制备和表征亲脂阿霉素前药胶束

摘要

一个亲脂性的阿霉素前体药物的制备和表征协议加载1,2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N - [氨基（聚乙二醇）-2000]（DSPE-PEG）胶束描述。

摘要

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and ¹H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (¹H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

引言

化疗通常用于治疗各种形式的癌症。大多数，如果不是全部，化疗药物具有毒性副作用可以从管理次要条件，如恶心和腹泻而变化，更危及生命的状况。因为大多数抗癌药物的毒性，这些药物非选择性暴露于正常组织不可避免地会导致毒性。因此，为治疗性的方法，可以选择性地递送药物进入肿瘤细胞非常需要。与抗肿瘤药物的管理的另一个挑战是他们的水溶性差。一般，需要增溶剂来配制这些难溶性药物。然而，大多数的增溶剂，如二甲基亚砜（DMSO），聚氧乙烯蓖麻油，和聚山梨醇酯80（吐温80）可能引起肝，肾毒性，溶血，急性过敏反应和周围神经病变^。1因此，需要对安全性和生物相容性制剂临床使用的差LY水溶性抗癌药物。纳米载体是有希望的药物递送系统用于解决上述挑战。这些纳米载体包括脂质体， ^纳米粒子^，3胶束^，4-7聚合物药物结合物^，8和无机材料^。9一些纳米产品（ 如 DOXIL，Abraxane的，和Genexol）已通过监管机构来治疗癌症病人。 ¹⁰

聚合物胶束是有希望的纳米级药物递送载体，其中已被成功地用于抗癌药物的输送。通过自组装过程从两亲聚合物制备^4-7,11,12典型聚合物胶束。芯 - 壳结构的聚合物胶束包括亲水​​壳和疏水核心。亲水壳可以在空间上稳定胶束并延长其在血液中循环。疏水核可以有效地封装疏水ð地毯。因为胶束（通常小于200nm）和长循环特性的小尺寸的，聚合物胶束被认为达到肿瘤通过增强的渗透性和保留（EPR）效果（被动靶向肿瘤）定位。

载药量稳定对肿瘤靶向胶束的能力至关重要。以达到最佳的肿瘤定位，微胶粒应具有最小的药物泄漏在到达肿瘤部位之前，尚未进入癌细胞后迅速释放药物。此外，制剂稳定性也是产品开发的一项基本要求，因为制剂稳定性决定产品开发的可行性，以及开发的产品的保质期。最近，许多努力已经取得了改善的药物装载到递送载体。所述亲脂性前药的方法是已被探索，以改善药物加载到脂质纳米颗粒和乳剂的策略^。13,14的连词用药物脂质ugation可以显著改善他们的亲脂性，提高装载和固定在纳米载体的亲脂成分。

在这里，我们描述了准备亲脂阿霉素前药胶束的协议。首先，对于阿霉素亲脂性前药的合成方法进行说明。然后，被引入用于产生与一个薄膜分散法胶束的协议。这种方法已在我们以前的研究已成功地用于⁵ DSPE-PEG，被选定为，因为它已被成功地用于胶束药物递送制备胶束载体材料^15,16最后，我们描述了用于表征胶束几个体外测定制剂，并评价抗癌活性。

