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Resumo

O objetivo deste estudo foi a formulação de tecnologias que permitem a transdução de gene bem sucedido na primária natural killer (NK) as células. O dextran-mediada Lentivirus transdução de humanos ou rato primário NK células os resultados, em maior eficiência de expressão do gene. Este método de transdução gene vastamente irá melhorar a manipulação genética de células NK.

Resumo

A transdução eficiente de genes específicos nas células de (NK) assassinos naturais tem sido um grande desafio. Transductions sucesso são fundamentais para definir o papel do gene de interesse no desenvolvimento, diferenciação e função das células NK. Avanços recentes relacionados com os receptores de antígeno Quimérico (carros) em imunoterapia acentuam a necessidade de um método eficiente entregar genes exógenos para linfócitos efetores. As eficiências de transductions gene Lentivirus mediada em humanos primários ou rato NK células permanecem significativamente mais baixas, que é dos principais fatores limitante. Avanços recentes usando polímeros catiônicos, tais como polybrene, mostram uma eficiência de transdução melhorada de gene em células T. No entanto, estes produtos não conseguiram melhorar as eficiências de transdução das células NK. Este trabalho mostra o dextrano, um polissacárido ramificado glucan, melhora significativamente a eficiência de transdução de humanos e células NK primárias de rato. Esta metodologia de transdução altamente reprodutível fornece uma ferramenta competente para transducing humana primária as células NK, que podem melhorar muito clínico gene entrega aplicativos e, portanto, NK baseada em célula imunoterapia.

Introdução

Assassino naturais (NK) células são a população linfocitária principal do sistema imune inato1. Células NK funcionam como os defensores da primeira linha da resposta imune do hospedeiro contra infecções e tumores de3,2,4. Células NK também desempenham um papel central no desenvolvimento da tolerância através da secreção de potentes citocinas e quimiocinas5. Devido à sua potente capacidade para atacar e eliminar as células do tumor, vários ensaios clínicos estão sendo realizados para avaliar derivados de doador humanas células NK como uma adotivos imunoterapia para o câncer6,7. Em contraste com as células T, a biologia do desenvolvimento das células NK ainda tem que ser bem caracterizadas8. Esta falta de conhecimento é parcialmente devido à ausência de técnicas eficientes que entregam os genes de interesse para mouse ou células NK primárias humanas. Por estas razões, a maioria das células NK estudos foram conduzidos em linhas de células, em vez de células primárias. Portanto, a necessidade de um protocolo confiável e eficiente para transduce primárias células NK com genes de interesse é crucial.

O objetivo geral deste estudo foi a formulação de um método consistente e confiável, pelo qual células NK primárias de humano ou murino poderiam ser transfectadas com lenti - ou retrovírus.

Foram efectuados estudos anteriores que tentou resolver este problema, em grande parte, usando a transformação transitória das principais células NK. Isso inclui o plasmídeo transfeccao9,10, vírus de Epstein - Barr (EBV) /11de vetor retroviral híbrido, vaccinia vectores12,13e de quimérico vetores adenovírus Ad5/F3514. Apesar da modesta eficiência destas técnicas, a natureza transitória de transdução torna inadequados para a utilização a longo prazo das células NK geneticamente modificadas. Alguns estudos recentes têm utilizado vetores retrovirais para transduce células NK, que requerem vários ciclos de infecção para alcançar um nível aceitável de gene expressão11,15. Em contraste com vetores retrovirais, vetores de Lentivirus podem usar maquinaria de importação nuclear da célula hospedeira para translocar o complexo pré-integração viral para o núcleo. Este é um importante fator limitante na replicação do vírus em células não-divisão, que incluem primárias células NK.

Interações entre diferentes receptores de superfície e partículas virais permitam absorção viral dentro da célula. Os compromissos iniciais entre as proteínas do envelope viral e seus receptores cognatos anfitrião podem ser limitados devido as cargas negativas potenciais existentes entre estes dois. A lógica por trás de muitas técnicas de transdução é que a adição de polímeros catiônicos, como polybrene (Pb), sulfato de protamina (PS) ou dextrano, poderia dar uma carga positiva para os receptores de superfície e, assim, aumentar a ligação do envelope viral proteínas. Isto aumentará a eficiência de fusão e a absorção de partículas virais em células16. Embora tem sido relatado que Pb ou PS pode melhorar a transferência de genes em células de T17, sua aplicação não teve qualquer efeito na eficiência transdução da primárias células NK. Além disso, uma análise comparativa entre estes reagentes usando primárias células NK não foi realizada. Neste estudo, foram comparadas as eficiências de transdução dos três Polímeros Catiônicos. Os resultados mostram que, entre estes três polímeros catiônicos, apenas dextran aumenta significativamente eficiente transdução viral em rato e em células NK primárias humanas.

