Preparazione e caratterizzazione di lipofila doxorubicina micelle pro-farmaco

Riepilogo

Un protocollo per la preparazione e caratterizzazione di lipofila doxorubicina pro-farmaco caricata 1,2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polietilene glicole) -2000] (DSPE-PEG) micelle è descritto.

Abstract

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and ¹H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (¹H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

Introduzione

La chemioterapia è comunemente usato per trattare varie forme di cancro. La maggior parte, se non tutti, i farmaci chemioterapici hanno effetti collaterali tossici che possono variare da condizioni minori gestibili, come nausea e diarrea, a condizioni che minacciano la vita più. Poiché la maggior parte farmaci antitumorali sono tossici, l'esposizione non selettivo di questi farmaci al tessuto normale provoca inevitabilmente la tossicità. Pertanto, vi è una grande necessità di un approccio terapeutico che può trasportare selettivamente farmaci nelle cellule tumorali. Un'altra sfida con la somministrazione di farmaci antitumorali è la loro scarsa solubilità in acqua. Di solito, sono necessari agenti solubilizzanti per formulare questi farmaci scarsamente solubili. Tuttavia, la maggior parte agenti solubilizzanti, come dimetil solfossido (DMSO), Cremophor EL, e polisorbato 80 (Tween 80) possono causare tossicità epatica e renale, emolisi, reazioni di ipersensibilità acuta e neuropatie periferiche. ¹ Perciò, formulazioni sicure e biocompatibili sono necessari per l'uso clinico di poverifarmaci antitumorali mente solubili. Nanovettori sono promettenti sistemi di drug delivery per affrontare le sfide di cui sopra. Questi nanovettori includono liposomi, nanoparticelle ^{2, 3} micelle, ^4-7 coniugati polimero-farmaco, ⁸ e materiali inorganici. ⁹ Diversi prodotti nanomedicina (ad esempio, Doxil, Abraxane, e Genexol) sono stati approvati dalle agenzie di regolamentazione per il trattamento di pazienti affetti da cancro. ¹⁰

Micelle polimeriche sono promettenti vettori di consegna di droga nano-scala, che sono stati utilizzati con successo per la consegna dei farmaci antitumorali. ^4-7,11,12 tipici micelle polimeriche sono preparati da polimeri anfifilici attraverso un processo di auto-assemblaggio. Il core-shell strutturati micelle polimeriche includono un guscio idrofilo e un nucleo idrofobico. Il guscio idrofilo può stabilizzare stericamente micelle e prolungare la loro circolazione nel flusso sanguigno. Il nucleo idrofobico può incapsulare in modo efficace idrofoba dtappeti. A causa delle piccole dimensioni delle micelle (tipicamente inferiori a 200 nm) e proprietà di lunga circolazione, micelle polimeriche sono creduti per conseguire targeting tumorale attraverso una maggiore permeabilità ed effetti di ritenzione (EPR) (tumore passiva targeting).

la stabilità della droga di carico è fondamentale per il tumore mira capacità di micelle. Per ottenere il targeting tumorale ottimale, micelle dovrebbero avere perdite di droga minimo prima di raggiungere il sito del tumore, ma rilasciare rapidamente il farmaco dopo aver inserito le cellule tumorali. Inoltre, la stabilità formulazione è anche un requisito essenziale per lo sviluppo dei prodotti, perché la stabilità formulazione determina la fattibilità di sviluppo del prodotto, così come la shelf-life di prodotti sviluppati. Recentemente, sono stati fatti molti sforzi per migliorare il carico di droga in vettori di consegna. Il lipofila approccio pro-farmaco è una strategia che è stata esplorata per migliorare carico di droga in nanoparticelle lipidiche ed emulsioni. ^13,14 La conjugation dei lipidi con farmaci in grado di migliorare significativamente la loro lipofilia e migliorare il carico e la conservazione delle componenti lipofile di nanovettori.

Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di lipofila doxorubicina pro-farmaco micelle caricati. In primo luogo, la procedura di sintesi per doxorubicina lipofila pro-farmaco è descritta. Poi, viene introdotto un protocollo per la generazione di micelle con un metodo film dispersione. Questo metodo è stato utilizzato con successo nei nostri studi precedenti. ⁵ DSPE-PEG è stato scelto come materiale di supporto per la preparazione di micelle perché è stato usato con successo per la consegna micelle farmaco. ^15,16 Infine, si descrivono diversi saggi in vitro utilizzati per caratterizzare micelle formulazioni e per valutare l'attività antitumorale.

Protocollo

1. Sintesi di DOX-PA

1. Pesare 390 mg di doxorubicina e 243 mg di acido palmitico idrazide, e versare in un pallone a fondo tondo.
2. Aggiungere 150 ml di metanolo anidro al pallone con una siringa di vetro. Aggiungere 39 ml di acido trifluoroacetico (TFA) con una pipetta. Utilizzando un agitatore magnetico, agitare la miscela di reazione per 18 ore a RT al buio.
   NOTA: Le quantità di materiali di reazione possono essere scalati verso l'alto o verso il basso per ottenere diverse quantità di DOX-PA. Il rapporto dei reagenti dovrebbe essere mantenuto nelle stesse proporzioni. Reazioni che utilizzano quantitativi DOX nell'intervallo 78 mg a 1.170 mg possono essere eseguite in un laboratorio chimico regolare.
3. Purificazione di DOX-PA usando una colonna di gel di silice. ¹⁷
   1. Rimuovere il solvente nella miscela di reazione con un evaporatore rotante. Aggiungere 3 g di gel di silice dopo il volume della miscela si riduce a circa 20 ml. Continuare evaporatore ruotante per produrre polveri secche e permettere tegli adsorbimento di prodotti sul gel di silice. Mantenere il campione sotto vuoto per altri 30 minuti dopo si formano le polveri secche.
   2. Confezione 50 g di gel di silice in una colonna diclorometano come solvente. Aggiungere con cautela il campione di gel di silice contenente prodotto adsorbito alla colonna.
   3. Eluire la colonna con una miscela di diclorometano e metanolo, aumentando gradualmente la percentuale di metanolo, aumentando così la polarità del solvente (Tabella 1).
   4. Raccogliere frazioni di eluente in provette (25 ml / tubo) e monitorare i progressi mediante cromatografia su strato sottile (TLC).
   5. Combinare tutte le frazioni contenenti puro DOX-PA e rimuovere il solvente usando un evaporatore rotante fino alla formazione di polvere secca. Ulteriori essiccare il prodotto sotto vuoto O / N.
4. Analisi di DOX-PA da TLC.
   1. Tagliare una sezione di quattro centimetri x 8 cm della piastra TLC. soluzioni campione Spot 0,5 cm dal fondo del piatto con TLC capillari avvistamento utilizzando soddisfatteHANOL come solvente.
   2. Porre la piastra TLC in una camera di sviluppo contenente una miscela di diclorometano e metanolo (3/1, v / v). La profondità del solvente deve essere appena inferiore a 0,5 cm.
   3. Rimuovere la placca dalla camera di sviluppo quando il fronte del solvente raggiunge la parte superiore della piastra. Segnare la posizione del fronte del solvente con una matita e lasciare la piastra si asciughi. Porre la piastra TLC in una camera di colorazione contenente saturo vapori di iodio per visualizzare campioni.
5. Analisi di DOX-PA con ¹ H-nucleare spettroscopia di risonanza magnetica ⁽¹ H-NMR). ¹⁸
   1. Sciogliere 15 mg di DOX-PA in 1 ml di metil solfossido-d6 (DMSO) e trasferire il campione in un tubo NMR.
   2. Inserire il tubo NMR nel magnete dello strumento NMR. Misurare lo spettro protonico, selezionando DMSO come solvente. Rimuovere il tubo NMR dal magnete. Analizzare il risultato NMR ^18.

