АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол для подготовки и определения характеристик липофильный доксорубицина пролекарства загружен 1,2-distearoyl- зп глицеро-3-phosphoethanolamine- N - [амино (полиэтиленгликоль) -2000] (DSPE-PEG) мицеллы описывается.

Аннотация

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

Введение

Химиотерапия обычно используется для лечения различных форм рака. Большинство, если не все, химиотерапевтические препараты имеют токсические побочные эффекты, которые могут отличаться от управляемых второстепенных условий, таких как тошнота и диарея, более жизненных условий, угрожающих. Поскольку большинство противоопухолевые препараты токсичны, неселективные воздействие этих препаратов в нормальной ткани неизбежно вызывает токсичность. Таким образом, существует большая потребность в терапевтическом подходе, который может избирательно доставлять лекарства в раковые клетки. Еще одна проблема, с введением противоопухолевых препаратов является их плохая растворимость в воде. Как правило, солюбилизирующие агенты необходимы для разработки таких плохо растворимых лекарств. Тем не менее, большинство солюбилизирующие агенты, такие как диметилсульфоксид (ДМСО), Cremophor EL, и полисорбат 80 (твин 80) может вызывать повреждение печени и токсичность почек, гемолизу, острые реакции гиперчувствительности и периферические невропатии. 1 Таким образом, безопасную и биологически совместимую составы необходимы для клиническое использование бедныхLY растворимые противоопухолевые препараты. Наноносителей перспективны системы доставки лекарственных средств для решения вышеуказанных проблем. Эти наноносителей включают липосомы, 2 наночастицы, 3 мицеллы, 4-7 конъюгатов полимер-наркотиков, 8 и неорганические материалы. 9 Несколько Наномедицина продуктов (например, Doxil, Abraxane и Genexol) были одобрены регулирующими органами для лечения онкологических больных. 10

Полимерные мицеллы являются перспективными нано-носителей для доставки лекарств, которые были успешно использованы для доставки противоопухолевых препаратов. 4-7,11,12 Типичные полимерные мицеллы получают из амфифильных полимеров с помощью процесса самосборки. Ядро-оболочка структурированные полимерные мицеллы включают гидрофильную оболочку и гидрофобную сердцевину. Гидрофильная оболочка может стерически стабилизировать мицеллы и продлить срок их циркуляции в кровотоке. Гидрофобным ядро ​​может эффективно герметизировать гидрофобный дковрики. Из-за небольшого размера мицелл (обычно менее 200 нм) и свойства долгосрочной циркуляции, полимерные мицеллы, как полагают, для достижения опухолью ориентации посредством повышенной проницаемости и удерживания (EPR) эффекты (пассивный опухоль ориентации).

стабильность загрузки лекарственного средства имеет решающее значение для опухоли таргетирования способность мицеллы. Для достижения оптимальной адресности опухоли, мицеллы должны иметь минимальную утечку наркотиков до достижения место локализации опухоли, но быстро высвобождать лекарственное средство после введения раковых клеток. Кроме того, стабильность состава также является важным требованием для разработки продукта, так как стабильность состава определяет целесообразность разработки продукта, а также срок годности разработанных продуктов. В последнее время много усилий было сделано, чтобы улучшить загрузку препаратов в носителей доставки. Липофильная подход пролекарством является стратегия , которая была изучена , чтобы улучшить загрузку лекарственного средства в наночастицы липидов и эмульсий. 13,14 Призываниеugation липидов с наркотиками может значительно улучшить их липофильности и повысить загрузку и сохранение в липофильных компонентов наноносителей.

Здесь мы опишем протокол для подготовки липофильный доксорубицин пролекарственных нагруженные мицеллы. Во-первых, процедура синтеза доксорубицина липофильный пролекарства описан. Затем, протокол для генерации мицеллы с методом пленочного дисперсии вводится. Этот метод был успешно использован в наших предыдущих исследованиях. 5 DSPE-PEG был выбран в качестве материала - носителя для получения мицеллы , потому что он был успешно использован для доставки мицеллы наркотиков. 15,16 Наконец, мы опишем несколько анализов в пробирке , используемые для характеристики мицеллы препараты и оценить противоопухолевую активность.