Protocolo

Todos os protocolos de animais seguiram o tratamento humanizado e ético de animais e foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) dentro o centro de pesquisa biomédica (BRC) da faculdade médica de Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. O uso de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foi aprovado por institucional Review Board (IRB), do Instituto de pesquisa de sangue do centro de sangue de Wisconsin, Milwaukee, WI.

1. ratos, linhas celulares e vetores

  1. Obter camundongos C57BL/6 de fornecedores comerciais. Manter as colônias de rato em condições isentos de organismos patogénicos e usar ratos masculinos e femininos, entre as idades de 6 e 12 semanas. Obter de identificados PBMCs humanos de fontes aprovados pelo IRB.
  2. Anestesia os animais com uma mistura de 20-30% v/v de isoflurano em propilenoglicol (1, 2-propanodiol, grau USP) para anestesiar os ratos. Aplique pomada de veterinário aos olhos para evitar ressecamento, enquanto os ratos estão sob anestesia.
  3. Para abater os animais, realize deslocamento cervical após a indução da anestesia.
    1. Conter os ratos segurando firmemente a base da cauda com uma mão. Coloque uma caneta de pau-tipo resistente ou o polegar e o primeiro dedo da outra mão contra a parte de trás do pescoço, na base do crânio.
    2. Para produzir a luxação, empurre a mão de restrição a cabeça do animal para a frente e empurre para baixo enquanto puxa para trás com a mão segurando a cauda base. Verificar a eficácia da luxação, pelo sentimento de uma separação do tecido cervical.
  4. Manter os animais na câmara/gaiola pelo menos 5 min e removê-los somente quando a atividade respiratória está ausente, ou quando há uma falta de um batimento cardíaco detectável.
  5. Obter células K562 e YAC-1 de fornecedores comerciais e mantê-las em RPMI1640 meio contendo 10% inactivadas pelo calor FBS. Teste essas linhas celulares periodicamente para excluir a possibilidade de contaminação de micoplasma.

2. preparação e titulação de Lentivirus vetores

  1. Células de cultura 5 × 106 293T durante a noite em um balão de2 cm T75 contendo uma solução de 20 mL de meio RPMI1640 com 10% FBS, 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 de µ g/mL, piruvato de sódio de 1 mM, 5% de solução de bicarbonato de sódio a 7,5% e de 0,001% Β-Mercaptoetanol. Coloque o frasco em uma incubadora de 37 ° C, infundida com 5,2% CO2.
  2. Colher as células 293T usando tripsina (0.025%)/EDTA (1 mM) em tampão fosfato salino (PBS). Adicionar 5 mL de tripsina/EDTA em PBS e incubar os frascos por 10 min em um 37 ° C numa incubadora para permitir o desprendimento de células 293T os frascos de2 cm T75.
    1. Coletar as células desanexadas e lavá-los duas vezes com PBS para remover quaisquer vestígios de tripsina e EDTA. Contar as células com um hemocytometer e ajustar o número de celular para 1 milhão de células por mL.
  3. Transfect as células 293T18 com 3,95 µ g de psPAX2, 1.32 µ g de pMD2G e 5,26 µ g de pLEP-GFP-Puro (gerado internamente no BRI clonando promotor de EF1alpha de pWPI no lugar de um promotor de CMV em pLenti CMV-GFP-Puro)19.
    1. Prepare-se 1 mL de 150 mM de NaCl mais 63 µ l do polyethylenimine de 0,6 mg/mL (PEI; 25.000 kD, linear). Misture bem e, em seguida, adicionar o plasmídeo e misture. Incubar durante 20 min à temperatura ambiente e em seguida, adicioná-lo às células.
    2. pós-transfecção 16 h, substituir o transfeccao com meio fresco além de butirato de sódio 4,5 mM. Colher o sobrenadante contendo do pós-transfection 48 h de vírus e concentrar por centrifugação durante a noite a 5.000 × g. Consulte a tabela de materiais.
  4. Determinar a concentração viral usando células 293T realizando diluições em série e ensaio por citometria de fluxo 72 h pós-transdução20. Use a expressão da proteína verde fluorescente (GFP) como uma medida para quantificar a concentração viral.

