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摘要

这项研究的目的是制定技术, 允许成功的基因转导在原自然杀手 (NK) 细胞。葡聚糖介导的人或小鼠原代 NK 细胞的慢转导可导致较高的基因表达效率。这种基因转导方法将极大地改善 NK 细胞的遗传操作。

摘要

将特定基因的有效转导转化为自然杀伤细胞是一个主要的挑战。成功的 transductions 是关键的定义的作用基因的兴趣在发展, 分化和功能的 NK 细胞。最近的进展与嵌合抗原受体 (汽车) 的癌症免疫治疗强调需要一个有效的方法提供外源基因的效应淋巴细胞。慢介导的基因 transductions 对原人或小鼠 NK 细胞的效率仍然很低, 这是一个主要的限制因素。最近的进展, 使用阳离子聚合物, 如凝聚, 显示了改善基因转导效率的 T 细胞。然而, 这些产品未能改善 NK 细胞的转导效率。这项研究表明, 葡聚糖是一种支链多糖, 能显著提高人和小鼠原代 NK 细胞的转导效率。这种高度可再生的转导方法为换人类原发性 nk 细胞提供了一个有效的工具, 它可以极大地改善临床基因的传递应用, 从而使 nk 干细胞免疫治疗.

引言

自然杀手 (NK) 细胞是先天免疫系统的主要淋巴细胞种群1。NK 细胞作为宿主免疫应答的一线防御者, 抗肿瘤和感染2,3,4。NK 细胞通过分泌强有力的细胞因子和趋化因子5在耐受性发展中起着重要作用。由于其靶向和消除肿瘤细胞的强大能力, 目前正在进行多项临床试验, 以评估供者派生的人类 NK 细胞作为癌症的过继免疫治疗6,7。与 T 细胞相比, NK 细胞的发育生物学尚未良好8。这种缺乏知识的部分原因是缺少有效的技术来提供老鼠或人类原发性 NK 细胞感兴趣的基因。由于这些原因, 大多数 NK 细胞的研究都是在细胞系中进行的, 而不是在原代细胞中进行。因此, 需要一个可靠和有效的协议, 传感器原代 NK 细胞与感兴趣的基因是至关重要的。

这项研究的总目标是制定一个一致的和可靠的方法, 其中主要人或小鼠 NK 细胞可以转与 lenti 或病毒。

早先的研究试图解决这个问题, 主要是利用了原代 NK 细胞的瞬时转化。这包括质粒转染9,10, eb 病毒-巴尔毒 (eb)/逆转录酶杂交载体11, 痘苗向量12,13, 和 Ad5/F35 嵌合体腺病毒载体14。尽管这些技术的效率很高, 但转导的瞬态性使得它们不适合长期利用转基因 NK 细胞。最近的一些研究已经使用逆转录病毒载体传感器 NK 细胞, 需要多个感染周期来达到一个可接受的基因表达水平11,15。与逆转录病毒载体不同, 慢载体可以利用宿主细胞核进口机械转移病毒 pre-integration 复合体进入细胞核。这是在 non-dividing 细胞 (包括原代 NK 细胞) 中复制病毒的一个主要限制因素。

不同的细胞表面受体和病毒粒子之间的相互作用允许病毒对细胞的吸收。病毒包膜蛋白及其同源宿主受体之间的初始接触可能会受到限制, 因为这两者之间存在潜在的负电荷。许多转导技术的基本原理是, 添加阳离子聚合物, 如凝聚 (Pb), 硫酸精蛋白 (PS), 或葡聚糖, 可以给细胞表面受体积极的电荷, 从而增强病毒包络的结合蛋白质.这将提高融合效率和吸收的病毒粒子的细胞16。虽然据报道, Pb 或 PS 可以改善 T 细胞的基因转移17, 他们的应用没有任何影响的转导效率的原代 NK 细胞。此外, 还没有对这些试剂使用原代 NK 细胞进行比较分析。本研究对三阳离子聚合物的转导效率进行了比较。结果表明, 在这三阳离子聚合物中, 只有葡聚糖能显著提高小鼠和人原代 NK 细胞的有效病毒转导。