протокол

1. Синтез DOX-PA

  1. Взвешивают 390 мг доксорубицина и 243 мг пальмитиновой кислоты гидразида, и переносят в круглодонную колбу.
  2. Добавить 150 мл безводного метанола в колбу с помощью стеклянного шприца. Добавьте 39 мкл трифторуксусной кислоты (ТФУ) с помощью пипетки. С помощью магнитной мешалки, перемешивают реакционную смесь в течение 18 ч при комнатной температуре в темноте.
    Примечание: количество реакционных материалов можно масштабировать вверх или вниз , чтобы получить различные количества DOX-PA. Соотношение реагентов должно поддерживаться в тех же пропорциях. Реакции с использованием DOX количествах в диапазоне от 78 мг до 1170 мг может быть выполнена в обычной лаборатории химии.
  3. Очистка DOX-PA с использованием колонки с силикагелем. 17
    1. Растворитель удаляют в реакционной смеси с помощью роторного испарителя. Добавьте 3 г силикагеля после того, как объем смеси снижается примерно до 20 мл. Продолжайте в роторном испарителе с получением сухих порошков и, чтобы позволить Tон адсорбцией продуктов на силикагель. Хранить образец под вакуумом в течение еще 30 мин, после образования сухих порошков.
    2. Упаковка 50 г силикагеля в колонке с использованием дихлорметана в качестве растворителя. Осторожно добавьте пробу силикагель, содержащий адсорбированный продукт в колонну.
    3. Элюируют колонку смесью дихлорметана и метанола, при этом постепенно увеличивая долю метанола, таким образом увеличивая полярности растворителя (таблица 1).
    4. Собирают фракции элюента в пробирках (25 мл / пробирку) и контролировать ход с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ).
    5. Смешайте все фракции, содержащие чистые DOX-PA и растворитель удаляют с помощью роторного испарителя, пока сухой порошок не образуется. Далее высушить продукт под вакуумом O / N.
  4. Анализ DOX-PA с помощью ТСХ.
    1. Вырезать 4 см х 8 см сечение ТСХ пластины. Точечные растворы проб на 0,5 см от нижней части пластины с TLC пятнистость капиллярами с использованием встретилисьhanol в качестве растворителя.
    2. Поместите пластину дл тонкослойной хроматографии в развивающейся камеру, содержащую смесь дихлорметана и метанола (3/1, об / об). Глубина растворителя должна быть чуть менее 0,5 см.
    3. Удалите пластину из проявляющего камеры, когда передний растворитель достигает верхней части пластины. Отметьте расположение фронта растворителя с карандашом и дайте пластины высохнуть. Поместите пластину дл тонкослойной хроматографии в окрашивающего камеру, содержащую насыщенный пар йода, для того, чтобы визуализировать образцы.
  5. Анализ DOX-PA с 1 Н-спектроскопии ядерного магнитного резонанса (1Н-ЯМР). 18
    1. Растворите 15 мг DOX-PA в 1 мл метилсульфоксид-d6 (DMSO) и переноса образца в ЯМР пробирку.
    2. Вставьте трубку ЯМР в магнит прибора ЯМР. Измерение спектра протонов, выбирая ДМСО в качестве растворителя. Извлеките трубку ЯМР от магнита. Анализ ЯМР результат 18.

2, Получение DOX-PA мицелл по методу пленочным дисперсии

  1. Растворите DspE-ПЭГ (40 мг) и DOX-PA (4 мг) с 2 мл метанола в стеклянную пробирку емкостью 10 мл.
  2. Удаления органического растворителя под вакуумом не используя роторный испаритель, до тех пор тонкой пленки формы во флаконе.
    Примечание: В качестве альтернативы, испаряются органические растворители , в атмосфере инертного газа (например, газ аргон или азот) для образования пленки и держать флакон в вакуум - сушилке для дальнейшего удаления остаточного растворителя.
  3. Передача 2 мл фосфатно-буферного раствора Дульбекко (рН 7,4, DPBS) в стеклянный флакон.
  4. Помещают пробирку в ультразвуковой ванне в течение 3 мин при комнатной температуре, чтобы генерировать мицеллы.
    Примечание: Ультразвуковая мощность варьируется в зависимости от различных моделей ультразвуковых ванн. Выберите устройство, которое может генерировать достаточно мощности ультразвука, чтобы рассеять тонкую пленку полимера / лекарственного средства. Выходная мощность ультразвуковой ванне, используемой в данном протоколе является 110 Вт
  5. Держите мицеллы при 4 ° С для кратковременного хранения и -20 ° С в течение долго-term хранения.
    Примечание: В качестве альтернативы, мицеллы могут быть также сублимационной сушке и разводить водой перед использованием. Как правило, ни одна криопротектора или lyoprotectant не требуется для данной композиции.