3. purificação e expansão de murino primário NK células

  1. Purifica murino primário NK células21. Brevemente, passe as suspensões de célula única baço através de colunas de lã de nylon para esgotar as populações aderentes consistindo de macrófagos e células B.
  2. Cultura das populações não-aderente eluídas da coluna de lã de nylon que contém murino células NK com 1.000 U/mL interleucina (IL) -2 em meio RPMI1640 com 10% FBS, 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 de µ g/mL, piruvato de sódio 1 mM, 5% de bicarbonato de sódio 7,5% solução e 0,001% β-mercaptoetanol (RPMI1640 meio completo).
  3. Alterar o meio dos frascos no dia 4 desta cultura para remover os não-aderente T e células NKT; as células que permanecem aderidas aos frascos são em grande parte as células NK. Adicione 20 mL de meio de completa RPMI1640 fresco e IL-2 para reabastecer os frascos de 1.000 U/mL.
  4. Verificar a pureza das culturas de célula NK murino no dia 7 por citometria de fluxo com de marcadores específicos de célula NK20 usando preparações com mais de 95% de CD3–NK1.1+ população.

4. purificação e expansão de células NK primárias de

  1. Isole o PBMC por gradiente de densidade de buffy casacos de voluntários humanos saudáveis. Brevemente, cuidadosamente camada 35 mL de meio-diluído (com HBSS) células acima de 15 mL de gradiente de densidade em um tubo de 50 mL canônico. Centrifugar a 400 × g por 30 min a 20 ° C, em um rotor de balde balançando sem freio.
  2. Use os kits comerciais baseados em anticorpos seleção negativa para purificar as células NK primárias humanas de acordo com o protocolo do fabricante.
  3. Após o isolamento, determine a pureza de preparações de células NK por análises de imunofluorescência. Mancha de preparações de célula NK com 2 µ g/mL anti-CD3 e 2 anticorpos anti-CD56 de µ g/mL a 4 ° C por 20 min. lavar as células duas vezes com populações de células NK PBS determinadas pela ausência de CD3 e pela presença de CD56 na superfície das células.
  4. Incubar as preparações de células com anticorpos por 20 min a 4 ° C, lavar com PBS e analisar em um citômetro de fluxo. Usar preparações de célula NK com mais de 85% de20ensaios de pureza para a transdução de gene.

5. transdução de murino e humanas primárias células NK com lentivirus

  1. Suspender o mouse ou células NK primárias em uma placa de 24 em 0,5 × 105/mL de médio na presença de lentivirus GFP sobrenadante na multiplicidade de 5, 10 e 20 da infecção (MOI) e na presença de Pb (8 µ g/mL), PS (8 µ g/mL) ou dextrano (8 µ g/mL).
  2. Centrifugar as placas em 1.000 × g por 60 min.
  3. Sem decantação do sobrenadante, cultura de células durante a noite (16-18 h) em uma incubadora de 37 ° C, infundido com 5,2% CO2.
  4. Lavar com 10 mL de PBS e Resuspenda em 2 mL de meio de cultura completo RPMI1640 na presença de IL-2 (300 U/mL).
  5. Testar o ser humano e mouse primária citotoxicidade mediada por células NK contra K562 e YAC-1, respectivamente, através da realização de 51cromo (Cr)-ensaios de liberação em variaram proporções efetor-ao-alvo-célula22.
    1. Brevemente, dar 1 milhão alvo células 50 µCi de cromato de sódio radiolabeled 51Cr. Durante o tempo de incubação de 4-h, eles captação 51Cr em proteínas celulares. No final da incubação, lave as células para remover qualquer rótulo sem personalidade jurídica.
    2. Calcule o lysis da pilha do tumor específico pela quantidade de liberação absoluta, espontânea e experimental de 51Cr das células alvo.
      Nota: O cálculo da porcentagem de Lise específica das experiências de pentaplicate foi feito usando a seguinte equação: lise específicas % = ((51Cr significa libertação experimental - liberação espontânea média de 51Cr) / (51Cr dizer liberação máxima - 51Cr significa liberação espontânea)) х 100, onde "51significa liberação espontânea de Cr" é o 51Cr libertado nas células-alvo na ausência de células NK e "51liberação máxima média de Cr" é o 51Cr lançado a partir de células de destino após a Lise por 2 N de ácido clorídrico (HCl).
  6. As células NK transduzidas da colheita no dia 7 tocando suavemente os frascos.
    1. Ative as células colhidas com concentrações tituladas do mAb ligados a placa anti-NKG2D (A10) por revestimento de placas de poliestireno 96 poços, proteína altamente absorvente 2,5 µ g/mL as concentrações de mAb anti-NKG2D durante a noite.
    2. Cada um Lave bem com 100 µ l de PBS três vezes antes da adição do primárias células NK.
  7. Recolha os sobrenadantes de cultura usando uma pipeta multicanal entre 16 e 18 h pós-ativação para quantificação de citocinas como IFN-γ. Gere curvas padrão usando as citocinas recombinantes fornecidas com enzima-lig da imunoabsorção kits de ensaio (ELISA).
  8. Testar a viabilidade da célula NK usando anexina-V/7-amino-actinomicina D (7-AAD) coloração23 e determinar a porcentagem de células necróticas entre as células NK transformadas usando um citômetro de fluxo.
    1. Para executar este ensaio, colheita murino e humano NK células quatro dias depois de transdução, lave duas vezes com 10 mL de PBS frio em 500 × g por 5 min cada e incubar com um Annexin-V (PE) / kit de 7-AAD.
  9. Use software de citometria de fluxo adequado para analisar os dados. Selecione a população viver-pilha e analisar a expressão de GFP (canal FITC) como uma medida de transdução viral24.