研究方案

1. DOX-PA的合成

1. 称量390毫克的阿霉素和243毫克棕榈酸酰肼，并转移到一个圆底烧瓶中。
2. 添加150毫升无水甲醇中，用玻璃注射器烧瓶中。添加39微升三氟乙酸（TFA）的用移液管。用磁力搅拌器，搅拌在RT在黑暗中18小时，将反应混合物。
   注意:反应材料的量可被放大或缩小，以获得不同量的DOX的功率放大器。反应物的比例应在相同的比例被维持。使用DOX量在78毫克至1,170毫克的范围内的反应可在常规的化学实验室中进行。
3. 用硅胶柱DOX-PA的纯化^。17
   1. 用旋转蒸发器除去在反应混合物中的溶剂。加入3克硅胶的混合物的体积减少到大约20之后ml。继续旋转蒸发，得到干的粉末，并允许将T他吸附产品走上硅胶。保持在真空下将样品另外的30分钟，形成了干燥粉末后。
   2. 包50克硅胶成使用二氯甲烷作为溶剂的柱。小心加入含吸附水的产品到柱硅胶样本。
   3. 洗脱用二氯甲烷和甲醇的混合物的塔，同时逐渐增加甲醇的比例，从而增加溶剂极性（ 表1）。
   4. 收集在试管洗脱液级分（25毫升/管）并监测通过薄层色谱（TLC）的进展。
   5. 结合含有纯DOX-PA的所有级分，并用旋转蒸发器，直至形成干粉除去溶剂。进一步干燥真空O / N下的产物。
4. 分析DOX-PA通过TLC的。
   1. 切TLC板的4cm的×8cm的部分。从在用TLC点样毛细管板的底部斑点样品溶液0.5厘米使用满足hanol作为溶剂。
   2. 放置TLC板到含有二氯甲烷和甲醇的混合物中的显影腔室（3/1，体积/体积）。的溶剂中的深度应只是比0.5厘米以下。
   3. 从显影腔移除所述板当溶剂前沿到达板的顶部。标记溶剂前沿用铅笔的位置，并允许所述板干燥。放置TLC板到含有以显现样品饱和碘蒸气染色室中。
5. ¹ H-核磁共振光谱^{（1H-NMR）DOX-PA}分析^。18
   1. 溶解15mg的DOX的PA在1ml甲基亚砜-D6（DMSO）中的和样品转移到一个NMR管中。
   2. 将NMR管进入核磁共振仪器的磁铁。测量质子光谱，选择DMSO作为溶剂。从磁体取出NMR管。分析核磁共振结果^18。

2。 DOX-PA胶束由薄膜分散法制备

1. 溶解DSPE-PEG（40毫克）和DOX-PA（4毫克）在10毫升玻璃小瓶2ml甲醇。
2. 使用旋转蒸发，直到在小瓶的薄膜形成真空下除去有机溶剂。
   注意:可替换地，蒸发的有机溶剂在惰性气体下（ 例如 ，氩气或氮气），以形成薄膜，并保持小瓶在真空干燥器以进一步除去残留的溶剂。
3. 转印2毫升Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（pH值7.4，DPBS）的玻璃小瓶中。
4. 放置在小瓶在超声浴中3分钟在室温下，以产生胶束。
   注:超声波浴的不同型号之间的超声波功率变化。选择能产生足够的超声功率驱散薄的聚合物/药物薄膜的单位。在这个协议中使用超声波浴的输出功率为110 W.
5. 保持胶束在4℃下短期储存和-20℃下长期-term存储。
   注意:可替换地，微胶粒还可以是冷冻干燥并在使用前用水重构。通常情况下，需要对这一提法没有冷冻保护剂或冻干保护剂。

