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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Zusammenfassung

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

Einleitung

Mehrere Plattformen für die Diagnose von Krankheiten wurden auf Basis von nanoskaligen Materialien 1,2 wie Nanodrähte entwickelt, 3 - Nanopartikel, 4 - Nanoröhrchen, 5 und Nanofasern (NFS) 6-8. Diese Nanomaterialien bieten hervorragende Perspektiven bei der Gestaltung neuer Technologien für die hochsensiblen Biotests aufgrund ihrer einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften. Zum Beispiel haben mesoporösen Zinkoxid - Nanofasern für die Femto-molar empfindlichen Nachweis von Brustkrebs Biomarkern verwendet worden. 9 Kürzlich Basis Nanomaterialien auf Titandioxid (TiO 2) wurden für bioanalytische Anwendungen 10 unter Berücksichtigung ihrer chemischen Stabilität, 11 vernachlässigbar Proteindenaturierung untersucht , 12 und Biokompatibilität. 13 Außerdem erleichtern die Hydroxylgruppen auf der Oberfläche der TiO 2 chemische Modifikation und die kovalente Anlagerung von Biomolekülen. 14,15 Patterned TiO 2 thin Filme 16 oder TiO 2 -Nanoröhren 17 die Detektionsempfindlichkeit eines Zielproteins zu verbessern , verwendet worden sind , durch den Oberflächenbereich zu erhöhen; jedoch ist das Herstellungsverfahren ziemlich komplex und erfordert eine teure Ausrüstung. Auf der anderen Seite, elektro NFs Aufmerksamkeit wegen ihrer hohen Oberfläche erhalten sowie einfache und kostengünstige Herstellungsverfahren; 18,19 noch die zerbrechliche oder lose Charakteristik des elektro TiO 2 NF Matte macht es schwierig zu handhaben und Integration mit mikrofluidischen Systemen. 6,20 Daher wurden die TiO 2 NF Matten selten in bioanalytischen Anwendungen eingesetzt, insbesondere solche , erfordern harte Waschbedingungen.

In dieser Studie wurden diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir durch die Verwendung eines dünnen Polydimethylsiloxan (PDMS) Haftschicht, eine neue Technologie für die Übertragung der NF elektroMatten auf die Oberfläche eines beliebigen Zielsubstrat entwickelt. Furthermore haben wir erfolgreich zeigte die Integration der elektro TiO 2 NF Matten auf eine zentrifugale Mikrofluidikvorrichtung aus Polycarbonat (PC) hergestellt. Mit diesem Gerät wird eine hochempfindliche, vollautomatische und integrierte Detektion von C-reaktivem Protein (CRP) sowie kardialem Troponin I (cTnI) wurde aus 10 & mgr; l Vollblut innerhalb von 30 min erreicht. 21 aufgrund der kombinierten Vorteile der Eigenschaften des NFS- und die zentrifugale Plattform der Assay einen breiten dynamischen Bereich von sechs Größenordnungen von 1 pg / ml (~ 8 fM) bis 100 ng / ml (~ 12.08) mit einer unteren Nachweisgrenze zeigten von 0,8 pg / ml (~ 6 fM) für CRP und einem dynamischen Bereich von 10 pg / ml (~ 12.04) bis 100 ng / ml (~ 4 nM) mit einer Nachweisgrenze von 37 pg / ml (~ 01.05) für cTnI. Diese Nachweisgrenzen sind ~ 300 und ~ 20-fach niedriger im Vergleich zu ihren entsprechenden herkömmlichen ELISA-Ergebnisse. Diese Technik könnte zum Nachweis von irgendwelchen Zielproteine ​​verwendet werden, mit entsprechenden Antikörpern. Insgesamt ist dieses Gerät could tragen wesentlich zur in-vitro - Diagnostik und biochemische Tests , da sie auch von sehr geringen Mengen an biologischen Proben selten Mengen von Zielproteinen mit großer Sensibilität erkennen kann, beispielsweise 10 & mgr; l Vollblut. Obwohl wir nur die Serumproteinnachweis mittels ELISA in dieser Studie gezeigt, die Übertragung und Integration Technologie der elektro NFs mit mikrofluidischen Vorrichtungen breiter in anderen biochemischen Reaktionen angewendet werden kann, die eine große Oberfläche für eine hohe Detektionsempfindlichkeit erfordern.

