Herstellung und Charakterisierung von Lipophile Doxorubicin Pro-drug Mizellen

Zusammenfassung

Ein Protokoll für die Herstellung und Charakterisierung von lipophilen Doxorubicin Prodrug geladen 1,2-Distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [Amino (Polyethylenglykol) -2000] (DSPE-PEG) Micellen beschrieben.

Zusammenfassung

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and ¹H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (¹H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

Einleitung

Chemotherapie wird häufig verwendet, um verschiedene Formen von Krebs zu behandeln. Die meisten, wenn nicht alle, chemotherapeutische Medikamente haben toxische Nebenwirkungen, die von handhabbaren minor Bedingungen, wie Übelkeit und Diarrhö, um mehr lebensbedrohlichen Zuständen variieren kann. Da die meisten Krebsmedikamente toxisch, nicht-selektive Belichtung dieser Medikamente zu normalem Gewebe sind verursacht unweigerlich Toxizität. Daher besteht ein großer Bedarf für einen therapeutischen Ansatz, der selektiv Drogen in Krebszellen liefern kann. Eine weitere Herausforderung bei der Verabreichung von Anti-Krebs-Medikamente ist ihre schlechte Wasserlöslichkeit. Üblicherweise werden Solubilisierungsmittel notwendig, um diese schlecht löslichen Arzneimitteln zu formulieren. Allerdings sind die meisten Lösungsvermittlern, wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Cremophor EL, und Polysorbat 80 (Tween 80) kann zu Leber- und Nierentoxizität, Hämolyse und akute Überempfindlichkeitsreaktionen und periphere Neuropathien. ¹ daher sicher und biokompatibel Formulierungen erforderlich sind für die klinische Verwendung von schlechtenly löslichen Krebsmedikamente. Nanocarriers sind vielversprechende Wirkstoffabgabesysteme für die oben genannten Herausforderungen. Diese Nanocarriern umfassen Liposomen, ² Nanopartikel, ³ Mizellen, ^4-7 Polymer-Wirkstoff - Konjugate, ⁸ und anorganischen Materialien. ⁹ Mehrere Nanoprodukte (zB Caelyx, Abraxane und Genexol) wurden von den Aufsichtsbehörden genehmigt worden , um Krebspatienten zu behandeln. ¹⁰

Polymere Mizellen sind vielversprechende nanoskalige Wirkstoffabgabeträger, die für die Abgabe von Antikrebsmitteln erfolgreich verwendet wurden. ^4-7,11,12 Typische polymere Mizellen werden aus amphiphilen Polymeren durch eine Selbstorganisation. Die Kern-Schale-strukturierte polymere Mizellen umfassen eine hydrophile Schale und einen hydrophoben Kern. Die hydrophile Schale kann sterisch Mizellen stabilisieren und ihre Zirkulation im Blutstrom zu verlängern. Der hydrophobe Kern kann wirksam hydrophob d einzukapselnTeppiche. Aufgrund der geringen Größe der Mizellen (typischerweise weniger als 200 nm) und Langzirkulationseigenschaften werden polymere Mizellen angenommen Tumor-Targeting durch erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Effekte (passive Tumor Targeting) zu erreichen.

Wirkstoffbeladung Stabilität ist für den Tumor kritische Fähigkeit von Mizellen Targeting. Um eine optimale Tumor-Targeting zu erreichen, sollte Mizellen minimale Medikamenten Leckage haben, bevor die Tumorstelle zu erreichen, noch kurz die Droge nach Krebszellen gelangt. Zusätzlich ist Formulierungsstabilität auch eine wesentliche Voraussetzung für die Produktentwicklung, weil Formulierungsstabilität, die Durchführbarkeit der Produktentwicklung bestimmt, sowie die Haltbarkeit der entwickelten Produkte. Kürzlich wurde viel Anstrengung unternommen, die Belastung von Medikamenten in Lieferträger zu verbessern. Die lipophile Prodrug - Ansatz ist eine Strategie , die erforscht wurde Wirkstoffbeladung in Lipid - Nanopartikel und Emulsionen zu verbessern. ^13,14 Die Konjugation von Lipiden mit Medikamenten deutlich ihre Lipophilie verbessern und in den lipophilen Komponenten von Nanocarriern Laden und Retention zu verbessern.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung von lipophilen Doxorubicin Prodrug geladenen Mizellen. Zunächst wird die Syntheseprozedur lipophilen Prodrug für Doxorubicin beschrieben. Dann wird ein Protokoll für die Mizellen mit einem filmDispersionsVerfahren Erzeugen eingeführt. Diese Methode wurde in unseren früheren Studien. ⁵ DSPE-PEG wurde ausgewählt als Trägermaterial zur Herstellung von Micellen , weil es wurde für Micelle Arzneimittelabgabe erfolgreich eingesetzt erfolgreich eingesetzt. ^15,16 Schließlich wir Micelle mehrere in vitro - Assays zur Charakterisierung beschreiben Formulierungen und Anti-Krebs-Aktivität zu bewerten.

