Dextrane augmente l’efficacité de la Transduction des gènes des cellules NK primaires murines et humaines

Résumé

L’objectif de cette étude était de formuler des technologies permettant la transduction réussie de gène dans les cellules primaires de le natural killer (NK). L’induite par le dextran de transduction des gènes de l’homme ou les résultats de cellules NK primaires de souris à une efficacité accrue les expression de gène. Cette méthode de transduction gène améliorera la manipulation génétique de cellules NK.

Résumé

La transduction efficace de gènes spécifiques dans les cellules tueuses naturelles de (NK) a été un défi majeur. Transductions réussies sont essentielles pour définir le rôle du gène d’intérêt dans le développement, la différenciation et la fonction des cellules NK. Avances récentes relies aux récepteurs d’antigènes chimérique (RAC) en immunothérapie contre le cancer accentuent la nécessité d’une méthode efficace livrer des gènes exogènes aux lymphocytes effecteurs. Les efficacités de transductions génique par l’intermédiaire des gènes humains primaires ou cellules NK souris restent très faibles, qui est un facteur limitatif important. Les avancées récentes à l’aide de polymères cationiques, comme polybrene, montrent une efficacité de transduction amélioration génétique dans les cellules T. Toutefois, ces produits n’a pas à améliorer l’efficacité de la transduction des cellules NK. Ce travail montre que dextran, un polysaccharide de glucane ramifié, améliore considérablement l’efficacité de la transduction de l’homme et les cellules NK primaires de souris. Cette méthodologie de transduction hautement reproductible fournit un outil compétent pour transduction primaire NK les cellules humaines, qui peuvent améliorer considérablement les demandes de livraison de génétique clinique et donc d’immunothérapie des cancers basés sur les cellules NK.

Introduction

Natural killer (NK) cellules sont la population lymphocytaire majeure du système immunitaire inné¹. Les cellules NK fonctionnent comme les défenseurs de la première ligne de la réponse immunitaire hôte contre infections et tumeurs^2,3,4. Les cellules NK jouent également un rôle central dans le développement de la tolérance par le biais de la sécrétion de cytokines puissant et chimiokines⁵. En raison de leur puissante capacité à cibler et éliminer les cellules tumorales, plusieurs essais cliniques sont en cours pour évaluer le dérivé donneur de cellules NK humaines comme une immunothérapie adoptive pour cancer^6,7. Contrairement aux cellules T, la biologie du développement des cellules NK doit encore être bien caractérisés⁸. Cette ignorance est partiellement due à l’absence de techniques efficaces qui offrent des gènes d’intérêt à la souris ou les cellules primaires humaines de NK. Pour ces raisons, la plupart des études de NK-cellule ont été menées dans des lignées cellulaires, plutôt que dans les cellules primaires. Par conséquent, la nécessité d’un protocole fiable et efficace transmettre des cellules NK primaires avec des gènes d’intérêt est cruciale.

L’objectif général de cette étude était de formuler une méthode cohérente et fiable par lequel des cellules primaires humaines ou murins NK pourraient être transduites avec lenti - ou rétrovirus.

Des études antérieures qui a tenté de remédier à ce problème ont été réalisées, dans une large mesure à l’aide de la transformation passagère des cellules NK primaires. Cela inclut le plasmide transfection^9,10, Virus Epstein - Barr (EBV) / hybride retroviral vector¹¹, Vaccine vecteurs^12,13et Ad5/F35 chimérique vecteurs adénoviraux¹⁴. Malgré l’efficacité modeste de ces techniques, la nature transitoire de la transduction les rend impropres à l’utilisation à long terme des cellules NK génétiquement modifiés. Quelques études récentes ont utilisé des vecteurs rétroviraux pour transmettre les cellules NK, nécessitant plusieurs cycles d’infection pour atteindre un niveau acceptable de gene expression^11,15. Contrairement aux vecteurs rétroviraux, vecteurs LENTIVIRAUX peuvent utiliser machinery import nucléaire cellule hôte de translocation complexe viral avant intégration dans le noyau. Il s’agit d’un facteur limitatif important dans la réplication du virus dans les cellules non-divisant, incluent des cellules NK primaires.