研究方案

所有动物协议跟随了动物的人道和道德治疗并且由机构动物护理和用途委员会 (IACUC) 批准在威斯康辛医学学院的生物医学研究中心 (MCW), 密尔沃基, WI。使用人外周血单个核细胞 (PBMCs) 被批准的机构审查委员会 (IRB) 血液研究所的血液研究中心威斯康星州, 密尔沃基, WI。

1. 小鼠、细胞系和载体

  1. 从商业供应商那里获得 C57BL/6 的老鼠。保持在无病原体条件下的小鼠菌落, 并在6和12周的年龄段使用雌性和雄性小鼠。从 IRB 批准的来源获得去除人 PBMCs。
  2. 麻醉在丙烯乙二醇 (1, 2-丙二醇, USP 等级) 中混合 20-30% v/v 异氟醚的动物, 以麻醉小鼠。将兽医软膏涂抹于眼部, 防止小鼠麻醉时干燥。
  3. 对动物进行安乐, 在麻醉诱导后进行颈椎脱位。
    1. 用一只手牢牢抓住尾巴的底座来抑制老鼠。在头骨的底部放置一支结实的棍子型钢笔或拇指和另一只手的手指, 放在颈部的后部。
    2. 为了产生脱位, 推手抑制动物的头部向前, 并向下推, 而向后拉的手持有的尾巴基地。通过感觉宫颈组织分离来验证脱位的有效性。
  4. 保持在室内/笼子里的动物至少5分钟, 并删除他们只有当呼吸活动是缺席或当有一个检测的心跳缺乏。
  5. 从商业供应商那里获得 K562 和 YAC-1 细胞, 并在含有10% 热灭活 FBS 的 RPMI1640 培养基中维持它们。定期测试这些细胞系, 以排除支原体污染的可能性。

2. 慢载体的制备和滴定

  1. 培养 5 x 106 293T 细胞过夜在 T75 cm2烧瓶中, 含有20毫升的 RPMI1640 培养基, 10% FBS, 100 U/毫升青霉素, 100 µg/毫升链霉素, 1 毫米丙酮酸钠, 5% 的7.5% 碳酸氢钠溶液, 0.001%β-基。将烧瓶放入37° c 的恒温箱中, 注入 5.2% CO2。
  2. 用磷酸缓冲盐 (PBS) 中的胰蛋白酶 (0.025%)/EDTA (1 毫米) 获得293T 细胞。在 PBS 中加入5毫升的胰蛋白酶/EDTA, 在37° c 的孵化箱中孵育10分钟的烧瓶, 使293T 细胞脱离 T75 cm2烧瓶。
    1. 收集分离的细胞, 并清洗两次在 PBS, 以消除任何痕迹的胰蛋白酶和 EDTA。用例计数单元格, 并将单元格数调整为每毫升100万单元格。
  3. 染的293T 细胞18与3.95 µg 的 psPAX2, 1.32 µg pMD2G, 和5.26 µg pLEP-gfp 普洛 (生成 in-house 在 EF1alpha 的克隆 pWPI 启动子, 在 pLenti 的地方的巨细胞病毒的启动子,-gfp-普洛) 19.
    1. 准备1毫升150毫米氯化钠加63µL 0.6 毫克/毫升亚 (PEI; 2.5万 kD, 线形)。混合好, 然后加入质粒和混合。在室温下孵育20分钟, 然后将其添加到细胞中。
    2. 16 h post-transfection, 用新鲜培养基加4.5 毫米丁酸钠取代转染培养基。收获含有病毒 48 h post-transfection 的上清液, 用隔夜离心法浓缩 5000 x g。请参阅材料表。
  4. 通过流式细胞仪 72 h post-transduction20进行串行稀释和检测, 确定使用293T 细胞的病毒滴。使用绿色荧光蛋白 (GFP) 的表达作为量化病毒滴的措施。

