sol-jel, ¹¹ ihmal edilebilir protein denatürasyonu ¹² ve ek olarak biyouyumluluk. ^13, _TiO2 yüzeyi üzerindeki hidroksil grupları kimyasal modifikasyon biyomoleküllerin kovalent bağlanmasını kolaylaştırır. ^14,15 Desenli _TiO2 thin, filmler ¹⁶ veya _TiO2 ¹⁷ yüzey alanını arttırarak, bir hedef proteinin algılama hassasiyetini artırmak için kullanılmıştır nanotüpler, Ancak, üretim süreci oldukça karmaşık ve pahalı ekipman gerektirir. Öte yandan, electrospun NF'ler basit ve düşük maliyetli üretim süreci yanı sıra nedeniyle yüksek yüzey alanı dikkatini alıyorsanız, ^18,19 henüz electrospun _TiO2 NF mat kırılgan ya da gevşek özelliği işlemek için zorlaştırır ve mikroakışkan cihazlar ile entegre. ^6,20 nedenle, _TiO2 NF paspaslar nadiren biyoanalitik uygulamalarda sert yıkama koşulları gerektiren özellikle kullanılmıştır.

Bu çalışmada, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için, ince bir polidimetilsiloksan (PDMS) yapışkan tabaka kullanarak, herhangi bir hedef alt-tabakanın yüzeyi üzerine, NF halılar electrospun aktarmak için yeni bir teknoloji geliştirilmiştir. furthermore, başarılı polikarbonat (PC) yapılan bir santrifüj mikroakışkan cihaz üzerine electrospun TiO NF paspaslar ₂ entegrasyonunu gösterdi. Bu cihazı kullanarak, C-reaktif protein, hassas bir yüksek tam otomatik ve entegre (CRP) ve kardiyak troponin I (cTnl) tam kan sadece 10 uL, 30 dakika içinde elde edilmiştir. ²¹ nedeniyle birleştirilebilir UF ve merkezkaç platformun özelliklerinin avantajları, deney alt saptama sınırı 100 ng / ml (~ 12:08) 1 ug / ml (~ 8 FM) den altı mertebe geniş bir dinamik aralık sergilemiştir CRP ve 37 pg / ml (~ 01:05) içindeki bir saptama sınırı 100 ng / ml (~ 4 nM), 10 pg / ml (~ 12:04) bir dinamik aralık için 0.8 ug / ml (~ 6 FM) ve cTnI için. Bu tespit limitleri ~ 300 ve 20 Hangi kat bunlara karşılık gelen geleneksel ELISA sonuçlarına göre daha düşük. Bu teknik, uygun antikorlar ile, herhangi bir hedef proteinlerin tespiti için uygulanabilir. Genel olarak, bu cihaz coörneğin, tam kan 10 ul; biyolojik numunelerin çok küçük miktarlarda bile büyük bir hassasiyetle hedef proteinlerin nadir miktarlarda algılayabilir beri uld in vitro diagnostik ve biyokimyasal tahliller büyük katkı. Biz sadece bu çalışmada ELISA kullanılarak serum protein algılama gösterdi rağmen, mikroakışkan cihazlar ile electrospun UF'lerin transferi ve entegrasyon teknolojisi daha geniş yüksek algılama hassasiyeti için büyük bir yüzey alanı gerektiren diğer biyokimyasal reaksiyonlarda uygulanabilir.

Protokol

Not: Kan sağlıklı bireylerden alınmış ve bir kan toplama tüpü içinde toplanmıştır. Yazılı bilgilendirilmiş olur Tüm gönüllülerden elde edilmiştir.