Protokoll

1. Synthese von DOX-PA

1. Wiegen 390 mg Doxorubicin und 243 mg Palmitinsäure Hydrazid, und in einen Rundkolben gegeben.
2. Zugabe von 150 ml wasserfreiem Methanol in den Kolben mit einer Glasspritze. In 39 ul Trifluoressigsäure (TFA) mit einer Pipette. Verwendung eines magnetischen Rührers, rühre das Reaktionsgemisch 18 h bei RT im Dunkeln.
   HINWEIS: Die Mengen an Reaktionsmaterialien skaliert werden können oder nach unten unterschiedlichen Mengen von DOX-PA zu erhalten. Das Verhältnis der Reaktanten sollte in den gleichen Proportionen eingehalten werden. Reaktionen unter Verwendung von DOX Mengen im Bereich von 78 mg bis 1.170 mg in einem regelmäßigen Chemielabor durchgeführt werden.
3. Reinigung von DOX-PA eine Kieselgelsäule mit. ¹⁷
   1. Entferne das Lösungsmittel in dem Reaktionsgemisch mit einem Rotationsverdampfer. Werden 3 g Kieselgel, nachdem das Volumen des Gemisches auf etwa 20 ml reduziert. Weiter Rotationsverdampfen trockene Pulver zu ergeben, und t zu ermöglichener Adsorption von Produkten auf das Silicagel. Halten der Probe unter einem Vakuum für weitere 30 min, nachdem die Trockenpulver gebildet werden.
   2. Pack 50 g Kieselgel in einer Kolonne von Dichlormethan als Lösungsmittel verwendet wird. Vorsichtig die Kieselgel-Probe adsorbierte Produkt an die Säule enthält.
   3. Eluieren der Säule mit einem Gemisch aus Dichlormethan und Methanol, wobei nach und nach den Anteil an Methanol zu, wodurch Lösungsmittelpolarität zunehmende (Tabelle 1).
   4. Sammle Fraktionen des Eluenten in Teströhrchen (25 ml / Röhrchen) und den Fortschritt durch Dünnschichtchromatographie (TLC).
   5. Kombinieren Sie alle Fraktionen, die reine DOX-PA und entferne das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer bis trockenes Pulver gebildet wird. Trocknen das Produkt weiter unter Vakuum O / N.
4. Analyse von DOX-PA durch TLC.
   1. Schneiden Sie ein 4 cm x 8 cm langen Abschnitt der DC-Platte. Spot-Probenlösungen 0,5 cm von der Unterseite der Platte mit TLC Spek Kapillaren unter Verwendung erfülltHANOL als Lösungsmittel.
   2. Platzieren Sie die DC-Platte in eine Entwicklungskammer mit einer Mischung aus Dichlormethan und Methanol, das (3/1, v / v). Die Tiefe der Lösungsmittel sollte als 0,5 cm nur weniger.
   3. Entfernen Sie die Platte aus der Entwicklerkammer, wenn die Lösungsmittelfront die Oberseite der Platte erreicht. Markieren Sie die Stelle des Lösungsmittelfront mit einem Bleistift und lassen Sie die Platte zu trocknen. Legen Sie die DC-Platte in eine Färbungskammer gesättigt Joddampfes enthält, um Proben zu visualisieren.
5. Analyse von DOX-PA mit ¹ H-Kernresonanzspektroskopie ⁽¹ H-NMR). ¹⁸
   1. Man löst 15 mg des DOX-PA in 1 ml Methylsulfoxid-d 6 (DMSO) und Übertragung der Probe in ein NMR-Röhrchen.
   2. Legen Sie die NMR-Röhrchen in den Magneten des NMR-Instrument. Messung der Protonenspektrum, Auswählen DMSO als Lösungsmittel. Entfernen Sie das NMR-Röhrchen von dem Magneten. Analysieren Sie den NMR - Ergebnis ^18.