3. Характеристика DOX-PA мицелл

  1. Определение концентрации DOX-PA в мицеллы и эффективности инкапсулирования лекарственного средства
    1. Растворите DOX-PA синтезируют в предыдущих шагах в ДМСО для приготовления растворов DOX-PA пяти различных концентрациях: 1 мкг / мл, 5 мкг / мл, 20 мкг / мл, 50 мкг / мл и 100 мкг / мл. Измеряют поглощение растворов DOX-PA с UV-VIS-спектрометра при 490 нм. Генерирование стандартную кривую, основанную на концентрации препарата DOX-PA, и соответствующее поглощение при длине волны 490 нм.
    2. Развести 25 мкл мицеллы лекарственной загруженным с 500 мкл ДМСО. Измеряют поглощение при 490 нм с помощью UV-VIS-спектрометром. Расчет концентраций лекарственного средства со стандартной кривой, полученной в 3.1.1.
    3. Рассчитать эффективность инкапсуляции с использованием следующего уравнения:
      Инкапсуляция Drug Эффективность (%) = (количество лекарственных средств в мицеллах) / (количество добавленного лекарственного средства) × 100%
  2. Характеристика размера частиц с динамического рассеяния света (DLS)
    1. Развести мицеллы с DPBS (рН 7,4) до конечной концентрации DSPE-PEG 1 мг / мл. Анализа образца 2 мл с помощью анализатора размера частиц, чтобы получить размер и индекс полидисперсности Z-средней (PDI).
  3. Оценка в пробирке противоопухолевой активности
    Примечание: Используйте соответствующую стерильную технику и работать внутри шкафа биологической безопасности.
    1. Удалить среду для культивирования клеток из клеточной культуральной колбе (например, T25) , содержащие DU-145 клеток рака предстательной железы человека и прополоскать клетки с 2 мл ДЗФР (рН 7,4).
    2. Отберите DPBS, добавляют 1 мл раствора трипсина (0,25%), и инкубируют в течение 2 мин при 37 ° С для отделения клеток.
    3. Добавьте 10 мл клеточной культуральной среды (RPMI 1640 + 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% Антибиотик-антимикотическими), когда большинство клеток отделяются от колбы. Передача клеток в 15-мл центрифужную пробирку и центрифугировать клетки при 1000 х г в течение 5 мин.
    4. Повторное приостановить осадок клеток с помощью 5 мл культуральной среды клеток и удалить образец для подсчета числа клеток с помощью гемоцитометра. Развести клеток с клеточной культуральной среде до плотности 50000 клеток / мл. Добавляют разбавленный-клеточные суспензии в 96-луночный культуральный планшет (100 мкл / лунку). Инкубируйте клетки в культуре клеток инкубатор (37 ° С, 5% СО 2) в течение 18 часов , чтобы позволить прикрепление клеток.
    5. Развести DOX раствор диметилсульфоксида (ДМСО) и раствор DOX-PA ДМСО с клеточной культуральной среды для получения необходимой концентрации препарата 0,1 мкМ, 0,5 мкМ, 2 мкМ, 5 мкМ и 10 мкМ, соответственно. Хранить Конечная концентрация ДМСО при всех указанных выше образцов до 0,5%. Развести DOX-PA мицеллы с клеточной культуральной среды для получения окончательного совместное наркотиковncentrations 0,1 мкМ, 0,5 мкМ, 2 мкМ, 5 мкМ и 10 мкМ, соответственно. Используйте пустые среда для культивирования клеток контроля.
    6. Удалите 96-луночный культуральный планшет из инкубатора и замените среду для культивирования клеток с 100 мкл среды, содержащей различные агенты дл обработки, приготовленный на стадии 3.3.5 (п = 4 для каждой группы). Инкубируйте клетки в культуре клеток инкубатор (37 ° C, 5% CO 2) в течение еще ​​72 ч.
    7. Аспирируйте среду и добавляют по 100 мкл среды, содержащей 0,5 мг / мл 3- (4,5-диметил-тиазол-2-ил) -2,5-дифенил-тетразолия бромид (МТТ).
    8. Инкубируйте клетки в культуре клеток инкубаторе в течение еще 2 ч. Осторожно удалите среду и добавьте 100 мкл ДМСО для растворения кристаллов формазана.
    9. Измерить оптическую плотность с микропланшетов спектрофотометре при длине волны 570 нм и длине волны 670 нм.
    10. Рассчитывают жизнеспособность клеток с использованием следующего уравнения:
      Жизнеспособность клеток (%) = (тест / контроль) × 100%
      Примечание: сравнение жизнеспособности клеток между различными группами с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) статистического теста на. Расчет IC 50 на основе жизнеспособности клеток в сравнении данных о концентрации лекарственного средства.