_TiO2 NF Mat 1. Fabrikasyon

1. Ön-madde ²² solüsyonuna hazırlanması
   1. Etanol (% 99.9, 3 mi) ve buzlu asetik asit (3 mi) içindeki bir karışımına titan tetraizopropoksit (TTIP), 1.5 g çözülür ve bir manyetik karıştırıcı ile 30 dakika boyunca oda sıcaklığında çözelti (25 ° C) karıştırılır.
   2. etanol (% 99.9) 3.64 g polivinil pirolidon (PVP) ağırlık bakımından% 11 çözülür ve bir sıcak levha manyetik karıştırıcı kullanılarak 1 saat boyunca 65 ° C'da, çözelti karıştırılır.
   3. Birleştirin ve bir sıcak levha manyetik bir karıştırıcı ile 4 saat 65 ° C sıcaklıkta iki çözüm karıştırın.
2. elektrospinning
   1. 200 um iç Diame bir paslanmaz çelik iğne bağlı bir şırınga içine hazırlanan çözelti yükter. dalgıç çıkardıktan sonra şırıngaya doğrudan çözüm dökün.
   2. yüksek DC voltajı (15 kV) topraklanmış alt-tabaka üzerine yerleştirilmiş bir silisyum üzerinde 10 dakika süre ile 0.3 ml / st bir akış oranında (2 cm x 2 cm) sürekli solüsyonun verilmesini. Elektrospinning sırasında iğne ve 10 cm topraklı alt-tabaka arasındaki mesafeyi ayarlamak.
3. NF mat kalsinasyon
   1. Bir fırın içinde NF koruyucu serin ve yüksek vakum koşullarında (5 x 10 ^-5 torr) altında 3 ° C / dk'lık bir rampa oranında 500 ° C'ye kadar sıcaklık kadar değişebilmektedir.
   2. 3 saat 500 ° C sıcaklık muhafaza edin. fırın içinde oda sıcaklığında (25 ° C) örneklerinin sıcaklık soğutun.

