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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo di questo studio era quello di formulare le tecnologie che permettono per la trasduzione del gene successo in primarie cellule natural killer (NK). La trasduzione lentivirale destrano-mediata di umani o risultati primari di cellule NK del mouse in una maggiore efficienza di espressione genica. Questo metodo di trasduzione del gene migliorerà notevolmente la manipolazione genetica delle cellule NK.

Abstract

La trasduzione efficiente di specifici geni in cellule natural killer (NK) è stata una sfida importante. Trasduzioni successo sono fondamentali per definire il ruolo del gene di interesse per lo sviluppo, la differenziazione e la funzione delle cellule NK. Gli avanzamenti recenti legati ai recettori chimerici antigene (automobili) nell'immunoterapia del cancro accentuano la necessità di un metodo efficiente trasportare geni esogeni di linfociti effettori. Le efficienze di trasduzioni lentivirali-mediata del gene in primari umani o cellule NK del mouse rimangano significativamente basse, che è un importante fattore limitante. Gli avanzamenti recenti utilizzando polimeri cationici, quali polybrene, mostrano un'efficienza di trasduzione migliorata gene in cellule di T. Tuttavia, questi prodotti non è riuscito a migliorare l'efficienza di trasduzione delle cellule NK. Questo lavoro mostra che destrano, un polisaccaride ramificato glucano, migliora notevolmente l'efficienza di trasduzione dell'essere umano e cellule NK primarie del topo. Questa metodologia di trasduzione altamente riproducibili fornisce uno strumento competente per trasdurre umano primarie cellule NK, che possono migliorare notevolmente le applicazioni cliniche gene consegna e così immunoterapia dei tumori basati su cellule NK.

Introduzione

Cellule natural killer (NK) sono la popolazione linfocitaria principale del sistema immunitario innato1. Le cellule NK funzionano come i difensori di prima linea della risposta immunitaria contro i tumori e infezioni2,3,4. Le cellule NK svolgono un ruolo centrale nello sviluppo di tolleranza attraverso la secrezione di potenti citochine e chemochine5. Grazie alla loro potente capacità di mirare ed eliminare le cellule tumorali, test clinici multipli vengono condotte per valutare donatore-derivati di cellule NK umane come un'immunoterapia adottiva per cancro6,7. Contrariamente alle cellule di T, la biologia dello sviluppo delle cellule di NK ha ancora essere ben caratterizzati8. Questa mancanza di conoscenza è parzialmente dovuto alla mancanza di tecniche efficienti che consegnare i geni di interesse al mouse o cellule NK primarie. Per questi motivi, la maggior parte delle cellule NK studi condotti in linee cellulari, piuttosto che in cellule primarie. Pertanto, la necessità di un protocollo affidabile ed efficiente di trasdurre primarie cellule NK con geni di interesse è fondamentale.

L'obiettivo generale di questo studio era di formulare un metodo coerente e affidabile con cui le cellule NK umane o murine primarie potrebbero essere trasdotte con lenti - o retrovirus.

Sono stati effettuati studi precedenti che hanno tentato di risolvere questo problema, in gran parte utilizzando la trasformazione transitoria primarie delle cellule di NK. Questo include il plasmide transfezione9,10, Virus di Epstein - Barr (EBV) / ibrido retroviral vector11, vaccinia virus file vettoriale12,13e Ad5/F35 vettori adenovirali chimerico14. Nonostante la modesta efficienza di queste tecniche, la natura transitoria della trasduzione li rende inadatti per l'utilizzo a lungo termine delle cellule NK geneticamente modificate. Alcuni studi recenti hanno utilizzato vettori retrovirali trasduce le cellule NK, che richiedono più cicli di infezione per raggiungere un livello accettabile di espressione genica11,15. In contrasto con vettori retrovirali, vettori lentivirali possono utilizzare macchinari di importazione nucleare cellula ospite per il complesso di pre-integrazione virale di traslocano nel nucleo. Si tratta di un importante fattore limitante nella replicazione del virus nelle cellule di divisione, che comprendono le cellule NK primarie.