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Protokoll

HINWEIS: Es wurde Blut von gesunden Individuen gezogen und wurde in einem Blutsammelröhrchen gesammelt. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Freiwilligen erhalten.

1. Herstellung von TiO 2 NF Mat

  1. Herstellung der Vorläuferlösung 22
    1. Man löst 1,5 g Titantetraisopropoxid (TTIP) in einer Mischung aus Ethanol (99,9%, 3 ml) und Eisessig (3 ml) und mische die Lösung bei RT (25 ° C) für 30 min auf einem Magnetrührer.
    2. Man löst 11 Gew% Polyvinylpyrrolidon (PVP) in 3,64 g Ethanol (99,9%) und rührt die Lösung bei 65 ° C für 1 Stunde einer Heißplatte Magnetrührer.
    3. Kombinieren Sie und rühren die beiden Lösungen bei 65 ° C für 4 Stunden auf einer heißen Platte Magnetrührer.
  2. Elektroverspinnen
    1. Laden die hergestellte Lösung in eine Spritze mit einer Nadel aus rostfreiem Stahl von 200 um Innendurchter. Füllen Sie die Lösung direkt in die Spritze nach den Kolben zu entfernen.
    2. Einführung der Lösung ständig mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,3 ml / h für 10 min auf einen Si-Wafer (2 cm x 2 cm), die auf einem geerdeten Substrat bei einer hohen DC-Spannung (15 kV). Während der Elektro, stellen Sie den Abstand zwischen der Nadel und dem geerdeten Substrat bis 10 cm.
  3. Die Calcinierung der Matte NF
    1. Platzieren Sie die NF - Matte in einem Ofen und erhöhen die Temperatur bis zu 500 ° C mit einer Anstiegsrate von 3 ° C / min unter Hochvakuum - Bedingungen (5 x 10 -5 Torr).
    2. Man hält die Temperatur bei 500 ° C für 3 Stunden. Abkühlen, um die Temperatur der Proben auf den RT (25 ° C) in dem Ofen.