Bir Santrifüj mikroakışkan Disc içine TiO 2. Entegrasyon ₂ NF Mat

1. Bir diskin Fabrikasyon
   1. 3D tasarım yazılımı (örneğin, Sol kullanınidWorks veya) benzer diskin her katmanın odaları, kanal, ya da vanaları tasvir. Kod üreten yazılım (örn EdgeCAM veya benzeri) kullanarak bilgisayar nümerik kontrol (CNC) kod tasarım dosyalarını dönüştürün. Talimatlara göre yazılımları kullanın manuel ^23,24 Not:. Bu cihazda kullanılan tipik kanal boyutları x 0.3 mm (genişlik x derinlik) 1,0 mm'dir.
   2. (CNC freze makinesinin çalışma yazılımını açın, örneğin., DeskCNC veya benzeri) ve işletim yazılımı, CNC kodu yüklemek ve sırasıyla aşağıdaki tıklatın: "AUTO" -> "G KODU AÇIK" -> oluşturulan CNC kodu seçin.
   3. CNC freze PC plakasını: Disk tabakası için üst tabaka ve 5 mm PC plakaları için 1 mm PC tabak kullanın. "BAŞLAT" butonuna tıklayarak diskin her katmanı kesmek için CNC freze makinesi çalıştırın.
2. Diske _TiO2 NF mat Transferi
   1. bir silikon alt-tabaka ve 40 uL (tridekaflor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl), 30 dakika boyunca vakum altında bir vakum odasına -1-trichlorosilane ihtiva eden küçük bir Petri tabağına yerleştirin. fluorosilane buharlaşmakta ve alt tabaka üzerine kaplanmış olur.
   2. Bir vakum odası 1 oranında ve gazını: 10 bir sertleştirici madde ile birlikte polidimetilsiloksan (PDMS) ön-polimer karıştırın. Spin-kat 60 saniye boyunca 650 rpm'de bir silikon yüzeye PDMS.
   3. 10 dakika yapışkan bir duruma ulaşmak için 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde, silikon alt-tabaka üzerine kaplanmış PDMS Cure.
      Not: Kür süresi çevre koşullarına bağlı olarak değişebilir, ve yapışma kuvveti reometresi kullanılarak yapışma testi ile test edilebilir.
   4. Bir cımbız kullanarak PDMS kaplı silikon üzerine elektrospinning ve kalsinasyon tarafından hazırlanan _TiO2 NF mat aktarın. Daha sonra el (cam slayt, örneğin.) Düz bir nesneyle transfer _TiO2 NF mat bir konformal baskı uygulamak ve nesneyi çıkartın. koymak4 saat 65 ° C ya da 1 saat boyunca 80 ° C'de bir fırında Bu örnek tamamen PDMS tabakasını sertleştirmek için.
   5. 20 ul PDMS / sertleştirici karışımı kullanılarak disk kaplayın bağlanma reaksiyonu odaları (10: 1), bir yapışkan tabaka olarak işlev yapar diske _TiO2 NF mat takmak için.
   6. PDMS katmanda _TiO2 NF mat, etanol (% 99.9), 50 ul koyun, 6 mm çapında bir zımba deliği olan NF mat kesilmiş ve 20 ul ile kaplanmış bağlanma reaksiyonu odalarına _TiO2 NF mat kesim transfer önceki adımda PDMS.
      NOT: Bu adımda, etanol Si substrat kesilmiş _TiO2 NF mat ayırmak için yararlı olacaktır.
   7. 1 saat tam PDMS tedavi etmek için 4 saat boyunca ya da 80 ° C 'de 65 ° C' de fırında _TiO2 NF MAT entegre disk inkübe edin.
3. Diskte _TiO2 NF mat yüzey modifikasyonu
   1. PEtanol (3-glisidoksipropil) metildietoksi silan (GPDES) onarılması% 1 h / h çözeltisi (% 99.9).
   2. 140 W, 180 saniye boyunca 50 sccm oksijen akışı oksijen plazma ile _TiO2 NF mat entegre disk davranın. Her bir nano mat GPDES çözeltisi 100 ul koyun ve 2 saat oda sıcaklığında (25 ° C) inkübe edilir.
   3. Bir yıkama şişesi kullanılarak etanol (% 99.9) dağıtım yoluyla yüzeyler kısaca yıkayın, ardından diski tersini ve temiz karşı mendil lekeleme tamamen etanol çıkarın. 1 saat boyunca 80 ° C'de tedavi. Yukarıda belirtildiği gibi, fiziksel olarak adsorbe edilmiş ve bağlanmamış GPDES molekülleri uzaklaştırmak için, aynı şekilde, etanol (% 99.9) ile iki kez yıkanır.
   4. Kuru vakum altında, bir azot akımı ile kurutma.
      NOT: Disk kullanılıncaya kadar RT (25 ° C) kapalı bir kapta saklanabilir.
4. Yüzey üzerindeki antikorların immobilizasyonu
   1. antikorlarla 200 ug / ml 'lik bir solüsyonu (monoklonal fare anti yapmakİnsan hsCRP ya da bir fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), tampon (pH 7.4) sahip antikorlar seyreltilmesiyle monoklonal fare anti-cTnI). bir mikropipet kullanarak bir diskin her NF hasır üzerine çözeltinin 5 ul koyun. antikorlar hakkında daha fazla bilgi için malzeme listesine bakın.
   2. nemli bir oda içinde diskleri tutmak ve 4 saat 37 ° C'de inkübe edin. % 0.1 BSA-PBS tamponuyla NF MAT kaplanmış antikorları yıkayın. bir mikropipet kullanarak yıkama tamponu 100 ul ile odasını doldurmak, aspire veya boşaltma yoluyla tampon kaldırmak. Son olarak, diski ters çevirin ve temiz bir mendil karşı kurulayın ve ardından diski monte edin.
5. disk montaj
   1. Bir paket program (örn AutoCAD veya benzeri) kullanılarak, çift taraflı yapışkan bant ile disk tasarımı çizin. Kesme plotter CAD tasarım yükleyin.
   2. kesim plotter kullanarak çift taraflı yapışkan bant kesti. çift ​​yapışkan bant bir koruma tabakası soyulabilir ve i takmakDisk tabakanın üzerine t. diğer koruma katmanı soyulabilir ve disk katman üzerinde üst tabaka ekleyin.
   3. presleme makinesinde ön monte disk yerleştirin ve tam her valf, kanal ve odaları bağlamak için her katmanda hizalama işaretleri kullanarak üst / yapışkan / disk katmanı hizalamak. presleme makinesi kullanılarak konformal basınç uygulayın.