3. DOX-PA胶束的表征

1. DOX-PA浓度的胶束和药物包封率的测定
   1. 1微克/毫升，5微克/毫升，20微克/毫升，50微克/毫升和100微克/毫升:溶解DOX-PA在DMSO中前面的步骤，制备了五种不同浓度的DOX-PA的溶液合成。测量DOX的PA解决方案的吸收与在490nm处的UV-VIS光谱仪。基于所述DOX-PA的药物浓度和在490nm处的相应吸收率的标准曲线。
   2. 稀释25微升载药胶束的500微升DMSO的。测量在490nm处用UV-VIS分光计的吸收。计算药物浓度与3.1.1中产生的标准曲线。
   3. 使用以下等式计算包封效率:
      药物包封率（％）=（在胶束药物量）/（加入的药物量）×100％
2. 粒径用动态光散射表征（DLS）
   1. 稀释用DPBS（pH 7.4）中的胶束为1毫克/毫升的最终的DSPE-PEG浓度。分析2ml样品用粒度分析仪得到的Z均尺寸和多分散指数（PDI）。
3. 体外抗癌活性的评价
   注意:使用适当的无菌技术和生物安全柜的内部运作。
   1. 从细胞培养烧瓶中取出细胞培养基（ 例如，T25）含有DU-145人前列腺癌细胞并用2ml的DPBS（pH7.4）中冲洗细胞。
   2. 抽吸DPBS，加入1毫升胰蛋白酶溶液（0.25％），并在37℃孵育2分钟以分离细胞。
   3. 添加10米细胞培养基的L（RPMI 1640 + 10％胎牛血清+ 1％抗菌 - 抗霉菌），当大多数细胞从烧瓶脱落。转移细胞到15毫升离心管中并离心将细胞以1000 xg离心5分钟。
   4. 重悬用5ml细胞培养基的细胞沉淀并除去的样​​品用于与血球计数细胞数。稀释用细胞培养基将细胞以50,000细胞/ ml的密度。添加稀释的细胞悬液到96孔细胞培养板（100μl/孔）。孵育在细胞培养孵化器中的细胞（37℃，5％CO _2）18 ​​小时，以允许细胞附着。
   5. 稀DOX二甲基亚砜（DMSO）溶液和DOX-PA DMSO溶液用细胞培养基分别以获得0.1微米的最终药物浓度，0.5μM，2微米，5微米和10微米。保持最终DMSO浓度以上所有的样品中至0.5％。稀DOX-PA胶束用细胞培养基以得到最终的药物共0.1μMncentrations，分别为0.5微米，2微米，5微米和10微米。使用空白细胞培养液控制。
   6. 从培养箱中取出96孔细胞培养板，并用100微升培养基含有在步骤3.3.5制备（n = 4时为每个组）不同处理剂更换细胞培养基。孵育在细胞培养孵化器中的细胞（37℃，5％CO _2）的额外72小时。
   7. 吸出培养基并加入100μl的培养基中含有0.5mg / ml的3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑鎓溴化物（MTT）。
   8. 孵育额外的2小时的细胞培养孵化细胞。小心取出介质，并添加100微升DMSO来溶解甲晶体。
   9. 在570纳米的波长和670nm的参考波长测定用微孔板分光光度计吸光度。
   10. 使用下列公式计算细胞存活率:
       的细胞活力（％）=（A _测试 / _控制 ）×100％
       注意:使用方差分析（ANOVA）统计检验的单向分析比较不同组之间的细胞生存力。基于细胞生存力相对于药物浓度的数据计算IC _50。

结果

图1示出DOX的PA的合成方案。 DOX-PA用棕榈酸的偶联通过pH敏感腙键阿霉素合成。稍微过量的棕榈酸酰肼的使用，以促进该反应的完成。此反应方法具有非常高的效率，仅阿霉素的少量残留的18小时的反应（ 图2）之后。产率是大约88％。在反应结束时，DOX-PA用硅胶柱纯化，干燥，得到纯的红色固体产物。 DOX-PA用薄层色谱法，这表明对纯化的DOX的PA（ <...

讨论

在这项工作中，我们描述了微胶粒的制备的简单，快速的膜分散法。这种方法利用一个两亲性聚合物的自组装特性（ 如 DSPE-PEG）以形成在含水环境中的核-壳结构的胶束。此胶束制备方法具有几个优点。 1.它涉及一个简单配制方法，它避免了使用脂质体，纳米颗粒和纳米乳剂^。19 2的制备常用复杂小型化步骤（如挤出或均化）。它具有良好的重复性。一旦该制剂进行了优化，并建立?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DSPE-PEG2K	Cordenpharm	LP-R4-039	>95%
Doxorubicin	LC Laboratories	D-4000	>99%
Palmitic Acid Hydrazide	TCI AMERICA	P000425G	>98.0%
Methanol	ACROS Organics	610981000	Anhydrous
Methylene chloride	FISHER	D151-4	99.90%
Methyl sulfoxide-d6	ACROS Organics	AC320760075	NMR solvent
Trifluoroacetic Acid	ACROS Organics	AC293811000	99.50%
Silica Gel	FISHER	L-7446	230-400 mesh
BAKER FLEX TLC PLATES	FISHER	NC9990129
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells	ATCC	HTB-81
MTT	ACROS Organics	158990050	98%
RPMI 1640 Medium	MEDIATECH INC	10041CV
Antibiotic-Antimycotic	LIFE TECHNOLOGIES	15240062	100x stock solution
Fetal Bovine Serum	LIFE TECHNOLOGIES	10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy	Varian, Inc		300 NMR
Büchi R-3 Rotavapor	Buchi	1103022V1	Rotary evaporator
Ultrasonic Bath	BRANSON ULTRASONICS CORPORATION	CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3	Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90	Malvern Instruments		Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer	Rio-Rad	Benchmark Plus
Cell Culture Incubator	Napco	CO2 6000
Biological Safety Cabinet	Nuaire
SigmaPlot	Systat Software, Inc.		Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate	Becton Dickinson	353072
Trypsin  0.25%	Corning Cellgro	25-053-CI