2. Preparazione di DOX-PA Le micelle con il metodo Film-dispersione

1. Sciogliere DSPE-PEG (40 mg) e DOX-PA (4 mg) con 2 ml di metanolo in una fiala di vetro da 10 ml.
2. Rimuovere il solvente organico sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotante fino forma una sottile pellicola nel flacone.
   NOTA: In alternativa, evaporare i solventi organici sotto gas inerte (per esempio, argon o azoto) per formare una pellicola e mantenere la fiala in un essiccatore a vuoto per rimuovere ulteriormente solvente residuo.
3. Trasferimento 2 ml di tampone fosfato di Dulbecco (pH 7,4, DPBS) nella fiala di vetro.
4. Posizionare il flacone in un bagno ad ultrasuoni per 3 minuti a temperatura ambiente per generare micelle.
   NOTA: il potere ad ultrasuoni varia tra i diversi modelli di bagni ad ultrasuoni. Selezionare un'unità in grado di generare energia sufficiente ad ultrasuoni per disperdere la sottile pellicola di polimero / farmaco. La potenza di uscita del bagno a ultrasuoni utilizzati in questo protocollo è di 110 W.
5. Mantenere micelle a 4 ° C per una conservazione a breve termine e -20 ° C a lungostoccaggio -term.
   NOTA: In alternativa, le micelle possono anche essere liofilizzati e ricostituiti con acqua prima dell'uso. Di solito, non crioprotettore o lyoprotectant è necessario per questa formulazione.

3. Caratterizzazione di DOX-PA Le micelle

1. Determinazione della concentrazione DOX-PA in micelle e l'efficienza di incapsulamento farmaco
   1. Sciogliere DOX-PA sintetizzato nelle precedenti fasi di DMSO per preparare le soluzioni DOX-PA di cinque diverse concentrazioni: 1 mg / ml, 5 mg / ml, 20 mg / ml, 50 mg / ml, e 100 mg / ml. Misurare l'assorbimento delle soluzioni DOX-PA con un UV-VIS spettrometro a 490 nm. Generare una curva standard in base alle concentrazioni di farmaco DOX-PA e il loro assorbimento corrispondente a 490 nm.
   2. Diluire 25 ml di micelle di droga-caricato con 500 ml di DMSO. Misurare l'assorbimento a 490 nm con uno spettrofotometro UV-VIS. Calcolare le concentrazioni di farmaco con la curva standard generata in 3.1.1.
   3. Calcolare efficienza incapsulamento utilizzando la seguente equazione:
      Encapsulation Drug Efficienza (%) = (quantità di farmaci in micelle) / (quantità di farmaco aggiunto) × 100%
2. Caratterizzazione della dimensione delle particelle con dispersione della luce dinamica (DLS)
   1. Diluire micelle con DPBS (pH 7,4) ad una concentrazione finale DSPE-PEG di 1 mg / ml. Analizzare un campione 2 ml con un analizzatore di dimensione delle particelle per ottenere le dimensioni e polidispersità indice Z-medio (PDI).
3. Valutazione in vitro dell'attività antitumorale
   NOTA: utilizzare appropriati tecnica sterile ed operare all'interno di un armadio biosicurezza.
   1. Rimuovere il terreno di coltura cellulare da un pallone di coltura cellulare (ad esempio, T25) contenente DU-145 cellule cancerose della prostata umana e lavare le cellule con 2 ml di DPBS (pH 7,4).
   2. Aspirare DPBS, aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina (0,25%), e incubare per 2 minuti a 37 ° C per staccare le cellule.
   3. Aggiungere 10 ml di terreno di coltura cellulare (RPMI 1640 + 10% siero fetale bovino + 1% Antibiotico-antimicotica), quando la maggior parte delle cellule si staccano dal pallone. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare le cellule a 1.000 xg per 5 min.
   4. Risospendere il pellet cellulare con 5 ml di mezzo di coltura cellulare e rimuovere un campione per contare il numero di cellule con un emocitometro. Diluire le cellule con mezzo di coltura cellulare ad una densità di 50.000 cellule / ml. Aggiungere sospensioni diluito di cellule in una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti (100 ul / pozzetto). Incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO ₂₎ per 18 ore per permettere l'adesione cellulare.
   5. Diluire DOX dimetilsolfossido soluzione (DMSO) e la soluzione DOX-PA DMSO con terreno di coltura cellulare per ottenere concentrazioni finali di droga di 0,1 mM, 0,5 mM, 2 mM, 5 mM e 10 mM, rispettivamente. Mantenere concentrazione DMSO finale in tutti i campioni superiori allo 0,5%. Diluire DOX-PA micelle con terreno di coltura cellulare per ottenere finale co di drogancentrations di 0,1 mM, 0,5 mM, 2 mM, 5 mM e 10 mM, rispettivamente. Utilizzare il mezzo di coltura cellulare in bianco un controllo.
   6. Rimuovere la piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti dal termostato e sostituire il mezzo di coltura cellulare con 100 ml di mezzo contenente diversi agenti di trattamento previste al punto 3.3.5 (n = 4 per ciascun gruppo). Incubare le cellule nella coltura cellulare incubatore (37 ° C, 5% CO ₂₎ per un ulteriore 72 hr.
   7. Aspirare il mezzo e aggiungere 100 ml di mezzo contenente 0,5 mg / ml di 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT).
   8. Incubare le cellule in incubatore di coltura cellulare per ulteriori 2 ore. Rimuovere con attenzione il supporto e aggiungere 100 ml di DMSO per sciogliere i cristalli formazano.
   9. Misurare assorbanza con lo spettrofotometro per micropiastre alla lunghezza d'onda di 570 nm e una lunghezza d'onda di riferimento di 670 nm.
   10. Calcolare la vitalità cellulare utilizzando la seguente equazione:
       vitalità cellulare (%) = (A _Test / Un _controllo) × 100%
       NOTA: Confrontare la vitalità cellulare tra i diversi gruppi utilizzando una analisi della varianza ad una via (ANOVA) test statistico. Calcolare il _IC50 sulla base di vitalità cellulare contro dati di concentrazione di droga.