2. Herstellung von DOX-PA Mizellen durch Film-Dispersionsverfahren

1. Auflösen DSPE-PEG (40 mg) und DOX-PA (4 mg) mit 2 ml Methanol in einem 10 ml Glasfläschchen.
2. Entfernen des organischen Lösungsmittels im Vakuum am Rotationsverdampfer, bis sich ein dünner Film bildet sich in der Phiole verwendet.
   HINWEIS: Alternativ verdampfen die organischen Lösungsmittel unter Inertgas (zB Argon oder Stickstoffgas) einen Film zu bilden und das Fläschchen in einem Vakuumexsikkator halten , um weitere Lösungsmittelreste zu entfernen.
3. Transfer 2 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,4, DPBS) auf dem Glasfläschchen.
4. Legen Sie das Fläschchen in einem Ultraschallbad für 3 min bei RT zu Mizellen erzeugen.
   HINWEIS: Die Ultraschall-Leistung variiert zwischen den verschiedenen Modellen von Ultraschallbädern. Wählen Sie eine Einheit, die genügend Ultraschallleistung erzeugen kann, die dünne Polymer / Arzneimittel-Film zu zerstreuen. Die Ausgangsleistung des Ultraschallbades in diesem Protokoll verwendet ist 110 W.
5. Halten Mizellen bei 4 ° C für die kurzzeitige Lagerung und -20 ° C für lange-term Lagerung.
   HINWEIS: Alternativ können Mizellen auch gefriergetrocknet und vor Gebrauch mit Wasser rekonstituiert. Normalerweise kein Gefrierschutzmittel oder Lyoschutzmittel wird für diese Formulierung erforderlich.

3. Charakterisierung der DOX-PA Mizellen

1. Bestimmung der DOX-PA - Konzentration in Mizellen und Drogen Verkapselungswirksamkeit
   1. Auflösen DOX-PA in vorherigen Schritten in DMSO synthetisiert DOX-PA-Lösungen von fünf verschiedenen Konzentrationen herzustellen: 1 & mgr; g / ml, 5 ug / ml, 20 ug / ml, 50 ug / ml und 100 & mgr; g / ml. Messen der Absorption von DOX-PA-Lösungen mit einem UV-VIS-Spektrometer bei 490 nm. Generieren Sie eine Standardkurve auf der Basis der DOX-PA Wirkstoffkonzentrationen und deren bei 490 nm entsprechenden Absorption.
   2. Verdünne 25 & mgr; l von mit Wirkstoff beladenen Mizelle mit 500 ul DMSO. Messen Sie die Absorption bei 490 nm mit einem UV-VIS-Spektrometer. Berechnen Wirkstoffkonzentrationen mit der Standardkurve in 3.1.1 erzeugt.
   3. Berechnen Verkapselungseffizienz Verwendung der folgenden Gleichung:
      Drug Umhüllungs-Effektivität (%) = (Menge an Arzneimittel in Mizellen) / (Menge an zugesetztem drug) × 100%
2. Charakterisierung von Partikelgröße mit dynamischer Lichtstreuung (DLS)
   1. Verdünnte Mizellen mit DPBS (pH 7,4) auf eine endgültige DSPE-PEG-Konzentration von 1 mg / ml. Analysieren eine 2 ml Probe mit einem Teilchengrßenanalysator das Z-gemittelte Größe und Polydispersitätsindex (PDI) zu erhalten.
3. Bewertung der in - vitro - Aktivität gegen Krebs
   HINWEIS: Verwenden Sie geeignete sterile Technik und in einem Biosicherheitsschrank bedienen.
   1. Entfernen des Zellkulturmediums aus einer Zellkulturflasche (beispielsweise T25) enthält , DU-145 menschlichen Prostatakrebszellen und spülen Sie die Zellen mit 2 ml DPBS (pH 7,4).
   2. Aspirat DPBS, 1 ml Trypsin-Lösung (0,25%) und bei 37 ° C für 2 min inkubiert, um die Zellen abzulösen.
   3. In 10 ml Zellkulturmedium (RPMI 1640 + 10% fötales Rinderserum + 1% Antibiotic-Antimykotische), wenn die meisten der Zellen aus dem Kolben abgelöst werden. Transfer-Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere die Zellen bei 1.000 × g für 5 min.
   4. Resuspendieren des Zellpellets mit 5 ml Kulturmedium Zelle und Entfernen mit einem Hämozytometer eine Probe Zellzahlen zum Zählen. Verdünne die Zellen mit Zellkulturmedium bis zu einer Dichte von 50.000 Zellen / ml. Fügen Sie die verdünnten Zellsuspensionen in einer 96-Well-Zellkulturplatte (100 & mgr; l / Well). Inkubieren der Zellen in einem Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO ₂₎ für 18 h Zellanheftung zu ermöglichen.
   5. Verdünnte DOX Dimethylsulfoxid (DMSO) -Lösung und DOX-PA DMSO Lösung mit Zellkulturmedium bis zur endgültigen Arzneimittelkonzentrationen von 0,1 & mgr; M zu erhalten, 0,5 uM, 2 uM, 5 uM und 10 uM, respectively. Halten DMSO-Endkonzentration in allen obigen Proben auf 0,5%. Verdünnte DOX-PA Mizellen mit Zellkulturmedium endgültige Arzneimittel co zu erhaltenncentrations von 0,1 uM, 0,5 uM, 2 uM, 5 uM und 10 uM, respectively. Verwenden Sie die leere Zellkulturmedium, das eine Kontrolle.
   6. Entfernen Sie die 96-Well-Zellkulturplatte aus dem Inkubator und ersetzen Sie die Zellkulturmedium mit 100 ul Medium unterschiedliche Behandlungsmittel enthalten, hergestellt in Schritt 3.3.5 (n = 4 für jede Gruppe). Inkubieren der Zellen in der Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO ₂₎ für eine weitere 72 hr.
   7. Anzusaugen, das Medium und füge 100 ul Medium, enthaltend 0,5 mg / ml 3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2,5-diphenyl Tetrazolium Bromid (MTT).
   8. Inkubieren der Zellen in der Zellkultur-Inkubator für weitere 2 Stunden. Sie vorsichtig das Medium zu entfernen und 100 ul DMSO hinzufügen Formazankristallen aufzulösen.
   9. Messung der Extinktion mit dem Mikroplatten-Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 570 nm und einer Referenzwellenlänge von 670 nm.
   10. Berechnen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung der folgenden Gleichung:
       Zell Viability (%) = (A _Test / A - _Steuerung) × 100%
       HINWEIS: Vergleichen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen zwischen den verschiedenen Gruppen unter Verwendung einer Einwegvarianzanalyse (ANOVA) statistischer Test. Berechnen Sie die IC ₅₀ basierend auf die Lebensfähigkeit der Zellen gegen die Arzneimittelkonzentration Daten.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt das Syntheseschema von DOX-PA. DOX-PA wurde durch Konjugation von Palmitinsäure synthetisiert mit Doxorubicin über eine pH-sensitive Hydrazonbindung. Ein geringer Überschuß an Palmitinsäure Hydrazid wurde verwendet, um die Vervollständigung der Reaktion zu erleichtern. Dieses Reaktionsverfahren hat einen sehr hohen Wirkungsgrad und nur eine geringe Menge von Doxorubicin blieb nach 18 h Reaktion (Abbildung 2). Die Ausbeute betrug e...

