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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das Ziel dieser Studie war es, Technologien zu formulieren, die für erfolgreiche gen Transduktion in primären natürlichen killer (NK) Zellen ermöglichen. Die Dextran-vermittelten Lentivirale Transduktion von Mensch oder Maus primären NK Zellen führt zu höheren Wirkungsgraden der gen-Expression. Diese Methode des Gens Transduktion wird NK Zelle genetischen Manipulation erheblich verbessern.

Zusammenfassung

Die effizienteste Transduktion bestimmter Gene in natürlichen killer (NK)-Zellen ist eine große Herausforderung gewesen. Erfolgreiche Transductions sind entscheidend für die Bestimmung der Rolle des Gens von Interesse in der Entwicklung, Differenzierung und Funktion von NK-Zellen. Die jüngsten Fortschritte im Zusammenhang mit Chimären Antigen-Rezeptoren (Autos) im Krebsimmuntherapie betonen die Notwendigkeit für eine effiziente Methode zu exogenen Gene Effektor Lymphozyten liefern. Die Wirkungsgrade von Lentivirale vermittelte gen Transductions in primären Mensch oder Maus-NK-Zellen bleiben deutlich niedriger, was ein wichtiger begrenzender Faktor. Die jüngsten Fortschritte mit kationischen polymeren, z. B. Polybrene, zeigen eine verbesserte gen Transduktion Effizienz in T-Zellen. Doch scheiterte dieser Produkte, die Transduktion Wirkungsgrade von NK-Zellen zu verbessern. Diese Arbeit zeigt, dass Dextran, verzweigte Glucan Polysaccharid, verbessert erheblich die Transduktion Effizienz von Mensch und Maus primären NK-Zellen. Dieser hoch reproduzierbare Transduktion Methodik bietet ein kompetenter Werkzeug für transducing menschliche primäre NK-Zellen, die klinischen gen Lieferung Anwendungen und somit NK-Zell-basierte Krebs-Immuntherapie. erheblich verbessern können

Einleitung

Natürliche killer (NK)-Zellen sind die großen lymphatischer Bevölkerung des angeborenen Immunsystems1. NK-Zellen fungieren als Erstlinien Verteidiger der Host Immunantwort gegen Tumoren und Infektionen2,3,4. NK-Zellen spielen auch eine zentrale Rolle bei der Entwicklung der Toleranz durch die Sekretion von potenten Zytokine und Chemokine5. Aufgrund ihrer starken Fähigkeit, gezielt zu beseitigen Tumorzellen werden mehrere klinische Studien durchgeführt, um Spender-abgeleitete menschliche NK-Zellen als eine Adoptive Immuntherapie bei Krebs6,7zu bewerten. Im Gegensatz zu T-Zellen muss der Entwicklungsbiologie von NK-Zellen noch gut charakterisierten8. Diese Unkenntnis ist teilweise wegen fehlender effizienter Techniken, die Gene von Interesse an Maus oder menschliche primäre NK-Zellen zu liefern. Aus diesen Gründen haben die meisten NK-Zell in Zell-Linien, anstatt in Primärzellen Studien. Daher ist die Notwendigkeit für ein zuverlässiges und effizientes Protokoll zum primären NK-Zellen mit Genen von Interesse transduzieren entscheidend.

Das übergeordnete Ziel dieser Studie war es, eine konsistente und zuverlässige Methode zu formulieren, mit der primären menschlichen oder murine NK-Zellen mit Lenti oder Retroviren ausgestrahlt werden könnte.

Frühere Studien, die versuchten, dieses Problem zu beheben wurden durchgeführt, weitgehend über die vorübergehende Umwandlung von primären NK-Zellen. Dazu gehören Plasmid Transfektion9,10, Epstein - Barr-Virus (EBV) / retrovirale Hybrid Vektor11, "Vaccinia" Vektoren12,13und Ad5/F35 Chimären adenovirale Vektoren14. Trotz der bescheidenen Wirkungsgrad dieser Techniken macht die vergängliche Natur der Transduktion sie ungeeignet für die langfristige Nutzung von gentechnisch veränderten NK-Zellen. Einige neuere Studien haben retrovirale Vektoren verwendet, um transduzieren NK-Zellen, erfordern mehrere Zyklen der Infektion auf ein akzeptables Niveau der gen-Expression-11,-15zu erreichen. Im Gegensatz zur retroviralen Vektoren können Lentivirale Vektoren Wirtszelle nuclear Import Maschinen die virale Vorintegration Komplex translozieren in den Zellkern. Dies ist ein großer limitierender Faktor bei der Replikation des Virus in nicht-teilenden Zellen, die primäre NK-Zellen enthalten.

Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Rezeptoren der Zelloberfläche und virale Partikel erlauben virale Aufnahme in die Zelle. Die ersten Kämpfe zwischen der Virushülle Proteine und ihre Verwandten Host-Rezeptoren könnte wegen der potenziellen negativen Ladungen zwischen diesen beiden bestehenden beschränkt werden. Das Grundprinzip hinter vielen Transduktion Techniken ist, dass die Zugabe von kationischen polymeren, z. B. Polybrene (Pb), Protamin Sulfat (PS) oder Dextran, könnte eine positive Ladung an die Rezeptoren der Zelloberfläche und damit die Bindung der Virushülle ergänzen Proteine. Dies erhöht die Fusion-Effizienz und die Aufnahme der viralen Partikel von den Zellen16. Obwohl es berichtet wurde, dass Pb oder PS Gentransfer in T Zellen17verbessern kann, ihre Anwendung nicht in die Transduktion Effizienz der primären NK-Zellen auswirken. Darüber hinaus wurde eine vergleichende Analyse zwischen dieser Reagenzien mit primären NK-Zellen nicht durchgeführt. In dieser Studie wurden die Transduktion Wirkungsgrade der drei kationische Polymere verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass unter diesen drei kationischen polymeren nur Dextran effiziente virale Transduktion in Maus und menschliche primäre NK-Zellen deutlich erhöht.

Protokoll

Alle tierischen Protokolle folgten die humane und ethische Behandlung der Tiere und durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) in Biomedical Research Center (BRC) des Medical College of Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI angenommen wurden. Die Verwendung von menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) wurde durch die institutionelle Review Board (IRB) des Blut-Forschungsinstituts der Blut von Wisconsin, Milwaukee, WI genehmigt.

(1) Mäuse, Zell-Linien und Vektoren

  1. Kommerzielle Anbieter C57BL/6 Mäusen einzuholen. Warten Sie die Maus-Kolonien in Pathogen-freies Bedingungen und verwenden Sie weibliche und männliche Mäuse im Alter von 6 bis 12 Wochen. Anonymisierte menschlichen PBMCs von IRB genehmigten Quellen erhalten.
  2. Betäuben Sie die Tiere mit einer Mischung aus 20-30 % V/V Isofluran in Propylenglykol (1, 2-Propandiol, USP Klasse) um die Mäuse zu betäuben. Gelten Sie Tierarzt Salbe für die Augen, um Trockenheit zu verhindern, während sich die Mäuse unter Narkose.
  3. Um die Tiere einschläfern, führen Sie durch zervikale Dislokation nach Induktion der Anästhesie.
    1. Zurückhalten Sie, die Mäuse durch das Fest der Schwanzwurzel mit einer Hand greifen. Legen Sie einen stabilen Stock-Typ Stift oder Daumen und Zeigefinger der anderen Hand gegen die Rückseite des Halses, an der Basis des Schädels.
    2. Um die Versetzung zu erzeugen, drücken Sie die Hand Ruhigstellung, die der Kopf des Tieres nach vorne und drücken nach unten und ziehen Sie mit der Hand die Rute Basis rückwärts. Überprüfung der Effektivität der Luxation durch Abtasten eine Trennung der zervikalen Gewebe.
  4. Halten Sie die Tiere in der Kammer/Käfig mindestens 5 min lang und entfernen Sie sie nur, wenn Atmungsaktivität nicht vorhanden ist oder wenn es ein Mangel nachweisbar Herzschlag.
  5. K562 und YAC-1 Zellen von kommerziellen Anbietern erhalten und pflegen sie in RPMI1640 Medium mit 10 % Hitze-inaktivierten FBS. Testen Sie diese Zell-Linien in regelmäßigen Abständen zu Mykoplasmen Kontamination auszuschließen.

2. Vorbereitung und Titration der Lentivirale Vektoren

  1. Zellkulturen 5 × 106 293T über Nacht in einem T75 cm2 Kolben mit einer Lösung von 20 mL RPMI1640 Medium mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin, 1 mM Natrium Pyruvat, 5 % 7,5 % Natriumbicarbonat Lösung und 0,001 % Β-Mercaptoethanol. Legen Sie die Flasche in einem 37 ° C Inkubator mit 5,2 % CO2infundiert.
  2. Ernte der 293T Zellen mittels Trypsin (0.025%)/EDTA (1 mM) in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Fügen Sie 5 mL Trypsin/EDTA in PBS und inkubieren Sie die Flaschen für 10 min in einem 37 ° C Inkubator auf die Ablösung der 293T Zellen aus den T75 cm2 Kolben ermöglichen.
    1. Sammeln Sie die freistehenden Zellen zu, und waschen Sie sie zweimal in PBS, entfernen alle Spuren von Trypsin und EDTA. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer und passen Sie die Anzahl von Zellen auf 1 Million Zellen pro mL.
  3. Die 293T Zellen18 mit 3,95 µg psPAX2, 1,32 µg pMD2G und 5,26 µg pLEP-GFP-Puro (generiert intern bei BRI durch Klonen EF1alpha Veranstalter von pWPI anstelle von einem CMV-Promotor in pLenti CMV-GFP-Puro) transfizieren19.
    1. Bereiten Sie 1 mL 150 mM NaCl plus 63 µL 0,6 mg/mL Polyethylenimine (PEI; 25.000 kD, linear). Gut verrühren und dann die Plasmiden hinzufügen und mischen. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie und fügen Sie ihn zu den Zellen.
    2. 16 h nach Transfektion, ersetzen die Transfektion Medium mit frischem Medium plus 4,5 mM Natrium Butyrat. Ernten Sie Virus 48 h nach Transfektion mit Überstand zu und zu konzentrieren Sie, indem über Nacht Zentrifugation bei 5.000 × g. Siehe Tabelle der Materialien.
  4. Bestimmen Sie die virale Titer mit 293T Zellen durch Ausführen von Verdünnungsreihen und assay Flow Cytometry 72 h nach Transduktion20. Verwenden Sie den Ausdruck des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) als eine Maßnahme, um die virale Titer zu quantifizieren.

3. Reinigung und Ausbau der murinen primäre NK-Zellen

  1. Murine primäre NK Zellen21zu reinigen. Kurz gesagt, pass einzellige Milz Suspensionen durch Nylon Wolle Spalten, die anhaftende Bevölkerung bestehend aus B-Zellen und Makrophagen zum Abbau.
  2. Kultur-anhaftende Populationen aus Nylon Wolle Spalte eluiert, das murine NK-Zellen mit 1.000 U/mL Interleukin (IL)-2 in RPMI1640 Medium mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin, 1 mM Natrium Pyruvat, 5 % 7,5 % Natriumbicarbonat enthält Lösung und 0,001 % β-Mercaptoethanol (RPMI1640 komplette Medium).
  3. Ändern Sie das Medium aus den Kolben am 4. Tag dieser Kultur, die nicht-anhaftende T und NKT-Zellen zu entfernen; Zellen, die den Kolben eingehalten bleiben sind weitgehend NK-Zellen. Fügen Sie 20 mL frisches RPMI1640 komplette Medium und 1.000 U/mL IL-2, die Flaschen wieder aufzufüllen.
  4. Überprüfen Sie die Reinheit der murinen NK-Zellkulturen am 7. Tag von Durchflusszytometrie mit NK zellspezifische Marker20 mehr als 95 % der CD3 Vorbereitungen mit–NK1.1+ Bevölkerung.