Risultati

La Figura 1 mostra lo schema di sintesi di DOX-PA. DOX-PA è stato sintetizzato dalla coniugazione di acido palmitico con doxorubicina attraverso un legame idrazone sensibile al pH. Un leggero eccesso di idrazide dell'acido palmitico è stato utilizzato per agevolare il completamento della reazione. Questo metodo di reazione ha un rendimento molto elevato e solo una piccola quantità di doxorubicina rimasto dopo una reazione 18 ore (Figura 2). La res...

Discussione

In questo lavoro, si descrive un metodo pellicola dispersione rapida semplice per la preparazione di micelle. Questo metodo utilizza le proprietà auto-assemblaggio di un polimero amfifilico (ad esempio, DSPE-PEG) per formare core-shell micelle strutturati in un ambiente acquoso. Questo metodo di preparazione micelle ha diversi vantaggi. 1. Si tratta di un semplice processo di formulazione, che evita l'uso di fasi dimensioni riduzione complicate (come estrusione o omogeneizzazione) comunemente utilizzati ne...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DSPE-PEG2K	Cordenpharm	LP-R4-039	>95%
Doxorubicin	LC Laboratories	D-4000	>99%
Palmitic Acid Hydrazide	TCI AMERICA	P000425G	>98.0%
Methanol	ACROS Organics	610981000	Anhydrous
Methylene chloride	FISHER	D151-4	99.90%
Methyl sulfoxide-d6	ACROS Organics	AC320760075	NMR solvent
Trifluoroacetic Acid	ACROS Organics	AC293811000	99.50%
Silica Gel	FISHER	L-7446	230-400 mesh
BAKER FLEX TLC PLATES	FISHER	NC9990129
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells	ATCC	HTB-81
MTT	ACROS Organics	158990050	98%
RPMI 1640 Medium	MEDIATECH INC	10041CV
Antibiotic-Antimycotic	LIFE TECHNOLOGIES	15240062	100x stock solution
Fetal Bovine Serum	LIFE TECHNOLOGIES	10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy	Varian, Inc		300 NMR
Büchi R-3 Rotavapor	Buchi	1103022V1	Rotary evaporator
Ultrasonic Bath	BRANSON ULTRASONICS CORPORATION	CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3	Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90	Malvern Instruments		Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer	Rio-Rad	Benchmark Plus
Cell Culture Incubator	Napco	CO2 6000
Biological Safety Cabinet	Nuaire
SigmaPlot	Systat Software, Inc.		Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate	Becton Dickinson	353072
Trypsin  0.25%	Corning Cellgro	25-053-CI