Interazioni tra diversi recettori della superficie cellulare e particelle virali consentono l'assorbimento virale nella cellula. L'iniziali impegni fra le proteine dell'envelope virale ed i loro ricevitori cognate host potrebbero essere limitati a causa del potenziale cariche negative esistenti tra questi due. La spiegazione razionale dietro molte tecniche di trasduzione è che l'aggiunta di polimeri cationici, quali polybrene (Pb), solfato di protamina (PS) o destrano, potrebbe dare una carica positiva per i recettori della superficie cellulare e quindi aumentare l'associazione dell'envelope virale proteine. Ciò aumenterà l'efficienza di fusione e l'assorbimento delle particelle virali dai cellule16. Anche se è stato segnalato che Pb o PS può migliorare il trasferimento genico in cellule T17, loro applicazione non ha alcun effetto dell'efficienza di trasduzione delle cellule NK primarie. Inoltre, non è stata eseguita un'analisi comparativa tra questi reagenti utilizzando cellule NK primarie. In questo studio, sono state confrontate le efficienze di trasduzione dei tre polimeri cationici. I risultati mostrano che, tra questi tre polimeri cationici, solo destrano migliora significativamente efficiente trasduzione virale in cellule NK primarie sia il mouse.

Protocollo

Tutti i protocolli degli animali ha seguito il trattamento umano ed etico degli animali e sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) all'interno di centro di ricerca biomedica (BRC) del Medical College of Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. L'uso delle cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMC) è stato approvato da istituzionale Review Board (IRB) dell'Istituto di ricerca sangue sangue centro di Wisconsin, Milwaukee, WI.

1. topi, linee cellulari e vettori

  1. Ottenere topi C57BL/6 dai fornitori commerciali. Mantenere le colonie del mouse in condizioni esenti da patogeni e utilizzare topi femminili e maschi fra le età di 6 e 12 settimane. Ottenere PBMCs umano de-identificata da fonti approvato IRB.
  2. Anestetizzare gli animali con una miscela di 20-30% v/v isoflurane in propilene glicole (1, 2-propandiolo, grado di USP) per anestetizzare i topi. Applicare unguento veterinario agli occhi per prevenire la secchezza mentre i topi sono sotto anestesia.
  3. Per l'eutanasia degli animali, eseguire dislocazione cervicale dopo l'induzione dell'anestesia.
    1. Trattenga i topi afferrando saldamente la base della coda con una mano. Posizionare una robusto bastone-tipo penna o il pollice e l'indice di altra mano contro la parte posteriore del collo, alla base del cranio.
    2. Per produrre la dislocazione, spingere la mano trattenente la testa dell'animale in avanti e spinta verso il basso mentre si tira indietro con la mano che tiene la coda base. Verificare l'efficacia della dislocazione di sensibilità per una separazione del tessuto cervicale.
  4. Tenere gli animali in camera/gabbia per almeno 5 min e rimuoverli solo quando l'attività respiratoria è assente o quando c'è una mancanza di un battito rilevabile.
  5. Ottenere cellule K562 e YAC-1 dai fornitori commerciali e mantenerli in RPMI1640 mezzo contenente 10% FBS inattivati al calore. Prova queste linee cellulari periodicamente per escludere la possibilità di contaminazione del micoplasma.

2. preparazione e titolazione di vettori lentivirali

  1. 5 × 106 293T cellule durante la notte in una boccetta di2 cm T75 contenente una soluzione di 20 mL di terreno di RPMI1640 con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina, piruvato di sodio di 1 mM, 5% di soluzione di bicarbonato di sodio 7,5% e 0,001% Β-mercaptoetanolo. Collocare la beuta in un incubatore a 37 ° C infuso con 5,2% CO2.
  2. Raccogliere le cellule 293T usando tripsina (0.025%)/EDTA (1 mM) in tampone fosfato salino (PBS). Aggiungere 5 mL di tripsina/EDTA in PBS e incubare le beute per 10 min in un 37 ° C un'incubatrice per consentire il distacco delle cellule 293T dai palloni T75 cm2 .
    1. Raccogliere le cellule indipendenti e lavare due volte in PBS per rimuovere eventuali tracce di tripsina ed EDTA. Contare le celle con un emocitometro e regolare il numero di cellulare per 1 milione di cellule per mL.
  3. Transfect 293T cellule18 con 3.95 µ g di psPAX2, 1,32 µ g di pMD2G e 5,26 µ g di pLEP-GFP-Puro (generato internamente in BRI clonando promotore di EF1alpha da pWPI al posto di un promotore di CMV in pLenti CMV-GFP-Puro)19.
    1. Preparare 1 mL di NaCl 150 mM con 63 µ l di 0,6 mg/mL polyethylenimine (PEI; 25.000 kD, lineare). Mescolare bene e poi aggiungere i plasmidi e mescolare. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente e poi aggiungerlo alle cellule.
    2. Post-transfezione 16 h, sostituire il mezzo di transfezione con medium fresco più butirrato di sodio 4,5 mM. Raccogliere il supernatante contenente virus 48h post-di transfezione e concentrato mediante centrifugazione durante la notte a 5.000 × g. Vedere la tabella materiali.
  4. Determinare i titoli virali utilizzando cellule 293T effettuando diluizioni seriali e di analisi di flusso cytometry 72 h post-traduzionali20. Utilizzare l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) come misura per quantificare i titoli virali.