3. İmmunoassay

1. Mikropipet kullanılarak% 1 BSA-PBS tamponuyla odaları doldurun ve 1 saat 37 ° C'de inkübe diski. bir mikropipet kullanarak aspirasyon ile tamponu çıkarın. reaksiyona girmemiş siteleri engellemek için bir diskin proteinin spesifik olmayan adsorpsiyon azaltmak için bu adım gerçekleştirin.
2. doldurma ve bir mikropipet kullanılarak odaları aspire% 0.1 BSA-PBS ile iki kez yıkanır.
   NOT: Bu aşamada, disk, kullanılana kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
3. Bir micropipett kullanarak disk üzerinde CRP tespiti için antijen-çivili tam kan ya da CRP serbest serum yük 10 ule. Kalibrasyon grafikler yapmak için, 100 ng / ml, 1 ug / ml CRP konsantrasyonları kullanır; ve cTnl 10 ug / ml ila 100 ng / ml olmuştur.
   Not: uM aralığında genellikle tam kan içinde daha yüksek CRP seviyeleri nedeniyle, CRP içermeyen serumu cihazın düşük algılama sınırı göstermek için kullanılmıştır.
4. kırmızı kan hücreleri ayırmak için 60 saniye boyunca 3600 rpm (391 xg) diski Spin.
5. Açık valf lazer ışınlama ile 1. ve aktarım 3 sn 2,400 rpm'de diski iplik HRP ile konjuge antikorları tespit 8 ul içeren odasına süpernatant plazma 4 ul.
   Not:. Valf harekete ve disk işlemi görselleştirilmesi için genel işlemler önceki raporunda ayrıntılı olarak anlatılmıştır ²¹
6. Protein ve tespit antikorlarının bağlanma için, 5 saniye süreyle bir karıştırma modu (15Hz ^s-1, 15 °) uygulanır.
7. Valf # 2 ve bağlanma reaksiyonu odasına aşama 6'da elde edilen karışım transferi (2400 rpm3 sn). Daha sonra, karışım ve _TiO2 UF bağlayıcı antikorlar arasında bir immunoreaksiyonunu elde etmek için 20 dakika boyunca bir karıştırma modu (60 Hz ^s-1, 2 °) uygulanır. ve reaksiyon açık valf 3. sonra atık haznesi (2400 rpm, 10 sn) rezidüel karışımı aktarın.
8. Valf 4. açılması ve disk (2400 rpm, 4 sn) iplik bağlama reaksiyon odasına yıkama tamponu (600 ul) aktarın. Ardından odasında _TiO2 UF'lerini yıkamak için 120 saniye boyunca bir karıştırma modu (30 Hz s ^-1, 30 °) uygulanır.
9. Adım 3.8 aynı durumu takip ederek iki kez daha _TiO2 UF'lerini yıkayın ve 20 saniye boyunca 2400 rpm'de diski iplik tamamen kalıntı yıkama tamponu çıkarın. Ardından, vana 5. kapatın.
10. Kemilüminesan reaksiyon için, kapak 6 ve eğirme açarak bağlanma reaksiyonu odasına kemilüminesan substrat çözeltisi aktarıldıktan sonra 1 dakika boyunca bir karıştırma modu (30 Hz ^s-1, 2 °) uygulanırdaha sonra 10 saniye boyunca 2400 rpm'de disk.
11. Valf 7. açılması ve 10 saniye boyunca 2400 rpm'de diski iplik algılama odalarına tepki substrat çözüm aktarın.
12. Bir photomultiplier tüp (PMT) modülü donanımlı algılama sistemi kullanarak tepki gösterdi substrat çözeltisinden kemilüminesans sinyalleri ölçün.
    NOT: step motor, optik-bileşenler, çeviri aşamaları ve piyasada mevcut PMT: algılama sistemi aşağıdaki parçaları kullanarak özel inşa edilmiş bir makinedir. optomechanical parçalar ve step motor cihazı tutmak için monte edilir ve motor diski döndürebilirsiniz. algılama optik-parça sabit PMT tarafından gerçekleştirilir ve bu cihazın algılama odası üzerinde yer almaktadır. adım motor manipüle ederek, algılama odaları sağ PMT algılama bölgesi altında hizalanır.