3. 小鼠原代 NK 细胞的纯化和扩展

  1. 纯化小鼠原发性 NK 细胞21。简要地, 通过尼龙羊毛柱通过单细胞脾悬浮物, 以耗尽由 B 细胞和巨细胞组成的黏附人群。
  2. 培养换药种群洗从尼龙羊毛柱, 其中含有 1000 u/毫升白细胞介素 (IL)-2 在 RPMI1640 培养基与 10% FBS, 100 U/毫升青霉素, 100 µg/毫升链霉素, 1 毫米丙酮酸钠, 5% 7.5% 碳酸氢钠溶液, 和0.001% β-基 (RPMI1640 完全介质)。
  3. 改变这种培养基4天的烧瓶, 以消除换药 T 和 NKT 细胞;仍然附着在烧瓶中的细胞主要是 NK 细胞。添加20毫升新鲜 RPMI1640 完全培养基和 1000 U/毫升 IL-2, 以补充烧瓶。
  4. 在7天通过流式细胞仪检测 nk 细胞培养物的纯度, 并使用具有95% 以上 CD3 -NK1.1+填充的准备工作。

4. 人类原发性 NK 细胞的纯化与扩展

  1. 通过密度梯度分离 PBMCs, 从健康的人类志愿者的巴菲大衣。简要地, 仔细地35毫升的 half-diluted (与 HBSS) 细胞超过15毫升的密度梯度在一个50毫升规范管。离心机在 400 x g 为30分钟在20° c 在摇摆的桶转子没有闸。
  2. 根据制造商的协议, 使用商用抗体阴性选择套件来纯化人类原代 NK 细胞。
  3. 分离后, 通过免疫荧光分析测定 NK 细胞的纯度。用2µg/毫升 anti-CD3 和2µg/毫升 anti-CD56 抗体在4° c 下染色 nk 细胞, 20 min. 在细胞表面没有 CD3 和 CD56 存在的情况下, 用 PBS nk 细胞的数量来冲洗两次细胞。
  4. 用抗体在4° c 下孵育20分钟的细胞制剂, 用 PBS 进行冲洗, 并在流式仪中进行分析。使用 NK 细胞准备与超过85% 纯度的基因转导化验20。

5. 小鼠和人原发性 NK 细胞与慢的转导

  1. 在 0.5 x 105/毫升培养基中, 在有 GFP 慢上清的情况下, 在5处将小鼠或人类主 NK 细胞悬浮在24井板上, 10、20种感染 (莫伊) 和有 Pb (8 µg/毫升)、PS (8 µg/毫升) 或葡聚糖 (8 µg/毫升) 的存在。
  2. 离心板在 1000 x g 为60分钟。
  3. 没有迁上清液, 培养细胞过夜 (16-18 小时) 在37° c 孵化器注入 5.2% CO2.
  4. 在 IL-2 (300 U/毫升) 的情况下, 用10毫升 PBS 和重在2毫升完全 RPMI1640 培养基中洗涤。
  5. 分别通过在不同的 effector-to-target 细胞比22中执行51铬 (Cr) 释放试验, 测试人和小鼠主要 NK 细胞对 K562 和 YAC-1 的杀伤作用。
    1. 简要地, 给100万靶细胞50µCi 标记钠铬酸盐51Cr。在4小时的潜伏期, 他们吸收了51Cr 为细胞蛋白。在孵化结束时, 清洗细胞以移除任何未注册的标签。
    2. 通过从目标细胞中的绝对、自发和实验释放的51Cr 的数量来计算特定肿瘤细胞的裂解。
      注: pentaplicate 实验的具体溶解百分率的计算采用以下公式:% 特定的裂解 = ((51cr 平均实验释放- 51cr 平均自发释放)/(51cr 平均值最大释放- 51cr 平均自发释放)) х 100, 其中 "51cr 平均自发释放" 是51cr 释放的目标细胞在缺乏 NK 细胞和 "51cr 平均最大释放" 是51cr由2的盐酸 (HCl) 溶解后从靶细胞释放出来。
  6. 在7天转 NK 细胞, 轻轻敲击烧瓶。
    1. 通过涂层 96-好, 高蛋白吸收聚苯乙烯板, 2.5 µg/毫升浓度的 anti-NKG2D 单克隆在一夜之间激活滴定浓度的板结合 anti-NKG2D (A10) 抗体的收获细胞。
    2. 在原代 NK 细胞加入前, 用100µL PBS 三次冲洗每一个井。
  7. 收集文化清使用多通道吸管在16和 18 h 后之间定量细胞因子例如干扰素γ。使用与酶联免疫吸附试验 (ELISA) 试剂盒提供的重组细胞因子生成标准曲线。
  8. 用 annexin-V/7-amino-actinomycin D (7-反倾销) 染色法测定 nk 细胞的存活率23 , 并利用流式细胞仪测定转化 nk 淋巴细胞中坏死细胞的百分比。
    1. 为了进行这种化验, 在转导后四天内采集小鼠和人 NK 细胞, 用10毫升的冷 PBS 在 500 x g 分别洗涤两次, 每5分钟, 用蛋白 V (PE)/7-反倾销试剂盒孵育。
  9. 使用适当的流式细胞仪软件对数据进行分析。选择活细胞种群并分析 GFP (FITC 通道) 的表达作为病毒转导的一种措施24。

