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要約

親油性のドキソルビシンプロドラッグの調製および特徴付けのためのプロトコルは、1,2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- Nロード- [アミノ（ポリエチレングリコール）-2000]の（DSPE-PEG）ミセルが記載されています。

要約

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

概要

化学療法は一般に、癌の種々の形態を治療するために使用されます。すべてではないが、ほとんどは、化学療法薬は、より多くの生命を脅かす条件に、このような吐き気や下痢などの管理がマイナー条件と異なる場合があり毒性の副作用を持っています。ほとんどの抗がん剤は毒性があるので、正常組織へのこれらの薬剤の非選択的露光は、必然的に毒性を引き起こします。したがって、選択的に癌細胞に薬物を送達することができる治療的アプローチのための大きい必要性があります。抗がん剤の投与と別の課題は、それらの難水溶性です。通常、可溶化剤は、これらの難溶性薬物を処方するために必要とされます。しかし、ほとんどの可溶化ジメチルスルホキシド（DMSO）、クレモフォールELなどの薬剤、およびポリソルベート80（ツイーン80）は、肝臓と腎臓毒性、溶血、急性過敏性反応や末梢神経障害を引き起こす可能性があります。1ので、安全で、生体適合性の製剤は、のために必要とされています貧しい人々の臨床使用LY可溶性抗癌剤。ナノキャリアは、上記の課題に対処するための薬物送達システムが期待されています。これらのナノキャリアは、リポソーム、2ナノ粒子、3ミセル、4-7ポリマー-薬物コンジュゲート、8および無機材料が挙げられる。9、いくつかのナノ医療製品は、（ 例えば 、ドキシル、アブラキサン、およびGenexol）は癌患者を治療するための規制当局によって承認されています。 10

高分子ミセルは、正常抗癌剤を送達するために使用されているナノスケール薬物送達キャリアを、期待されている。4-7,11,12典型的な高分子ミセルは、自己組織化プロセスを介して両親媒性ポリマーから調製されます。コア - シェル構造化された高分子ミセルは、親水性シェルと疎水性コアを含みます。親水性シェルは、立体的にミセルを安定化し、血流での循環を延長することができます。疎水性コアは、効果的に疎水性Dをカプセル化することができますラグ。そのため、小さなミセルのサイズ（一般的には200nm未満）および長期循環特性により、高分子ミセルは、強化された透過性および保持（EPR）効果（受動的腫瘍標的）を介して腫瘍ターゲッティングを達成すると考えられています。

薬物負荷の安定性は、ミセルの能力を腫瘍ターゲティングのために重要です。最適な腫瘍標的化を達成するために、ミセルは、腫瘍部位に到達する前に、最小限の薬物の漏出を有し、まだすぐにがん細胞を入力した後に薬物を放出すべきです。製剤の安定性は、製品開発の実現可能性、ならびに開発された製品の貯蔵寿命を決定するために加えて、製剤の安定性は、製品開発のための必須要件です。最近、多くの努力は、送達担体への薬物の負荷を改善するためになされています。親油性プロドラッグアプローチは、脂質ナノ粒子及び乳剤に薬物負荷を改善するために検討されている戦略である。13,14 CONJ薬物と脂質のugationは大幅に親油性を向上させ、ナノキャリアの親油性成分でロードと保持を高めることができます。

ここでは、親油性のドキソルビシンプロドラッグロードミセルを調製するためのプロトコルについて説明します。まず、親油性プロドラッグをドキソルビシンの合成手順を説明します。その後、膜分散法を用いてミセルを生成するためのプロトコルが導入されます。この方法は、正常に我々の以前の研究で使用されてきた。それは、正常ミセル薬物送達のために使用されているため、5 DSPE-PEGは、ミセルを調製するための担体材料として選択した。15,16最後に、我々は、ミセルを特徴付けるために使用されるいくつかのインビトロアッセイを記載抗癌活性を評価するための製剤および。