Resultados

Dextrano induz a transferência do gene eficiente do vetor de Lentivirus em células NK primárias de murino e humanas

Células NK humanas foram isoladas e purificadas de PBMC (com uma pureza superior a 85%) e incubadas durante a noite com rIL-2 300 U/mL. Estas células NK primárias então foram transfectadas com lentivirus GFP em variadas multiplicidades de infecção (MOI; 3, 10 e 20 IU por célula) em placas de 24 poços na pre...

Discussão

Este estudo demonstra que o uso de dextran como um agente de polímero catiônico aprimora a eficiência de Lentivirus transdução de murino e humanas primária as células NK. Além disso, outros agentes catiônicos, como Pb ou PS, não tem nenhum efeito discernível sobre a entrega de vetores virais em células primárias humanas de NK. Anteriormente, foi demonstrado que o Pb pode aumentar transdução de gene humano de células T17. Estes resultados, no entanto, sugerem que Pb nem PS têm uma ...

Divulgações

Os autores afirmam que não há conflito de interesses financeiros.

Agradecimentos

Agradecemos a Lucia Sammarco e Lemonade Stand do seu Lulu para inspiração, motivação e apoio. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH R01 AI102893 e ICN R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); o Alex Lemonade Stand Foundation (S.M.); o programa HRHM do fundo MACC (S.M.; S.R.; MAGALHAES); Fundação da família de Nicholas (S.M.); a família de Gardetto (S.M.); os estudiosos de Hyundai Program (M.S.T.); Hyundai esperança sobre rodas (S.R.); o fundo do MACC (M.S.T. e S.M.); Instituto das crianças de pesquisa, MCW (S.R.); e o prêmio de Kathy Duffey Fogerty (M.J.R.).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
DextranSigma-Aldrich90-64-91-9
polybrene (Pb)Sigma-AldrichTR-1003
protamine sulfate (PS)Sigma-Aldrichp3369
TrypsinCorning25-052-CI
RPMI1640Corning10-040-CV
Fetal Bovine SerumATALANTAS11150
PenicillinCorning30-001-CI
B-mercaptoethanolSIGMAM3148
sodium pyruvateCorningMT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ )eBioscience14-7311-85
Propidium lodding staining solutionBD51-66211E
Lipofectamine 3000Thermo FisherL3000015
IsofluranePHOENIXNDC 57319-559-05
NK cell negative selection kitStem Cell19855
Yac-1ATCCTIB-160
K562ATCCCCL-243
MiceJakson664
293T cellsATCCCRL-3216
T75 flasksCornnig430641U
antibody-based negative selection kitsStem Cell19055
51Chromium (Cr)-release assaysperkin elmer'sNEZ030
ELISA kitsEbioscience00-4201-56
Sodium ButyrateSigma5887-5G
Linear polyethyleniminepolysciences23966-2
FicollGE Life Science17-1440-03
HBSSCorning21-022-CV

Referências

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