结果

葡聚糖诱导人和小鼠 NK 细胞慢载体的高效基因转移

人类 NK 细胞从 PBMC 分离纯化 (纯度超过 85%), 并在夜间与 rIL-2 300 U/毫升孵育。这些主要 NK 细胞, 然后转与 GFP 慢在不同的多重感染 (莫伊; 3, 10, 20 每细胞) 24-井板存在8µg/毫升铅, PS, 或葡聚糖。细胞被离心在 1000 x g 为60分钟和培养 (在病毒面前) 过夜在37° c 在 CO2孵化器。细?...

讨论

本研究表明, 用葡聚糖作为阳离子聚合物剂, 可提高小鼠和人原代 NK 细胞的慢转导效率。此外, 其他阳离子剂, 如 Pb 或 PS, 对病毒载体向人类原发性 NK 细胞的传递无明显影响。在此之前, 人们已经证明, Pb 可以增强人类 T 细胞的基因转导17。然而, 这些结果表明, 无论是 Pb 还是 PS 在人类原代 NK 细胞上都没有类似的效率。在本研究中, Pb 对小鼠 NK 细胞的转导效果仅有轻度改善。结果?...

披露声明

提交人声称没有任何经济利益冲突。

致谢

我们感谢露西亚 Sammarco 和她的露露的柠檬水站的灵感, 动力, 和支持。这项工作得到了部分由 NIH R01 AI102893 和 R01 CA179363 (克里希纳) 的支持;NHLBI-HL087951 (纳丹);NIH-CA151893-K08 (M.J.R.);1R01CA164225 (L. W);亚历克斯柠檬水站立基础 (克里希纳);委员会基金的 HRHM 计划 (克里希纳;纳丹;硕士 T);尼古拉斯家族基金会 (克里希纳);Gardetto 家族 (克里希纳);现代学者计划 (M.S.T.);现代希望在轮子 (纳丹);委员会基金 (M.S.T. 和克里希纳);儿童研究所, MCW (纳丹);凯西菲 Fogerty 奖 (M.J.R.)。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
DextranSigma-Aldrich90-64-91-9
polybrene (Pb)Sigma-AldrichTR-1003
protamine sulfate (PS)Sigma-Aldrichp3369
TrypsinCorning25-052-CI
RPMI1640Corning10-040-CV
Fetal Bovine SerumATALANTAS11150
PenicillinCorning30-001-CI
B-mercaptoethanolSIGMAM3148
sodium pyruvateCorningMT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ )eBioscience14-7311-85
Propidium lodding staining solutionBD51-66211E
Lipofectamine 3000Thermo FisherL3000015
IsofluranePHOENIXNDC 57319-559-05
NK cell negative selection kitStem Cell19855
Yac-1ATCCTIB-160
K562ATCCCCL-243
MiceJakson664
293T cellsATCCCRL-3216
T75 flasksCornnig430641U
antibody-based negative selection kitsStem Cell19055
51Chromium (Cr)-release assaysperkin elmer'sNEZ030
ELISA kitsEbioscience00-4201-56
Sodium ButyrateSigma5887-5G
Linear polyethyleniminepolysciences23966-2
FicollGE Life Science17-1440-03
HBSSCorning21-022-CV

参考文献

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