プロトコル

DOX-PAの1の合成

  1. ドキソルビシン390mgのパルミチン酸ヒドラジドの243ミリグラムを秤量し、丸底フラスコに移します。
  2. ガラスシリンジでフラスコに無水メタノール150mlを追加します。ピペットでトリフルオロ酢酸（TFA）の39μLを加えます。マグネチックスターラーを用いて、暗所で室温で18時間、反応混合物を攪拌します。
    注：反応物質の量をスケールアップすることができ、またはダウンDOX-PAの異なる量を得ました。反応体の比率が同じ比率で維持されるべきです。 78 mgの1170ミリグラムの範囲でDOXの量を使用する反応は、通常の化学実験室で行うことができます。
  3. シリカゲルカラムを用いてDOX-PAの精製。17
    1. ロータリーエバポレーターで反応混合物中の溶媒を除去します。混合物の体積を約20 mlまで低下した後、シリカゲルを3gを加えます。乾燥粉末を得るために回転蒸発を続行し、トンを可能にするために、シリカゲルへの製品の吸着彼。乾燥粉末が形成された後、さらに30分間真空下でサンプルを保管してください。
    2. 溶媒としてジクロロメタンを用いてカラムにシリカゲル50gのパック。慎重にカラムに吸着した生成物を含有するシリカゲルのサンプルを追加します。
    3. 徐々にそれによって溶媒極性（ 表1）を増加させる、メタノールの割合を増加させながら、ジクロロメタンおよびメタノールの混合物でカラムを溶出します。
    4. 試験管（25ミリリットル/チューブ）における溶離液の画分を収集し、薄層クロマトグラフィー（TLC）によって進行状況を監視します。
    5. 純粋なDOX-PAを含む全ての画分を合わせ、乾燥粉末が形成されるまで、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去します。さらに真空O / Nの下で生成物を乾燥。
  4. TLCによるDOX-PAの分析。
    1. TLCプレートの4センチメートル×8センチセクションをカット。スポット試料溶液TLCがMETを使用して毛細血管をスポッティングとプレートの底から0.5センチメートル溶媒としてhanol。
    2. ジクロロメタンおよびメタノールの混合物を含有する現像室にTLCプレートを置き（3/1、v / v）でした。溶剤の深さはわずか0.5未満cmでなければなりません。
    3. 溶媒先端がプレートの上部に到達したときに現像室からプレートを取り外します。鉛筆で溶媒先端の​​位置をマークし、プレートを乾燥させます。サンプルを可視化するために、飽和ヨウ素蒸気を含む染色室にTLCプレートを置きます。
  5. 1 H核磁気共鳴分光法（1 H-NMR）によるDOX-PAの分析。18
    1. メチルスルホキシド-D6（DMSO）の1ミリリットル中にDOX-PAの15ミリグラムを溶解し、NMRチューブにサンプルを移します。
    2. NMR装置の磁石にNMR管を挿入します。溶媒としてDMSOを選択し、プロトンスペクトルを測定します。磁石からのNMRチューブを外します。 NMRの結果18を分析します。

2。フィルム分散法によるDOX-PAミセルの調製

  1. DSPE-PEG（40 mg）をDOX-PA（4 mg）を10mlのガラスバイアル中の2mlのメタノールで溶解します。
  2. バイアル中の薄膜が形成されるまで、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で有機溶媒を除去。
    注：また、膜を形成し、さらに、残留溶媒を除去し、真空デシケーター中でバイアルを維持するために、不活性ガス（ 例えば 、アルゴンまたは窒素）下で有機溶媒を蒸発させます。
  3. 転写ガラスバイアルにダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4の、DPBS）2 mlです。
  4. ミセルを生成するために、室温で3分間、超音波浴中でバイアルを置きます。
    注：超音波パワーは超音波風呂の異なるモデル間で変化します。薄いポリマー/薬物フィルムを分散させるのに十分な超音波パワーを発生させることができるユニットを選択します。このプロトコルで使用される超音波浴の出力電力は110 Wです。
  5. 短期記憶のために4℃でミセルを維持し、-20長いため℃〜-termストレージ。
    注：また、ミセルはまた、凍結乾燥し、使用前に水で再構成することができます。通常、何の凍結保護剤または凍結保護剤は、この製剤のために必要とされていません。