Interactions entre les différents récepteurs de surface cellulaire et particules virales permettent absorption virale dans la cellule. Les engagements initiaux entre les protéines de l’enveloppe virale et leurs récepteurs apparentés hôte pourraient être limitées en raison des charges négatives potentielles existant entre ces deux. La raison d’être de nombreuses techniques de transduction est que l’ajout de polymères cationiques, comme polybrene (Pb), du sulfate de protamine (PS) ou dextran, pourrait donner une charge positive sur les récepteurs de surface cellulaire et ainsi augmenter la fixation de l’enveloppe virale protéines. Cela augmentera l’efficacité de la fusion et l’absorption des particules virales par les cellules¹⁶. Bien qu’il ait été rapporté que Pb ou PS peut améliorer de transfert de gènes dans les cellules de T¹⁷, leur application n’avait aucun effet à l’efficacité de la transduction des cellules NK primaires. En outre, une analyse comparative entre ces réactifs à l’aide des cellules NK primaires n’a pas effectuée. Dans cette étude, on a comparé l’efficacité de la transduction des trois polymères cationiques. Les résultats montrent que, parmi ces trois polymères cationiques, seulement de dextran améliore considérablement la transduction virale efficace dans les souris et les cellules primaires humaines de NK.

Protocole

Tous les protocoles d’animaux suivis le traitement humain et éthique des animaux et ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) dans le centre de recherche biomédicale (BRC) du Collège médical du Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. L’utilisation de cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) a été approuvée par l’Institutional Review Board (IRB) de l’Institut de recherche de sang de le sang Centre du Wisconsin, Milwaukee, WI.

1. souris, lignées de cellules et vecteurs

1. Obtenir des souris C57BL/6 auprès de fournisseurs commerciaux. Maintenir les colonies de souris dans des conditions exempts de micro-organismes pathogènes et d’utiliser des souris mâles et femelles âgés de 6 à 12 semaines. Obtenir des PBMC humaines dépersonnalisées provenant de sources approuvées à la CISR.
2. Anesthésier les animaux avec un mélange de 20 à 30 % v/v isoflurane en propylène glycol (1, 2-propanediol, grade USP) à anesthésier les souris. EFP pommade pour les yeux à prévenir le dessèchement tandis que les souris sont sous anesthésie.
3. Pour euthanasier les animaux, effectuer une dislocation cervicale après l’induction de l’anesthésie.
   1. Immobiliser les souris en agrippant fermement la base de la queue d’une main. Placez un stylo robuste de type bâton ou le pouce et l’index de l’autre main contre l’arrière du cou, à la base du crâne.
   2. Pour produire la dislocation, pousser la main interdisant à la tête de l’animal vers l’avant et pousser vers le bas tout en tirant vers l’arrière avec la main qui tient la queue de base. Vérifier l’efficacité de la dislocation de sentiment pour une séparation des tissus du col.
4. Garder les animaux dans la chambre/cage pendant au moins 5 min et supprimez-les uniquement lorsque l’activité respiratoire est absente ou lorsqu’il y a un manque d’un battement de coeur détectable.
5. Obtenir les cellules K562 et YAC-1 provenant des fournisseurs commerciaux et leur maintien en RPMI1640 milieu contenant 10 % inactivés par la chaleur FBS. Tester ces lignées cellulaires périodiquement afin d’exclure la possibilité de contamination par mycoplasmes.

2. préparation et titrage des vecteurs LENTIVIRAUX

1. Cellules en culture 5 × 10⁶ 293 t du jour au lendemain dans une fiole de² cm de T75 contenant une solution de 20 mL de milieu de RPMI1640 avec 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, pyruvate de sodium 1 mM, 5 % de solution de bicarbonate de sodium 7,5 % et 0,001 % Β-mercaptoéthanol. Placer la fiole dans un incubateur à 37 ° C infusé avec 5,2 % CO₂.
2. Récolter les cellules 293 t à l’aide de la trypsine (0.025%)/EDTA (1 mM) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 5 mL de trypsine/EDTA dans du PBS et incuber les flacons pendant 10 min dans un 37 ° C un incubateur pour permettre le détachement des cellules 293 t de ces flacons T75 de² cm.
   1. Recueillir les cellules individuelles et les laver deux fois dans du PBS pour éliminer toute trace de trypsine et EDTA. Compter les cellules avec un hémocytomètre et ajuster le nombre de cellules à 1 million de cellules / mL.
3. Transfecter les cellules 293 t¹⁸ avec 3,95 µg de psPAX2 1.32 µg de pMD2G et 5,26 µg de propice-GFP-Puro (généré interne à l’IRB en clonant EF1alpha promoteur de pWPI à la place d’un promoteur de CMV chez pLenti CMV-GFP-Puro)¹⁹.
   1. Préparer 1 mL de NaCl 150 mM et 63 µL de 0,6 mg/mL polyéthylènimine (PEI ; 25 000 kD, linéaire). Bien mélanger puis ajouter les plasmides et mélanger. Incuber pendant 20 min à température ambiante, puis l’ajouter aux cellules.
   2. transfection après 16 h, remplacer le milieu de la transfection avec un milieu frais et le butyrate de sodium 4,5 mM. Récolter le surnageant contenant après transfection de virus 48 h et concentré par une centrifugation à 5 000 × g. Consultez la Table des matières.
4. Déterminer les titres viraux à l’aide de cellules 293 t en effectuant des dilutions sériées et dosage par écoulement cytometry 72 h après transduction²⁰. Utiliser l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) comme une mesure pour quantifier les titres viraux.