2. Integration von TiO 2 NF - Matte in eine Zentrifugal Mikrofluidik - Disc

  1. Herstellung einer Scheibe
    1. Verwenden Sie die 3D - Design - Software (zB SolIDWorks oder ähnliches) darstellen Kammern, Kanäle und Ventile jeder Schicht der Scheibe. Konvertieren Sie die Design - Dateien auf Computer numerischen Steuerung (CNC) Code Generierung von Code - Software (zB Edgecam oder ähnliches). Verwenden Sie die Software gemäß der Bedienungsanleitung 23,24 . Hinweis: Die typischen Kanal verwendeten Dimensionen in diesem Gerät sind 1,0 mm x 0,3 mm (Breite x Tiefe).
    2. Öffnen Sie die Betriebssoftware der CNC - Fräsmaschine (z. B. DeskCNC oder ähnliches) und laden CNC-Code in die Betriebssoftware und klicken Sie auf den folgenden in dieser Reihenfolge: "AUTO" -> "G CODE OPEN" -> Wählen Sie die CNC generierten Code.
    3. Bringen Sie die PC-Platte auf der CNC-Fräsmaschine: Verwenden Sie 1 mm PC-Platten für die obere Schicht und 5 mm PC-Platten für die Disc-Schicht. Führen Sie die CNC-Fräsmaschine, jede Schicht der Scheibe zu schneiden, indem Sie die Schaltfläche "Start" klicken.
  2. Übertragung von TiO 2 NF - Matte auf die Platte
    1. Platzieren ein Siliziumsubstrat und eine kleine Petrischale mit 40 ul (Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-trichlorsilan in einer Vakuumkammer unter Vakuum für 30 min. Das Fluorsilan verdampft und wird auf dem Substrat beschichtet.
    2. Mix Polydimethylsiloxan (PDMS) Vorpolymer mit einem Härter in einem Verhältnis 10: 1 und Entgasen in einer Vakuumkammer. Spin-Beschichtung der PDMS auf ein Siliciumsubstrat bei 650 rpm für 60 sec.
    3. Härten des PDMS beschichtet auf einem Siliziumsubstrat in einem Ofen bei 65 ° C für 10 min eine haftende Zustand zu erreichen.
      HINWEIS: Die Härtungszeit kann in Abhängigkeit von den Umgebungsbedingungen variiert werden und Haftkraft kann durch ein Klebrigkeitstest mit einem Rheometer geprüft werden.
    4. Übertragen Sie die TiO 2 NF - Matte durch Elektrospinnen und Brennen auf der PDMS-beschichteten Silizium unter Verwendung einer Pinzette vorbereitet. Wenden Sie dann manuell einen konformen Druck auf die TiO 2 übertragen NF - Matte mit einem flachen Gegenstand (z. B. Glasträger) und das Objekt entfernen. Stellenin dem Ofen dieser Probe bei 65 ° C für 4 Stunden oder bei 80 ° C für 1 Stunde die PDMS-Schicht vollständig auszuhärten.
    5. Coat Bindungsreaktionskammern in der Platte mit 20 ul der PDMS / Härter - Mischung (10: 1), die wirkt als Haftschicht TiO 2 NF Matte auf die Platte zu befestigen.
    6. Dispense 50 ul Ethanol (99,9%) auf der TiO 2 NF - Matte auf dem PDMS - Schicht, schneiden Sie die NF - Matte mit einem Stanzloch von 6 mm Durchmesser und übertragen den Schnitt TiO 2 NF Matte zu den Bindungsreaktionskammern , beschichtet mit 20 & mgr; l der PDMS in dem vorherigen Schritt.
      HINWEIS: In diesem Schritt wird Ethanol wird hilfreich sein , die geschnittenen TiO 2 NF Matte aus dem Si - Substrat zu lösen.
    7. Inkubieren der TiO 2 NF Matte integrierten Scheibe in den Ofen bei 65 ° C für 4 Stunden oder bei 80 ° C für 1 Stunde die PDMS vollständig auszuhärten.
  3. Oberflächenmodifizierung der TiO 2 NF Matte auf der Disk
    1. Prepare 1% v / v Lösung von (3-Glycidoxypropyl) methyldiethoxy Silan (GPDES) in Ethanol (99,9%).
    2. Behandeln Sie die TiO 2 NF Matte integrierte Scheibe mit Sauerstoffplasma bei 140 W, 50 sccm Sauerstoffstrom für 180 Sekunden. Dispense 100 ul GPDES Lösung auf jeder Nanofasermatte und Inkubation bei RT (25 ° C) für 2 Stunden.
    3. Waschen Sie die Substrate kurz durch Ethanol (99,9%) unter Verwendung einer Waschflasche Dispensen, entfernen Sie dann das Ethanol vollständig durch die Scheibe Umkehren und es gegen einen sauberen Blotting abzuwischen. Härtung bei 80 ° C für 1 Stunde. Zweimal waschen mit Ethanol (99,9%) in der gleichen Weise wie oben angegeben, die physikalisch adsorbiert und ungebundener GPDES Moleküle zu entfernen.
    4. Föhnen mit einem Stickstoffstrom, unter Vakuum getrocknet.
      HINWEIS: Die Scheibe kann in einem verschlossenen Behälter bei RT gelagert werden (25 ° C) bis zum Gebrauch.
  4. Immobilisierung von Antikörpern auf der Oberfläche
    1. Machen Sie eine Lösung von 200 ug / ml Fänger-Antikörper (monoklonale Maus-Antimenschliche hsCRP oder monoklonaler Maus-anti-cTnI) durch die Antikörper mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) -Puffer (pH 7,4) verdünnt. Verzichtet werden 5 ul der Lösung auf jede NF Matte in einer Scheibe mit einer Mikropipette. Siehe Liste Materialien für weitere Informationen über die Antikörper.
    2. Halten Sie die Scheiben in einer befeuchteten Kammer und Inkubation bei 37 ° C für 4 Stunden. Waschen Sie die NF-Matte mit 0,1% BSA-PBS Puffer beschichtet Antikörper. Füllen Sie die Kammer mit 100 ul Waschpuffer mit einer Mikropipette, entfernen Sie den Puffer durch Absaugen oder dekantieren. Schließlich kehren die Scheibe und tupfen sie gegen eine saubere wischen und dann die Scheibe montieren.
  5. Disc Montage
    1. Zeichnen Sie das Design der Scheibe auf doppelseitigen Klebeband mit einem CAD - Programm (zB AutoCAD oder ähnliches). Laden Sie die CAD-Konstruktion auf den Schneideplotter.
    2. Schneiden Sie das doppelseitige Klebeband die Schneideplotter verwenden. Ziehen Sie eine Schutzschicht aus Doppel-Klebeband ab und befestigen it auf der Oberseite der Plattenschicht. Ziehen Sie die andere Schutzschicht und befestigen Sie die obere Schicht auf der Disc Schicht ab.
    3. Legen Sie das vorläufig montierte Scheibe in der Pressmaschine und genau oben / Klebstoff / Scheibe Schichten unter Verwendung von Align Markierungen in jeder Schicht ausrichten, um jedes Ventil, Kanal verbinden und Kammern. Wenden Sie konformen Druck der Pressmaschine.

3. Immunoassay

  1. Füllen Sie die Kammern mit 1% BSA-PBS-Puffer mit einer Mikro und brüten die Scheibe bei 37 ° C für 1 Stunde unter Verwendung. Entfernen Sie den Puffer durch Absaugen mit einer Mikropipette. Führen Sie diesen Schritt, um die nicht umgesetzten Stellen zu blockieren und nicht-spezifische Adsorption von Protein zu reduzieren in einer Scheibe.
  2. Zweimal waschen mit 0,1% BSA-PBS durch Füllen und Absaugen der Kammern mit einer Mikropipette.
    HINWEIS: In diesem Stadium kann die Scheibe bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
  3. Last 10 ul Antigen-dotierten Vollblut oder CRP-freies Serum für die CRP-Erkennung auf der Disc ein micropipett mite. Für die Herstellung der Eichkurven verwenden Konzentrationen von CRP von 1 pg / ml bis 100 ng / ml; und cTnI von 10 pg / ml bis 100 ng / ml.
    HINWEIS: Aufgrund der höheren CRP in Vollblut, die in der Regel im Bereich um ist, CRP-freies Serum verwendet wurde, die geringe Nachweisgrenze der Vorrichtung zu demonstrieren.
  4. Drehen Sie die Scheibe bei 3600 Umdrehungen pro Minute (391 × g) für 60 Sekunden um die roten Blutkörperchen zu trennen.
  5. Offenes Ventil # 1 durch Laserbestrahlung, und Transfer 4 ul des Überstandes Plasma in die Kammer, die 8 & mgr; l Antikörper, konjugiert mit HRP Detektion durch die Scheibe bei 2.400 Upm für 3 sec dreht.
    . HINWEIS: Die allgemeinen Verfahren zur Ventilbetätigung und Visualisierung von Disks sind im Detail in einem früheren Bericht beschrieben 21
  6. Anwenden eines Mischmodus (15 Hz s -1, 15 °) für 5 sec auf Antikörper des Proteins und Nachweis zu binden.
  7. Öffnen Sie das Ventil # 2, und die Mischung übertragen, hergestellt in Schritt 6 an die Bindungsreaktionskammer (2400 Umdrehungen pro Minute, 3 sec). Wenden Sie dann einen Mischbetrieb (60 Hz s -1, 2 °) für 20 min eine Immunreaktion zwischen dem Gemisch und den bindenden Antikörpern auf den TiO 2 FNs zu erreichen. Nach der Reaktion wird das offene Ventil # 3 und übertragen die Restmischung in die Abfallkammer (2.400 Upm, 10 s).
  8. Übertragen Sie den Waschpuffer (600 ul) zu der Bindungsreaktionskammer durch das Ventil # 4 Öffnen und Drehen der Scheibe (2400 rpm, 4 sec). Dann bewerben Sie sich ein Mischbetrieb (30 Hz s -1, 30 °) für 120 Sekunden die TiO 2 FNs in der Kammer zu waschen.
  9. Waschen Sie die TiO 2 FNs mehr zweimal durch folgende gleiche Bedingung von Schritt 3.8, und entfernen Sie die restliche Waschpuffer vollständig durch die Scheibe bei 2400 Umdrehungen pro Minute für 20 Sekunden drehen. Dann schließen Sie das Ventil # 5.
  10. Für die Chemilumineszenzreaktion gelten einen Mischmodus (30 Hz s -1, 2 °) für 1 min nach der chemilumineszierenden Substratlösung zu der Bindungsreaktionskammer übertragen durch das Ventil # 6 Öffnen und SpinnAnschließend wird die Platte für 10 Sekunden bei 2.400 Umdrehungen pro Minute.
  11. Übertragen Sie die reagierte Substratlösung zu den Nachweiskammern durch Öffnen des Ventils # 7 und Drehen der Scheibe bei 2400 Umdrehungen pro Minute für 10 Sekunden.
  12. Messung der Chemilumineszenz-Signale aus der umgesetzten Substratlösung eine Photovervielfacherröhre (PMT) Modul ausgestattet Detektionssystem verwendet wird.
    HINWEIS: Das Detektionssystem ist eine maßgeschneiderte Maschine folgende Teile mit: Schrittmotor, mechanische Komponenten, Übersetzungsstufen und im Handel erhältliche PMT. Die optisch-mechanische Teile und Schrittmotor zusammengebaut werden, die Vorrichtung zu halten, und der Motor die Scheibe drehen kann. Die Detektion wird durch PMT fixiert auf den optomechanischen Teilen durchgeführt, und es wird über den Detektionskammern der Vorrichtung angeordnet. Durch den Schrittmotor zu manipulieren, werden die Detektionskammern direkt unter der Nachweiszone von PMT ausgerichtet sind.