DOX-PAミセルの3キャラクタリゼーション

  1. ミセルおよび薬物封入効率のDOX-PA濃度の決意
    1. 1μg/ mlで、5μgの/ mlで、20μgの/ mlで、50μgの/ mlの、および100μg/ mlの：DOX-PAは、5つの異なる濃度のDOX-PA溶液を調製するため、DMSO中に前の手順で合成し溶解します。 490nmでのUV-VIS分光計でDOX-PAソリューションの吸収を測定します。 DOX-PAの薬物濃度と490nmのそれらに対応する吸収に基づいて標準曲線を生成します。
    2. DMSOの500μlの薬物負荷ミセル25μlの希釈します。 UV-VIS分光光度計で490nmの吸収を測定します。 3.1.1で作成した標準曲線を用いて薬物濃度を計算します。
    3. 以下の式を用いて封入効率を計算します。
      薬物封入効率（％）=（ミセル中の薬物の量）/（添加薬剤の量）×100％
  2. 動的光散乱と粒子サイズの特性（DLS）
    1. 1mg / mlの最終DSPE-PEG濃度にDPBS（pH7.4）中でミセルを希釈します。 Z平均寸法及び多分散性指数（PDI）を得るために、粒子サイズ分析器で2mLのサンプルを分析します。
  3. インビトロでの抗癌活性の評価
    注：適切な滅菌技術を使用し、バイオセーフティキャビネット内で動作します。
    1. DU-145ヒト前立腺癌細胞を含む細胞培養フラスコ（ 例えば、T25）から細胞培養培地を除去し、DPBS 2mlの液（pH7.4）で細胞を洗浄します。
    2. 吸引DPBSを、トリプシン溶液1ml（0.25％）を添加し、細胞を剥離するために、37℃で2分間インキュベートします。
    3. 10メートルを追加ほとんどの細胞をフラスコから剥離された細胞培養培地のリットル（RPMI1640培地+ 10％ウシ胎児血清+ 1％抗生物質 - 抗真菌）。 15-ml遠心チューブと遠心分離機5分間千×gで細胞に細胞を移します。
    4. 細胞培養培地5mlで細胞ペレットを再懸濁し、血球計で細胞数をカウントするサンプルを除去します。 50,000細胞/ mlの濃度に細胞培養培地で細胞を希釈します。 96ウェル細胞培養プレート中に希釈された細胞懸濁液を加える（100μl/ウェル）。細胞接着を可能にするために18時間細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で細胞をインキュベートします。
    5. 希釈DOXのジメチルスルホキシド、それぞれ0.1μM、0.5μMの最終薬物濃度を得るための（DMSO）溶液と細胞培養培地とDOX-PA DMSO溶液を、2μM、5μM、及び10μM、。 0.5％に上記のすべてのサンプルで最終DMSO濃度を保ちます。最終薬物COを得るために、細胞培養培地を用いてDOX-PAミセルを希釈それぞれ0.1μM、0.5μMのncentrations、2μM、5μM、及び10μM、。ブランクの細胞培養培地にコントロールを使用してください。
    6. インキュベーターから96ウェル細胞培養プレートを取り外して、ステップ3.3.5で調製した異なる治療剤を含む培地100μlの細胞培養培地を交換し（各群n = 4）。さらに72時間細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で細胞をインキュベートします。
    7. 吸引培地、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）の0.5ミリグラム/ mlを含む培地100μlを加えます。
    8. さらに2時間、細胞培養インキュベーター中で細胞をインキュベートします。慎重に培地を除去し、ホルマザン結晶を溶解させるために100μlのDMSOを追加します。
    9. 波長570nmと670nmでの参照波長でマイクロプレート分光光度計で吸光度を測定します。
    10. 以下の式を用いて細胞生存率を計算します。
      細胞の生存率（％）=（ 試験 / 対照 ）×100％
      注：一元配置分散分析（ANOVA）統計的検定を用いて異なるグループ間での細胞生存率を比較します。薬物濃度データ対細胞生存率に基づいて、IC 50を計算します。

結果

図1は、DOX-PAの合成スキームを示します。 DOX-PAは、pH感受性ヒドラゾン結合を通してドキソルビシンとパルミチン酸の結合により合成しました。パルミチン酸ヒドラジドのわずかに過剰に反応の完了を促進するために使用されました。この反応方法は、非常に高い効率およびドキソルビシンの少量は18時間の反応（ 図2）の後に残っています。...

ディスカッション

本研究では、ミセルの調製のための単純、迅速なフィルム分散法を説明します。この方法は、水性環境中でコアシェル構造のミセルを形成する両親媒性ポリマー（ 例えば 、DSPE-PEG）の自己集合特性を利用します。このミセルの調製方法は、いくつかの利点を有します。 1.これは、一般的に、リポソーム、ナノ粒子、およびナノエマルジ ​​ョンの調製に使用される（例えば、押出し?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DSPE-PEG2KCordenpharmLP-R4-039>95%
DoxorubicinLC LaboratoriesD-4000>99%
Palmitic Acid HydrazideTCI AMERICA  P000425G>98.0%
MethanolACROS Organics610981000Anhydrous
Methylene chloride FISHER D151-499.90%
Methyl sulfoxide-d6ACROS OrganicsAC320760075NMR solvent
Trifluoroacetic Acid ACROS OrganicsAC29381100099.50%
Silica GelFISHER L-7446230-400 mesh
BAKER FLEX TLC PLATES FISHER NC9990129
DPBSSigma-AldrichD8537
DU 145  Prostate Cancer CellsATCCHTB-81
MTTACROS Organics15899005098%
RPMI 1640 MediumMEDIATECH INC 10041CV
Antibiotic-Antimycotic LIFE TECHNOLOGIES 15240062100x stock solution
Fetal Bovine SerumLIFE TECHNOLOGIES 10437077
Nuclear Magnetic Resonance SpectroscopyVarian, Inc300 NMR 
Büchi R-3 RotavaporBuchi1103022V1 Rotary evaporator
Ultrasonic BathBRANSON ULTRASONICS CORPORATION CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90 Malvern InstrumentsParticle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer Rio-RadBenchmark Plus 
Cell Culture IncubatorNapcoCO2 6000
Biological Safety CabinetNuaire
SigmaPlot Systat Software, Inc.Analytical Software
96-Well Cell Culture PlateBecton Dickinson353072
Trypsin  0.25%Corning Cellgro25-053-CI

参考文献

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