3. purificazione e l'espansione delle cellule NK primarie murine

  1. Purificare murino primario di cellule NK21. Passare brevemente, sospensioni unicellulari milza attraverso colonne di lana di nylon per vuotare le popolazioni aderenti costituito da macrofagi e linfociti B.
  2. Cultura le popolazioni non-aderenti eluite dalla colonna di lana di nylon che contiene cellule murine di NK con 1.000 U/mL interleuchina (IL) -2 nel mezzo di RPMI1640 con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina, piruvato di sodio di 1 mM, 5% 7,5% di bicarbonato di sodio soluzione e 0,001% β-mercaptoetanolo (RPMI1640 completa medio).
  3. Modificare il mezzo dai palloni il giorno 4 di questa cultura per rimuovere l'antiaderente T e le cellule NKT; le cellule che restano rispettate le beute sono in gran parte delle cellule NK. Aggiungere 20 mL di terreno completo di nuovo RPMI1640 e 1.000 U/mL IL-2 per ricostituire le beute.
  4. Verificare la purezza delle colture cellulari NK murine il giorno 7 di citometria a flusso con NK marcatori di cellula-specifico20 utilizzando preparazioni con oltre il 95% di CD3–NK1.1+ popolazione.

4. purificazione e l'espansione umane primarie delle cellule di NK

  1. Isolare PBMCs mediante gradiente di densità dai cappotti buffy di volontari umani sani. Brevemente, attentamente il livello 35 mL di diluito a metà (con HBSS) cellule oltre 15 mL del gradiente di densità in un tubo canonico 50 mL. Centrifugare a 400 × g per 30 min a 20 ° C in un rotore oscillante senza freno.
  2. Utilizzare i kit commerciali basati su anticorpi negativi selezione per purificare cellule NK umane primarie secondo il protocollo del produttore.
  3. In seguito l'isolamento, è necessario determinare la purezza delle preparazioni delle cellule NK dalle analisi di immunofluorescenza. Macchia le cellule preparazioni di cellule NK con 2 µ g/mL anti-CD3 e gli anticorpi anti-CD56 a 2 µ g/mL a 4 ° C per 20 min. lavare due volte con popolazioni di cellule NK PBS determinate dall'assenza di CD3 e la presenza di CD56 sulla superficie delle cellule.
  4. Incubare le preparazioni di cellule con anticorpi per 20 min a 4 ° C, lavate con PBS e analizzare in un citometro a flusso. Utilizzare preparazioni di cellule NK con più di 85% di purezza per la trasduzione del gene analisi20.

5. trasduzione delle cellule NK primarie murine ed umane con lentivirus

  1. Sospendere il mouse o cellule NK umane primarie in una piastra a 24 pozzetti in 0,5 × 105/ml di medium in presenza dei lentivirus GFP surnatante a 5, 10 e 20 molteplicità di infezione (MOI) e in presenza di Pb (8 µ g/mL), PS (8 µ g/mL) o destrano (8 µ g/mL).
  2. Centrifugare le piastre a 1.000 × g per 60 min.
  3. Senza decantare il supernatante, coltura le cellule durante la notte (16-18 h) in un incubatore a 37 ° C infuso con 5,2% CO2.
  4. Lavare con 10 mL di PBS e risospendere in 2 mL di terreno di coltura RPMI1640 completo in presenza di IL-2 (300 U/mL).
  5. Prova l'essere umano e del mouse primaria Citotossicità cellulo-mediata di NK contro K562 e YAC-1, rispettivamente eseguendo 51cromo (Cr)-saggi di rilascio al vario rapporti effettrici delle cellule bersaglio22.
    1. Brevemente, dare 1 milione bersaglio cellule 50 µ ci di radioattivo sodio cromato 51Cr. Durante il periodo di incubazione di 4-h, l'assorbimento del 51Cr in proteine cellulari. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule per rimuovere qualsiasi etichetta non incorporata.
    2. Lisi delle cellule tumorali specifici per calcolare la quantità di rilascio assoluto, spontanea e sperimentale di 51Cr da cellule bersaglio.
      Nota: Il calcolo della percentuale di lisi specifiche da esperimenti di pentaplicate è stato fatto usando la seguente equazione: Lisi specifiche % = ((51Cr significa emissione sperimentale - rilascio spontaneo media di 51Cr) / (51Cr significa massimo rilascio - 51Cr dire rilascio spontaneo)) х 100, dove "51media rilascio spontaneo Cr" è il 51Cr rilasciato da cellule bersaglio in assenza di cellule NK e "51rilascio massima media di Cr" è il 51Cr Pubblicato da cellule bersaglio su lisi di N 2 l'acido cloridrico (HCl).
  6. Raccogliere le cellule NK trasdotte il giorno 7 toccando delicatamente le beute.
    1. Per attivare le cellule prelevate con concentrazioni titolate di mAb associato a piastra anti-NKG2D (A10), rivestimento lastre di polistirene 96 pozzetti, altamente proteico-assorbente con concentrazioni di 2,5 µ g/mL di mAb anti-NKG2D durante la notte.
    2. Lavare ogni bene con 100 µ l di PBS tre volte prima dell'aggiunta delle cellule NK primarie.
  7. Raccogliere i surnatanti utilizzando una pipetta multicanale tra 16 e 18 h post-attivazione di quantificare citochine quali IFN-γ. Generare le curve standard utilizzando le citochine ricombinanti fornite con i kit di analisi (ELISA) enzima-collegata dell'immunosorbente.
  8. Verificare l'attuabilità delle cellule NK utilizzando Annessina-V/7-amino-actinomicina D (7-AAD) colorazione23 e determinare la percentuale di cellule necrotiche fra le cellule NK trasformate utilizzando un citometro a flusso.
    1. Per eseguire questo test, raccolta cellule NK murine ed umane quattro giorni dopo la trasduzione, lavare due volte con 10 mL di PBS freddo a 500 × g per 5 minuti ciascuno e incubare con un Annessina-V (PE) / kit 7-AAD.
  9. Utilizzare software di citometria a flusso appropriato per analizzare i dati. Selezionare la popolazione di cellule vive e analizzare l'espressione della GFP (canale FITC) come misura di trasduzione virale24.

Risultati

Destrano induce il trasferimento del gene efficiente del vettore lentivirale in cellule NK primarie umane e murine

Cellule NK umane erano isolate e purificate da PBMC (con una purezza superiore al 85%) e incubate durante la notte con rIL-2 300 U/mL. Queste cellule NK primarie erano quindi trasdotte con lentivirus GFP a variegata molteplicità di infezione (MOI; 3, 10 e 20 UI per cella) in piastre da 24 pozzetti in presenza di 8 µ ...

Discussione

Questo studio dimostra che l'uso di destrano come un agente di polimero cationico migliora l'efficienza di trasduzione lentivirale sia murine ed umane primarie delle cellule di NK. Inoltre, altri agenti cationici, quali Pb o PS, non avere alcun effetto visibile sulla fornitura di vettori virali in cellule NK primarie. In precedenza, è stato dimostrato che il Pb può aumentare trasduzione del gene umano di cellule T17. Questi risultati, tuttavia, indicano che Pb né PS hanno una simile efficienza ...

Divulgazioni

Gli autori non sostengono nessun conflitto di interessi finanziario.

Riconoscimenti

Ringraziamo Lucia Sammarco e sua Lulu limonata Stand per ispirazione, motivazione e supporto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NIH R01 AI102893 e NCI R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); l'Alex Lemonade Stand della Fondazione (S.M.); il programma HRHM del fondo MACC (S.M.; S.R.; MANGIAGLI); la Fondazione di famiglia Nicholas (S.M.); la famiglia Gardetto (S.M.); gli studiosi di Hyundai programmare (M.S.T); Hyundai speranza su ruote (S.R.); il fondo MACC (M.S.T e S.M.); Istituto di ricerca dei bambini, MCW (S.R.); e il premio di Kathy Duffey Fogerty (M.J.R.).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
DextranSigma-Aldrich90-64-91-9
polybrene (Pb)Sigma-AldrichTR-1003
protamine sulfate (PS)Sigma-Aldrichp3369
TrypsinCorning25-052-CI
RPMI1640Corning10-040-CV
Fetal Bovine SerumATALANTAS11150
PenicillinCorning30-001-CI
B-mercaptoethanolSIGMAM3148
sodium pyruvateCorningMT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ )eBioscience14-7311-85
Propidium lodding staining solutionBD51-66211E
Lipofectamine 3000Thermo FisherL3000015
IsofluranePHOENIXNDC 57319-559-05
NK cell negative selection kitStem Cell19855
Yac-1ATCCTIB-160
K562ATCCCCL-243
MiceJakson664
293T cellsATCCCRL-3216
T75 flasksCornnig430641U
antibody-based negative selection kitsStem Cell19055
51Chromium (Cr)-release assaysperkin elmer'sNEZ030
ELISA kitsEbioscience00-4201-56
Sodium ButyrateSigma5887-5G
Linear polyethyleniminepolysciences23966-2
FicollGE Life Science17-1440-03
HBSSCorning21-022-CV

Riferimenti

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