3. purification et l’expansion des cellules NK primaires murines

1. Purifier le murin de cellules NK primaire²¹. En bref, passer des suspensions rate unicellulaire dans les colonnes de laine en nylon pour épuiser les populations adhérentes constitué des macrophages et des lymphocytes B.
2. Les populations non adhérents éluées de la colonne de laine en nylon qui contient des cellules NK avec 1 000 U/mL interleukine (IL) -2 dans un milieu RPMI1640 avec 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, pyruvate de sodium 1 mM, 5 % de bicarbonate de sodium 7,5 % de la culture solution et 0,001 % de β-mercaptoéthanol (RPMI1640 milieu complet).
3. Changer le milieu de ces flacons au jour 4 de cette culture pour éliminer les non adhérents T et des cellules NKT ; les cellules qui restent collés à ces flacons sont en grande partie les cellules NK. Ajouter 20 mL de milieu complet frais de RPMI1640 et 1 000 U/mL IL-2 pour reconstituer les fioles.
4. Vérifier la pureté des cultures de cellules NK murines jour 7 par cytométrie de flux avec des marqueurs spécifiques des cellules NK²⁰ utilisant des préparations contenant plus de 95 % du CD3 population NK1.1^{+ –}.

4. purification et l’expansion des cellules primaires humaines de NK

1. Isoler les PBMC par gradient de densité de buffy manteaux de volontaires sains. Brièvement, soigneusement la couche 35 mL de cellules dilué de moitié (avec HBSS) plus de 15 mL de gradient de densité dans un tube de 50 mL canonique. Centrifuger à 400 × g pendant 30 min à 20 ° C dans un rotor oscillant de seau sans frein.
2. Les kits commerciaux sélection négative à base d’anticorps permet de purifier les cellules NK primaires humaines selon le protocole du fabricant.
3. Suite à l’isolement, déterminer la pureté des préparations de cellules NK par les analyses de l’immunofluorescence. Tache de préparations de cellules NK avec 2 µg/mL anti-CD3 et des anticorps anti-CD56 µg/mL 2 à 4 ° C pendant 20 min. laver les cellules deux fois avec les populations de cellules NK de PBS, déterminées par l’absence de CD3 et la présence de CD56 sur la surface de la cellule.
4. Incuber les préparations de cellules avec des anticorps pendant 20 min à 4 ° C, laver avec du PBS et d’analyser dans un cytomètre en flux. Utiliser des préparations de cellules NK avec plus de 85 % des analyses de pureté pour la transduction du gène²⁰.