Результаты

На рисунке 1 показана схема синтеза из DOX-PA. DOX-PA синтезируют путем конъюгации пальмитиновой кислоты с доксорубицином через рН-чувствительный гидразонной связью. Небольшой избыток гидразида пальмитиновой кислоты был использован для содействия завершению ре?...

Обсуждение

В этой работе мы описываем несложный, быстрый метод пленочного дисперсии для получения мицелл. Этот метод использует свойства самосборка амфифильного полимера (например, DSPE-ПЭГ) с образованием ядро-оболочка структурированных мицеллы в водной среде. Этот метод мицеллярный препар?...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DSPE-PEG2KCordenpharmLP-R4-039>95%
DoxorubicinLC LaboratoriesD-4000>99%
Palmitic Acid HydrazideTCI AMERICA  P000425G>98.0%
MethanolACROS Organics610981000Anhydrous
Methylene chloride FISHER D151-499.90%
Methyl sulfoxide-d6ACROS OrganicsAC320760075NMR solvent
Trifluoroacetic Acid ACROS OrganicsAC29381100099.50%
Silica GelFISHER L-7446230-400 mesh
BAKER FLEX TLC PLATES FISHER NC9990129
DPBSSigma-AldrichD8537
DU 145  Prostate Cancer CellsATCCHTB-81
MTTACROS Organics15899005098%
RPMI 1640 MediumMEDIATECH INC 10041CV
Antibiotic-Antimycotic LIFE TECHNOLOGIES 15240062100x stock solution
Fetal Bovine SerumLIFE TECHNOLOGIES 10437077
Nuclear Magnetic Resonance SpectroscopyVarian, Inc300 NMR 
Büchi R-3 RotavaporBuchi1103022V1 Rotary evaporator
Ultrasonic BathBRANSON ULTRASONICS CORPORATION CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90 Malvern InstrumentsParticle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer Rio-RadBenchmark Plus 
Cell Culture IncubatorNapcoCO2 6000
Biological Safety CabinetNuaire
SigmaPlot Systat Software, Inc.Analytical Software
96-Well Cell Culture PlateBecton Dickinson353072
Trypsin  0.25%Corning Cellgro25-053-CI

Ссылки

  1. Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle?. ESMO. 17 (5), 735-749 (2006).
  2. Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6 (6), 1085-1100 (2011).
  3. Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9 (55), (2011).
  4. Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd, ., D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26 (9), 2081-2092 (2009).
  5. Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11 (10), 2610-2620 (2010).
  6. Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1 (6), 9 (2011).
  7. Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143 (1), 151-158 (2010).
  8. Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54 (2), 223-233 (1998).
  9. Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7 (1), 111-120 (2012).
  10. Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
  11. Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48 (2), 101-111 (1999).
  12. Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11 (8), 2600-2611 (2014).
  13. Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334 (2), 253-262 (2013).
  14. Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86 (1), 93-100 (2003).
  15. Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164 (1), 95-102 (2012).
  16. Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46 (1-2), 67-71 (2012).
  17. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).
  18. Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
  19. Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87 (1-3), 33-47 (2003).
  20. Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13 (9), 11681-11693 (2012).
  21. Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11 (8), 2094-2102 (2010).
  22. Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8 (1), 20-36 (2012).
  23. Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

114Pro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены