Entièrement automatisé centrifuge microfluidique Dispositif pour Ultrasensitive Protein Détection de sang total

Résumé

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Résumé

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO₂ nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO₂ NF mat; transfer-printing of TiO₂ NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

Introduction

Plusieurs plates - formes pour le diagnostic de la maladie ont été élaborés à base de matériaux à l' échelle nanométrique ^1,2 tels que des nanofils, ³ nanoparticules, ⁴ nanotubes, ⁵ et nanofibres (SNF) ^6-8. Ces nanomatériaux offrent d'excellentes perspectives dans la conception de nouvelles technologies pour les essais biologiques très sensibles en raison de leurs propriétés physico-chimiques uniques. Par exemple, les nanofibres d'oxyde de zinc mésoporeuse ont été utilisées pour la femtoseconde molaire détection sensible des marqueurs biologiques du cancer du sein. ⁹ Récemment, des nanomatériaux à base de dioxyde de titane (TiO ₂₎ ont été étudiées pour des applications bioanalytiques ¹⁰ compte tenu de leur stabilité chimique, ¹¹ négligeable dénaturation des protéines ¹² et de la biocompatibilité. ¹³ En outre, les groupes hydroxyle sur la surface de TiO ₂ faciliter la modification chimique et la liaison covalente de biomolécules. ^14,15 modelée _TiO2 thin films ¹⁶ ou ¹⁷ nanotubes de TiO ₂ ont été utilisés pour améliorer la sensibilité de la détection d'une protéine cible en augmentant la zone de surface; Cependant, le procédé de fabrication est relativement complexe et nécessite un équipement coûteux. D'autre part, FNs électrofilées bénéficient d'une attention en raison de leur grande surface ainsi que processus simple et la fabrication à faible coût; ^18,19 encore, la caractéristique fragile ou lâche du électrofilés TiO ₂ mat NF rend difficile à manipuler et intégrer avec des dispositifs microfluidiques. ^6,20 par conséquent, les TiO ₂ tapis NF ont rarement été utilisés dans des applications bioanalytiques, en particulier celles qui nécessitent des conditions de lavage difficiles.

Dans cette étude, pour surmonter ces limitations, nous avons développé une nouvelle technologie pour le transfert du électrofilés NF Tapis sur la surface d'un substrat cible en utilisant un polydiméthylsiloxane mince (PDMS) couche adhésive. Furthermore, nous avons démontré avec succès l'intégration de électrofilée _TiO2 NF mats sur un dispositif microfluidique centrifuge en polycarbonate (PC). En utilisant ce dispositif, une détection de haute sensibilité, entièrement automatisé et intégré de la protéine C-réactive (CRP), ainsi que la troponine I cardiaque (cTnI) a été réalisée dans les 30 minutes à partir de seulement 10 pi de sang total. ²¹ En raison de la combinaison avantages des propriétés de la FN et la plate-forme centrifuge, l'essai ont montré une large plage dynamique de six ordres de grandeur de 1 pg / ml (~ 8 fM) à 100 ng / ml (~ 0,8 pM) avec une limite inférieure de détection de 0,8 pg / ml (~ 6 fM) pour CRP et une gamme dynamique de 10 pg / ml (~ 0,4 pM) à 100 ng / ml (~ 4 nM) avec une limite de détection de 37 pg / ml (~ 1,5 pM) pour cTnI. Ces limites de détection sont ~ 300 et ~ 20 fois plus faible par rapport à leurs résultats ELISA classiques correspondants. Cette technique pourrait être appliquée à la détection de toutes les protéines cibles, avec des anticorps appropriés. Dans l'ensemble, cette coopération de l'appareilULD contribuent grandement au diagnostic in vitro et des essais biochimiques , car il peut détecter des quantités rares de protéines cibles avec une grande sensibilité même de très petites quantités d'échantillons biologiques, par exemple, 10 pl de sang total. Bien que nous ne démontré la détection des protéines sériques par ELISA dans cette étude, la technologie de transfert et l'intégration des électrofilés FNs avec des dispositifs microfluidiques pourrait être appliquée plus largement dans d'autres réactions biochimiques qui nécessitent une grande surface pour une sensibilité de détection élevée.

Protocole

REMARQUE: On prélève du sang d'individus sains et a été recueilli dans un tube de collecte de sang. Le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de tous les bénévoles.

1. Fabrication de TiO ₂ Mat NF

1. Préparation de la solution de précurseur ²²
   1. Dissoudre 1,5 g de tétraisopropylate de titane (TTIP) dans un mélange d'éthanol (99,9%, 3 ml) et de l'acide acétique glacial (3 ml) et mélanger la solution à la température ambiante (25 ° C) pendant 30 min sur un agitateur magnétique.
   2. Dissoudre 11% en poids de polyvinylpyrrolidone (PVP) dans 3,64 g d'éthanol (99,9%) et agiter la solution à 65 ° C pendant 1 heure en utilisant un agitateur magnétique à plaque chauffante.
   3. Combiner et mélanger les deux solutions à 65 ° C pendant 4 heures sur un agitateur magnétique à plaque chauffante.
2. électrofilage
   1. Chargez la solution préparée dans une seringue reliée à une aiguille de 200 um Diame intérieure en acier inoxydableter. Verser la solution directement dans la seringue après le retrait du piston.
   2. Introduire la solution constamment à un débit de 0,3 ml / h pendant 10 min sur une tranche de silicium (2 cm x 2 cm) placées sur un substrat mis à la terre à une tension continue élevée (15 kV). Au cours de l'électrofilage, régler la distance entre l'aiguille et le substrat à la terre à 10 cm.
3. Calcination du tapis NF
   1. Placer le tapis NF dans un four et à augmenter la température jusqu'à 500 ° C avec une vitesse de montée en puissance de 3 ° C / min dans des conditions de haut vide (5 x 10 ^-5 Torr).
   2. Maintenir la température à 500 ° C pendant 3 h. Refroidir la température des échantillons à la température ambiante (25 ° C) dans le four.

2. Intégration de TiO ₂ Mat NF dans un centrifuge microfluidique Disc

1. Fabrication d'un disque
   1. Utilisez le logiciel de conception 3D (par exemple, SolidWorks ou similaire) pour dépeindre les chambres, canaux ou soupapes de chaque couche de disque. Convertir les fichiers de conception à commande numérique par ordinateur (CNC) en utilisant le code de génération de code logiciel (par exemple, Edgecam ou similaire). Utilisez les logiciels selon le manuel d' instruction ^23,24 Note:. Les dimensions typiques des canaux utilisés dans ce dispositif sont de 1,0 mm x 0,3 mm (largeur x profondeur).
   2. Ouvrez le logiciel d'exploitation de la machine de fraisage CNC (par ex., DeskCNC ou similaire) et charger le code CNC pour le logiciel d'exploitation et cliquez sur les éléments suivants dans l'ordre: "AUTO" -> "G CODE OPEN" -> Sélectionnez le code CNC généré.
   3. Fixez la plaque de PC sur la machine de fraisage CNC: utiliser 1 plaques mm PC pour la couche supérieure et des plaques de PC de 5 mm pour la couche de disque. Exécutez la machine de fraisage CNC pour couper chaque couche du disque en cliquant sur le bouton "START".
2. Transfert de TiO ₂ mat NF sur le disque
   1. Placer un substrat de silicium et une petite boîte de Pétri contenant 40 ul de (tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyl) -1-trichlorosilane dans une chambre à vide sous vide pendant 30 min. Fluorosilane se vaporise et enduit sur le substrat.
   2. Mélanger les huiles polydiméthylsiloxanes (PDMS) de pré-polymère avec un agent de durcissement dans un rapport de 10: 1 et dégazer dans une chambre à vide. Spin-coat les PDMS sur un substrat de silicium à 650 rpm pendant 60 secondes.
   3. Durcir les PDMS revêtus sur un substrat de silicium dans un four à 65 ° C pendant 10 minutes pour atteindre un état adhérent.
      NOTE: Le durcissement du temps peut varier en fonction des conditions environnementales, et la force d'adhérence peut être testée par un test d'adhérence à l'aide d'un rhéomètre.
   4. Transférez le tapis TiO ₂ NF préparé par électrofilage et calcination sur le silicium PDMS revêtu en utilisant une pince à épiler. Ensuite, appliquer manuellement une pression conformationnelle sur le TiO ₂ mat NF transféré avec un objet plat (par exemple., Lame de verre) et retirer l'objet. Mettrecet échantillon dans le four à 65 ° C pendant 4 heures ou à 80 ° C pendant 1 heure pour faire durcir la couche de PDMS complètement.
   5. Manteau de liaison des chambres de réaction dans le disque avec 20 ul du / de mélange de l' agent de durcissement PDMS (10: 1), qui agit comme une couche adhésive pour fixer le TiO ₂ mat NF sur le disque.
   6. Distribuer 50 pi d'éthanol (99,9%) sur le tapis TiO ₂ NF sur la couche PDMS, couper le tapis NF avec un trou de perforation de 6 mm de diamètre, et transférer la coupe TiO ₂ mat NF aux chambres de réaction de liaison revêtues de 20 pl du PDMS à l'étape précédente.
      NOTE: Dans cette étape, l' éthanol sera utile pour détacher la coupe TiO ₂ mat NF du substrat Si.
   7. Incuber le TiO ₂ mat NF disque intégré dans le four à 65 ° C pendant 4 heures ou à 80 ° C pendant 1 heure pour guérir les PDMS complètement.
3. La modification de surface du tapis de TiO ₂ sur le disque NF
   1. PRepare solution à 1% v / v de (3-glycidoxypropyl) silane méthyldiéthoxy (GPDES) dans l'éthanol (99,9%).
   2. Traiter le disque intégré TiO ₂ mat NF avec un plasma d'oxygène à 140 W, débit d'oxygène de 50 sccm pendant 180 sec. Distribuer 100 pl de solution GPDES sur chaque tapis de nanofibres et laisser incuber à la température ambiante (25 ° C) pendant 2 heures.
   3. Laver les substrats brièvement en distribuant de l'éthanol (99,9%) en utilisant une bouteille de lavage, puis retirer l'éthanol complètement en inversant le disque et il buvard contre un propre lingette. Cure à 80 ° C pendant 1 heure. Laver deux fois avec de l'éthanol (99,9%) de la même manière que celle indiquée ci-dessus, pour éliminer les physiquement adsorbées et non liée GPDES molécules.
   4. Séchez avec un courant d'azote sec sous vide.
      REMARQUE: Le disque peut être stocké dans un récipient fermé à la température ambiante (25 ° C) jusqu'à utilisation.
4. Immobilisation d'anticorps sur la surface
   1. Préparer une solution de 200 ug / ml d'anticorps de capture (anticorps monoclonal de souris anti-hsCRP humain ou de souris monoclonal anti-cTnI) en diluant les anticorps avec un tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,4). Distribuer 5 ul de la solution sur chaque tapis NF dans un disque à l'aide d'une micropipette. Voir la liste des matériaux pour plus d'informations sur les anticorps.
   2. Maintenir les disques dans une chambre humidifiée et incuber à 37 ° C pendant 4 heures. Laver les anticorps revêtus mat NF avec un tampon BSA-PBS 0,1%. Remplir la chambre avec 100 pi de tampon de lavage à l'aide d'une micropipette, retirez le tampon par aspiration ou par décantation. Enfin, inverser le disque et épongez contre un nettoyage lingette, puis assembler le disque.
5. Ensemble de disque
   1. Dessinez la conception du disque sur un ruban adhésif double face en utilisant un programme de CAO (par exemple, AutoCAD ou similaire). Chargez le dessin CAO au traceur de découpe.
   2. Couper le ruban adhésif double face en utilisant le traceur de découpe. Décoller une couche de protection de ruban adhésif double et fixer it au-dessus de la couche de disque. Décoller l'autre couche de protection et fixer la couche supérieure sur la couche du disque.
   3. Chargez le disque préalablement assemblé dans la machine de pressage et d'aligner précisément les couches supérieure / adhésives / disque à l'aide des marques d'alignement dans chaque couche pour connecter chaque vanne, le canal, et les chambres. Appliquer une pression conformationnelle en utilisant la machine de pressage.