5. transduction des murins et humains primaires cellules NK avec lentivirus

1. Suspendre la souris ou cellules humaines primaires de NK dans une plaque 24 puits à 0,5 × 105/ml de milieu en présence de lentivirus GFP surnageante à 5, 10 et 20 multiplicité d’infection (MOI) et en présence de Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL) ou dextran (8 µg/mL).
2. Centrifuger les plaques à 1 000 × g pendant 60 min.
3. Sans décantation le surnageant, de la culture des cellules pendant la nuit (16-18 h) dans un incubateur à 37 ° C infusé avec 5,2 % CO_2.
4. Laver avec 10 mL de PBS et remettre en suspension dans 2 mL de milieu de culture complet RPMI1640 en présence de IL-2 (300 U/mL).
5. Tester l’humain et de souris primaire cytotoxicité à médiation cellulaire NK contre K562 et YAC-1, respectivement en réalisant ⁵¹chrome (Cr)-tests de libération à varient rapports effecteur-à-cible-cellule²².
   1. En bref, donner 1 million µCi 50 cellules de cible du chromate de sodium radioactif ⁵¹Cr. Pendant la période d’incubation de 4 h, ils l’absorption la ⁵¹Cr dans les protéines cellulaires. À la fin de l’incubation, laver les cellules pour enlever toutes les étiquettes individuelles.
   2. Calculer la lyse des cellules tumorales spécifique par la quantité de libération absolue, spontanée et expérimentale de ⁵¹Cr par les cellules de cible.
      NOTE : Le calcul du pourcentage de lyse spécifique d’expériences de pentaplicate a été fait à l’aide de l’équation suivante : lyse spécifique % = ((⁵¹Cr signifie la dissémination expérimentale - libération spontanée moyenne de ⁵¹Cr) / (⁵¹Cr signifie sortie maximale - ⁵¹Cr signifie libération spontanée)) x 100, où «⁵¹libération spontanée moyenne Cr » est le ⁵¹Cr libéré par les cellules de cible en l’absence des cellules NK et «⁵¹libération maximale moyenne Cr » est le ⁵¹Cr libérés par les cellules de cible à la lyse par 2 N d’acide chlorhydrique (HCl).
6. Récolter les cellules NK transduits jour 7 en tapotant les fioles.
   1. Activer les cellules récoltées avec des concentrations titrées de plaque lié aux anti-NKG2D (A10) mAb en enduisant de 96 puits, protéine hautement absorbants des plaques en polystyrène avec 2,5 concentrations µg/mL anti-NKG2D mAb du jour au lendemain.
   2. Laver chaque bien avec 100 µL de PBS trois fois avant l’ajout de cellules NK primaires.
7. Recueillir les surnageants de culture à l’aide d’une pipette multi-canaux entre 16 et 18 h après activation de quantifier des cytokines telles que l’IFN-γ. Générer des courbes standard utilisant les cytokines recombinantes fournies avec les kits d’enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
8. Tester la viabilité de cellules NK utilisant annexine-V/7-amino-l’actinomycine D (7-AAD) coloration²³ et déterminer le pourcentage de cellules nécrotiques parmi les cellules NK transformées à l’aide d’un cytomètre en flux.
   1. Pour effectuer ce test, récolte le murin et humain NK cellules quatre jours après la transduction, laver deux fois avec 10 mL de PBS froid à 500 × g pendant 5 min chacun et incuber avec une annexine-V (PE) / kit 7-AAD.
9. Logiciel de cytométrie en flux approprié permet d’analyser les données. Sélectionnez la population de cellules vivantes et d’analyser l’expression de la GFP (canal FITC) en guise de transduction virale²⁴.

Résultats

Dextran induit le transfert génique efficace de vecteur lentiviral dans les cellules primaires humaines et murines NK

Cellules NK humaines ont été isolés et purifiés de PBMC (avec une pureté de plus de 85 %) et incubés pendant la nuit avec rIL-2 300 U/mL. Ces cellules NK primaires ont été ensuite transduites avec lentivirus GFP à varié multiplicités d’infection (MOI ; 3, 10 et 20 UI par cellule) en plaques 24 puits e...

Discussion

Cette étude démontre que l’utilisation de dextran, un agent de polymère cationique améliore l’efficacité de la transduction des gènes des cellules NK primaires murins et humains. En outre, autres agents cationiques, comme Pb ou PS, n’ont aucun effet perceptible sur la prestation des vecteurs viraux dans les cellules primaires humaines de NK. Auparavant, il a été démontré que le Pb peut augmenter transduction du gène humain de cellules T¹⁷. Ces résultats, cependant, suggèrent que...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran	Sigma-Aldrich	90-64-91-9
polybrene (Pb)	Sigma-Aldrich	TR-1003
protamine sulfate (PS)	Sigma-Aldrich	p3369
Trypsin	Corning	25-052-CI
RPMI1640	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	ATALANTA	S11150
Penicillin	Corning	30-001-CI
B-mercaptoethanol	SIGMA	M3148
sodium pyruvate	Corning	MT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ )	eBioscience	14-7311-85
Propidium lodding staining solution	BD	51-66211E
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher	L3000015
Isoflurane	PHOENIX	NDC 57319-559-05
NK cell negative selection kit	Stem Cell	19855
Yac-1	ATCC	TIB-160
K562	ATCC	CCL-243
Mice	Jakson	664
293T cells	ATCC	CRL-3216
T75 flasks	Cornnig	430641U
antibody-based negative selection kits	Stem Cell	19055
51Chromium (Cr)-release assays	perkin elmer's	NEZ030
ELISA kits	Ebioscience	00-4201-56
Sodium Butyrate	Sigma	5887-5G
Linear polyethylenimine	polysciences	23966-2
Ficoll	GE Life Science	17-1440-03
HBSS	Corning	21-022-CV