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Ergebnisse

Unter Verwendung dieses Protokolls, ein vollautomatisiertes zentrifugalen Mikrofluidik-Vorrichtung zum Proteinnachweis aus Vollblut mit hoher Empfindlichkeit hergestellt. Die TiO 2 NF Matten wurden durch Prozesse der Elektrospinnen und Calcinieren hergestellt. Um die FNs der gewünschten Durchmesser, Morphologie und Dicke, Elektroverspinnen Bedingungen wie Strömungsgeschwindigkeit, Spannung und Spinn Zeit wurden optimiert herzustellen. Wenn die Bedingungen nicht optimiert wur...

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Diskussion

Der Assay auf TiO 2 NF integrierten Platte eine schnelle, kostengünstige und praktische Technik für die ultrasensitiver Detektion niedriger reichlich vorhandene Proteine ​​in sehr geringen Blutvolumen. Diese Technik hat den Vorteil der Verwendung von kleinen Probenvolumina (10 ul) und ist für die Analyse von mehreren Proben gleichzeitig zugänglich. Dies stellt ein großes Potential als Multiplexing-Immunoassay-Gerät. Die Vorrichtung hat den zusätzlichen Vorteil, dass es nicht Probevorbehandlungsschr...

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Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschüsse unterstützt (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), einen Zuschuss von der koreanischen Health Technology R & D-Projekt, das Ministerium für Gesundheit und Soziales (A121994) und IBS-R020-D1 von der koreanischen Regierung finanziert.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Si waferLG SILTRONPolished Wafer, test gradeDia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700
Polycarbonate (PC) Daedong PlasticPCS#6900Thickness (mm) = 1 and 5 
Titanium tetraisopropoxide, 98%,Sigma-Aldrich205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000Sigma-Aldrich437190
Acetic acidSigma-Aldrich320099
Anhydrous ethanolSigma-Aldrich459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilaneSigma-Aldrich448931
PDMS and curing agentDow CorningSYLGARD 184
GPDESGelest IncSIG5832.0 
EthanolJ T Baker
FE-SEMFEINova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopyThermoFisherK-alpha
3D modeling machineM&I CNC Lab, KoreaCNC milling machine
Wax-dispensing machineHanra Precision Eng. Co. Ltd., KoreaCustomized
Double-sided adhesive tapeFLEXcon, USADFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotterGraphtec Corporation, JapanGraphtec CE3000-60 MK2
Spin coaterMIDASSPIN-3000D
Furnace (calcination)R. D. WEBB COMPANYWEBB 99
Rheometer (Tack test)Thermo ScientificHaake MARS III - ORM Package
Oxygen plasma systemFEMTOCUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRPHytest Ltd., Finland4C28(clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnIHytest Ltd., Finland4T21(clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRPAbcam plc., MAab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnIAbcam plc., MAab24460(clone # 16A11)
hsCRPAbcam plc., MAab111647
cTnIFitzgerald, MA30-AT43
Bovine AlbuminSigma-AldrichA7906
PBSAmresco IncE404
Blood collection tubesBD vacutainer367844K2 EDTA 7.2 mg plus blood
collection tubes
SuperSignal ELISA femtoInvitrogen37074
Modular multilabel plate readerPerkin ElmerEnvision 2104
Disc operating machineHanra Precision Eng. Co. Ltd., KoreaCustomized
Photomultiplier tube (PMT)Hamamatsu PhotonicsH1189-210
AutoCADAutoDeskVersion 2012Design software
SolidWorks 3D CAD software SOLIDWORKS Corp.Version 20133D Design software,
EdgecamVero softwareversion 2009.01.06928Code generating software
DeskCNCCarken Co.version 2.0.2.18CNC milling machine software

Referenzen

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