Sonuçlar

Bu protokol, yüksek hassasiyet hazırlanan ile tam kandan protein tespiti için tam otomatik santrifüj mikroakışkan cihaz kullanarak. _TiO2 NF paspaslar Elektrospinning ve kalsinasyon işlemleri ile hazırlanmıştır. Bu akış hızı, voltaj ve eğirme süresi gibi koşullar, Elektrospinning, arzu edilen çapta, morfoloji ve kalınlığı UF'lerini imal etmek için optimize edilmiştir. koşulları optimize değildi zaman, oluşan UF'lerden kalitesi kötü. Özell...

Tartışmalar

_TiO2 NF entegre disk üzerinde deney kan çok düşük hacimde, düşük fazla proteinler arasında derece hassas saptanması için hızlı, ucuz ve kullanışlı bir yöntemdir. Bu teknik, küçük örnek hacimlerini (10 ul) kullanılarak avantajı vardır ve aynı anda birden fazla numune analiz için elverişlidir. Bu bir çoklayıcı immunoassay cihazı olarak büyük bir potansiyel sunmaktadır. Cihaz, geleneksel ELISA gereklidir plazma ayrılması gibi örnek ön-işlem aşamaları gerekli değildir ila...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Si wafer	LG SILTRON	Polished Wafer, test grade	Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700
Polycarbonate (PC)	Daedong Plastic	PCS#6900	Thickness (mm) = 1 and 5
Titanium tetraisopropoxide, 98%,	Sigma-Aldrich	205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000	Sigma-Aldrich	437190
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Anhydrous ethanol	Sigma-Aldrich	459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane	Sigma-Aldrich	448931
PDMS and curing agent	Dow Corning	SYLGARD 184
GPDES	Gelest Inc	SIG5832.0
Ethanol	J T Baker
FE-SEM	FEI	Nova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopy	ThermoFisher	K-alpha
3D modeling machine	M&I CNC Lab, Korea		CNC milling machine
Wax-dispensing machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Double-sided adhesive tape	FLEXcon, USA	DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotter	Graphtec Corporation, Japan	Graphtec CE3000-60 MK2
Spin coater	MIDAS	SPIN-3000D
Furnace (calcination)	R. D. WEBB COMPANY	WEBB 99
Rheometer (Tack test)	Thermo Scientific	Haake MARS III - ORM Package
Oxygen plasma system	FEMTO	CUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRP	Hytest Ltd., Finland	4C28	(clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnI	Hytest Ltd., Finland	4T21	(clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP	Abcam plc., MA	ab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI	Abcam plc., MA	ab24460	(clone # 16A11)
hsCRP	Abcam plc., MA	ab111647
cTnI	Fitzgerald, MA	30-AT43
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
PBS	Amresco Inc	E404
Blood collection tubes	BD vacutainer	367844	K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes
SuperSignal ELISA femto	Invitrogen	37074
Modular multilabel plate reader	Perkin Elmer	Envision 2104
Disc operating machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Photomultiplier tube (PMT)	Hamamatsu Photonics	H1189-210
AutoCAD	AutoDesk	Version 2012	Design software
SolidWorks 3D CAD software	SOLIDWORKS Corp.	Version 2013	3D Design software,
Edgecam	Vero software	version 2009.01.06928	Code generating software
DeskCNC	Carken Co.	version 2.0.2.18	CNC milling machine software