4. Reinigung und Erweiterung der menschlichen primäre NK-Zellen

  1. Isolieren Sie PBMCs von Dichtegradienten von buffy Coats von gesunden Freiwilligen. Kurz, sorgfältig Schicht 35 mL Hälfte verdünnt (mit HBSS) Zellen über 15 mL Dichtegradient in eine kanonische 50-mL-Tube. Zentrifugieren Sie bei 400 × g für 30 min bei 20 ° C in einem schwingenden Eimer Rotor ohne Bremse.
  2. Verwenden Sie die kommerzielle Antikörper-basierten negative Auslese-Kits menschliche primäre NK-Zellen nach Protokoll des Herstellers zu reinigen.
  3. Im Anschluss an die Isolation bestimmen Sie die Reinheit der NK-Zelle-Vorbereitungen durch Immunfluoreszenz Analysen. Färben Sie NK Zelle Vorbereitungen mit 2 µg/mL Anti-CD3 und 2 µg/mL Anti-CD56-Antikörper bei 4 ° C für 20 min. Waschen der Zellen zweimal mit PBS NK-Zell-Populationen durch das Fehlen von CD3 und das Vorhandensein von CD56 auf der Zelloberfläche bestimmt.
  4. Die Zelle Vorbereitungen mit Antikörpern für 20 min bei 4 ° C inkubieren, waschen mit PBS, und in einem Durchflusszytometer analysiert. NK Zelle Präparate mit mehr als 85 % Reinheit für die gen-Transduktion20Proben.

(5) Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen mit lentivirus

  1. Maus oder menschliche primäre NK-Zellen in einer 24-Well-Platte bei 0,5 × 105/mL des Mediums im Beisein von GFP Lentivirus Überstand auf 5, 10 und 20 Multiplizität der Infektion (MOI) und in Anwesenheit von Pb aussetzen (8 µg/mL), PS (8 µg/mL) oder Dextran (8 µg/mL).
  2. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1000 × g 60 min.
  3. Ohne Umfüllen des Überstands, Kultur der Zellen über Nacht (16-18 h) in einem 37 ° C Inkubator infundiert mit 5,2 % CO2.
  4. Mit 10 mL PBS waschen und in 2 mL des kompletten RPMI1640 Kulturmedium in Anwesenheit von IL-2 Aufschwemmen (300 U/mL).
  5. Testen der Mensch und Maus primären NK zellvermittelte Zytotoxizität gegenüber K562 und YAC-1, bzw. durch Ausführen von 51Chrom (Cr)-Release Assays auf abwechslungsreiche Effektor-Zielzelle Verhältnisse22.
    1. Kurz gesagt, geben Sie 1 Million Ziel Zellen 50 µCi radioaktiven Natrium Chromat 51Cr. Während der Inkubationszeit von 4-h sie Aufnahme 51Cr in zelluläre Proteine. Am Ende der Inkubation Waschen der Zellen, um eine nicht rechtsfähige Etikett zu entfernen.
    2. Berechnen Sie spezifische Tumor Zelle lyse durch die Menge der absolute, spontan und experimentelle Freisetzung von 51Cr aus den Zielzellen.
      Hinweis: Die Berechnung des Prozentsatzes der spezifische lyse von Pentaplicate Experimente erfolgte unter Verwendung der folgenden Gleichung: % spezifische lyse = ((51Cr meine Freisetzungsversuch - 51Cr bedeuten spontane Freisetzung) / (51meine Cr maximale Freigabe - 51Cr meine spontane Freisetzung)) х 100, wo "51Cr bedeuten spontane Freisetzung" 51Cr von Zielzellen in Ermangelung von NK-Zellen befreit und "51Cr mittlere maximale Freigabe" ist die 51Cr veröffentlicht von Zielzellen nach lyse von 2 N Salzsäure (HCl).
  6. Ernten Sie die transduced NK-Zellen am 7. Tag durch leichtes Klopfen die Kolben.
    1. Aktivieren Sie die geernteten Zellen mit einer betitelten Platte gebundene Anti-NKG2D (A10) mAb durch die Beschichtung 96-Well, Protein Hochabsorbierendes Polystyrol-Platten mit 2,5 µg/mL-Konzentrationen des Anti-NKG2D mAb über Nacht.
    2. Waschen Sie jeweils gut mit 100 µL PBS dreimal vor der Zugabe von primären NK-Zellen.
  7. Sammeln Sie Kultur Überstände mit einer Multi-Kanal-Pipette zwischen 16 und 18 h nach Aktivierung, Zytokinen wie IFN-γ zu quantifizieren. Generieren Sie Standardkurven mit der rekombinanten Zytokine mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) Kits zur Verfügung gestellt.
  8. Testen Sie der NK Zellviabilität mit annexin-V/7-amino-Actinomycin D (7-AAD) Färbung23 und bestimmen Sie den Prozentsatz der nekrotischen Zellen unter den transformierten NK-Zellen mit einem Durchflusszytometer.
    1. Um diesen Test durchzuführen, Ernte der murine und menschlichen NK Zellen vier Tage nach Transduktion, zwei Mal mit 10 mL kaltem PBS 500 × g für 5 min waschen und inkubieren Sie es mit einem Annexin V (PE) / 7-AAD Kit.
  9. Verwenden Sie geeignete Flow Cytometry Software zum Analysieren der Daten. Wählen Sie die live-Zell-Population und analysieren Sie den Ausdruck der GLP (FITC Kanal) als Maß für die virale Transduktion24zu.