3. Immunoassay

1. Remplir les chambres avec du tampon BSA-PBS à 1% en utilisant une micro-pipette et laisser incuber le disque à 37 ° C pendant 1 heure. Retirer le tampon par aspiration à l'aide d'une micropipette. Effectuez cette étape pour bloquer les sites ayant pas réagi et de réduire l'adsorption non-spécifique de la protéine dans un disque.
2. Laver deux fois avec 0,1% de BSA-PBS et en remplissant les chambres d'aspiration en utilisant une micropipette.
   Remarque: À ce stade, le disque peut être stocké à 4 ° C jusqu'à utilisation.
3. Charge 10 pi de sang total de l'antigène enrichi ou sans sérum CRP-pour la détection de la CRP sur le disque en utilisant un micropipette. Pour effectuer les graphiques d'étalonnage, en utilisant des concentrations de CRP de 1 pg / ml à 100 ng / ml; et cTnI de 10 pg / ml à 100 ng / ml.
   NOTE: En raison des niveaux plus élevés de CRP dans le sang total, qui est habituellement dans la gamme uM, sans sérum CRP a été utilisée pour démontrer la faible limite de détection de l'appareil.
4. Faire tourner le disque à 3 600 tours par minute (391 x g) pendant 60 secondes pour séparer les globules rouges.
5. vanne ouverte n ° 1 par une irradiation laser, et un transfert de 4 pi du surnageant de plasma dans la chambre contenant 8 pi de détection d'anticorps conjugués à la HRP en faisant tourner le disque à 2400 tours par minute pendant 3 secondes.
   NOTE:. Les processus généraux d'actionnement de la vanne et la visualisation de fonctionnement du disque sont décrits en détail dans un précédent rapport ²¹
6. Appliquer un mode de mélange ^(1, 15 ° de la 15 s Hz) pendant 5 secondes pour la liaison des anticorps de la protéine et de détection.
7. Ouvrez la vanne n ° 2, et transférer le mélange préparé à l'étape 6 à la chambre de réaction de liaison (2400 rpm, 3 sec). Ensuite, appliquer un mode de mélange ^(1, 2 ° C de 60 Hz) pendant 20 minutes pour réaliser une réaction immunologique entre le mélange et les anticorps se liant sur ​​le _TiO2 FNs. Après la réaction, la vanne ouverte n ° 3 et transférer le mélange résiduel dans la chambre de déchets (2400 rpm, 10 secondes).
8. Transférer le tampon de lavage (600 pi) à la chambre de réaction de liaison en ouvrant la vanne 4 et faire tourner le disque (2400 tpm, 4 secondes). Ensuite , appliquez un mode de mélange ^(-1, 30 ° de la de 30 Hz) pendant 120 secondes pour se laver les TiO ₂ FNs dans la chambre.
9. Laver les TiO ₂ FNs deux fois en suivant même état ​​de l' étape 3.8, et retirer le tampon de lavage résiduel complètement en faisant tourner le disque à 2400 rpm pendant 20 sec. Ensuite, fermez le robinet # 5.
10. Pour la réaction de chimiluminescence, appliquer un mode de mélange ^(1, 2 ° C de 30 Hz) pendant 1 min après le transfert de la solution de substrat chimioluminescent dans la chambre de réaction de liaison en ouvrant la vanne 6 et le filagele disque à 2400 rpm pendant 10 secondes par la suite.
11. Transférer la solution de substrat ayant réagi à la chambre de détection en ouvrant la vanne 7 et faire tourner le disque à 2400 tpm pendant 10 secondes.
12. Mesurer les signaux de chimioluminescence de la solution de substrat ayant réagi en utilisant un tube photomultiplicateur (PMT), le module de système de détection équipé.
    NOTE: Le système de détection est une machine construite sur mesure en utilisant les éléments suivants: moteur pas à pas, les composants mécaniques, les stades de la traduction, et disponible dans le commerce PMT. Les parties optomécaniques et moteur pas à pas sont assemblés pour maintenir le dispositif, et le moteur peut tourner le disque. La détection est réalisée par VPM fixe sur les pièces mécaniques, et il est situé au-dessus des chambres de détection du dispositif. En manipulant le moteur pas à pas, les chambres de détection sont alignés à droite en dessous de la zone de détection du TRE.