Diskussion

In dieser Arbeit beschreiben wir eine unkomplizierte, schnelle Filmdispersionsverfahren zur Herstellung von Mizellen. Dieses Verfahren nutzt die Selbstorganisation eines amphiphilen Polymers (zB DSPE-PEG) Kern-Schale - strukturierten Mizellen in einer wässrigen Umgebung zu bilden. Diese Mizellen Herstellungsverfahren hat mehrere Vorteile. 1. Es handelt sich eine einfache Formulierungsverfahren, die die Verwendung von komplizierten Zerkleinerungsschritten (wie Extrusion oder Homogenisierung) vermeidet üblicher...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DSPE-PEG2K	Cordenpharm	LP-R4-039	>95%
Doxorubicin	LC Laboratories	D-4000	>99%
Palmitic Acid Hydrazide	TCI AMERICA	P000425G	>98.0%
Methanol	ACROS Organics	610981000	Anhydrous
Methylene chloride	FISHER	D151-4	99.90%
Methyl sulfoxide-d6	ACROS Organics	AC320760075	NMR solvent
Trifluoroacetic Acid	ACROS Organics	AC293811000	99.50%
Silica Gel	FISHER	L-7446	230-400 mesh
BAKER FLEX TLC PLATES	FISHER	NC9990129
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells	ATCC	HTB-81
MTT	ACROS Organics	158990050	98%
RPMI 1640 Medium	MEDIATECH INC	10041CV
Antibiotic-Antimycotic	LIFE TECHNOLOGIES	15240062	100x stock solution
Fetal Bovine Serum	LIFE TECHNOLOGIES	10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy	Varian, Inc		300 NMR
Büchi R-3 Rotavapor	Buchi	1103022V1	Rotary evaporator
Ultrasonic Bath	BRANSON ULTRASONICS CORPORATION	CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3	Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90	Malvern Instruments		Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer	Rio-Rad	Benchmark Plus
Cell Culture Incubator	Napco	CO2 6000
Biological Safety Cabinet	Nuaire
SigmaPlot	Systat Software, Inc.		Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate	Becton Dickinson	353072
Trypsin  0.25%	Corning Cellgro	25-053-CI