Ergebnisse

Dextran induziert die effiziente Gentransfer Lentivirale Vektor in primären menschlichen und murinen NK-Zellen

Menschlichen NK-Zellen wurden isoliert und gereinigt von PBMC (mit einer Reinheit von mehr als 85 %) und über Nacht mit rIL-2 300 U/mL inkubiert. Diese primäre NK-Zellen wurden dann mit GFP Lentivirus am abwechslungsreichen Mannigfaltigkeiten der Infektion ausgestrahlt (MOI; 3, 10 und 20 IU pro Zelle) in 24-Well-Platten...

Diskussion

Diese Studie zeigt, dass die Verwendung von Dextran als ein kationisches Polymer-Agent die Lentivirale Transduktion Effizienz der murinen und menschliche primäre NK-Zellen verbessert. Darüber hinaus haben andere kationische Mittel, wie Pb oder PS, keinen erkennbaren Einfluss auf die Lieferung von viralen Vektoren in menschliche primäre NK-Zellen. Zuvor wurde nachgewiesen, dass Pb gen Transduktion in menschlichen T-Zellen-17ergänzen kann. Diese Ergebnisse zeigen jedoch, dass weder Pb noch PS ei...

Offenlegungen

Die Autoren behaupten keine finanziellen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir danken Lucia Sammarco und ihr Lulus Lemonade Stand für Inspiration, Motivation und Unterstützung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH R01 AI102893 und NCI R01 CA179363 (S.M) unterstützt; NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI-1R01CA164225 (L.W); der Alex Lemonade Stand Foundation (S.M.); Das HRHM-Programm des MACC Fonds (S.M.; S.R.; M.S.T); die Nikolaus-Familienstiftung (S.M.); Gardetto Familie (S.M.); die Hyundai-Gelehrten Programm (M.S.T.); Hyundai Hoffnung auf Rädern (S.R.); die MACC-Fonds (M.S.T. und S.M.); die Kinder-Forschungsinstitut, MCW (S.R.); und Kathy Duffey Fogerty Award (M.J.R.).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
DextranSigma-Aldrich90-64-91-9
polybrene (Pb)Sigma-AldrichTR-1003
protamine sulfate (PS)Sigma-Aldrichp3369
TrypsinCorning25-052-CI
RPMI1640Corning10-040-CV
Fetal Bovine SerumATALANTAS11150
PenicillinCorning30-001-CI
B-mercaptoethanolSIGMAM3148
sodium pyruvateCorningMT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ )eBioscience14-7311-85
Propidium lodding staining solutionBD51-66211E
Lipofectamine 3000Thermo FisherL3000015
IsofluranePHOENIXNDC 57319-559-05
NK cell negative selection kitStem Cell19855
Yac-1ATCCTIB-160
K562ATCCCCL-243
MiceJakson664
293T cellsATCCCRL-3216
T75 flasksCornnig430641U
antibody-based negative selection kitsStem Cell19055
51Chromium (Cr)-release assaysperkin elmer'sNEZ030
ELISA kitsEbioscience00-4201-56
Sodium ButyrateSigma5887-5G
Linear polyethyleniminepolysciences23966-2
FicollGE Life Science17-1440-03
HBSSCorning21-022-CV

Referenzen

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