Résultats

En utilisant ce protocole, un dispositif microfluidique centrifuge entièrement automatisé pour la détection des protéines du sang entier avec une sensibilité élevée a été préparé. Les TiO ₂ tapis NF ont été préparés par des procédés de électrofilage et calcination. Afin de fabriquer le FNs de diamètre désiré, la morphologie et l'épaisseur, des conditions telles que le débit, la tension et le temps filer électrofilage ont été optimisés. Lorsque le...

Discussion

Le dosage de TiO ₂ NF disque intégré est une technique rapide, économique et pratique pour la détection ultrasensible de faible abondance des protéines présentes dans un volume très faible de sang. Cette technique présente l'avantage d'utiliser des volumes d'échantillons de petite taille (10 pi) et se prête à l'analyse de plusieurs échantillons simultanément. Cela fournit un grand potentiel en tant que dispositif de multiplexage de dosage immunologique. Le dispositif a l'avant...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Si wafer	LG SILTRON	Polished Wafer, test grade	Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700
Polycarbonate (PC)	Daedong Plastic	PCS#6900	Thickness (mm) = 1 and 5
Titanium tetraisopropoxide, 98%,	Sigma-Aldrich	205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000	Sigma-Aldrich	437190
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Anhydrous ethanol	Sigma-Aldrich	459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane	Sigma-Aldrich	448931
PDMS and curing agent	Dow Corning	SYLGARD 184
GPDES	Gelest Inc	SIG5832.0
Ethanol	J T Baker
FE-SEM	FEI	Nova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopy	ThermoFisher	K-alpha
3D modeling machine	M&I CNC Lab, Korea		CNC milling machine
Wax-dispensing machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Double-sided adhesive tape	FLEXcon, USA	DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotter	Graphtec Corporation, Japan	Graphtec CE3000-60 MK2
Spin coater	MIDAS	SPIN-3000D
Furnace (calcination)	R. D. WEBB COMPANY	WEBB 99
Rheometer (Tack test)	Thermo Scientific	Haake MARS III - ORM Package
Oxygen plasma system	FEMTO	CUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRP	Hytest Ltd., Finland	4C28	(clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnI	Hytest Ltd., Finland	4T21	(clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP	Abcam plc., MA	ab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI	Abcam plc., MA	ab24460	(clone # 16A11)
hsCRP	Abcam plc., MA	ab111647
cTnI	Fitzgerald, MA	30-AT43
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
PBS	Amresco Inc	E404
Blood collection tubes	BD vacutainer	367844	K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes
SuperSignal ELISA femto	Invitrogen	37074
Modular multilabel plate reader	Perkin Elmer	Envision 2104
Disc operating machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Photomultiplier tube (PMT)	Hamamatsu Photonics	H1189-210
AutoCAD	AutoDesk	Version 2012	Design software
SolidWorks 3D CAD software	SOLIDWORKS Corp.	Version 2013	3D Design software,
Edgecam	Vero software	version 2009.01.06928	Code generating software
DeskCNC	Carken Co.	version 2.0.2.18	CNC milling machine software