לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

Summary

מטרת מחקר זה הייתה לגבש טכנולוגיות המאפשרות התמרה חושית מוצלחת גנים בתאים ראשי טבעי רוצח (NK). בתיווך לתוספי התמרה חושית lentiviral של האדם או העכבר הראשי NK תאים תוצאות יעילות גבוהה יותר של ביטוי ג'ין. שיטה זו של ג'ין התמרה חושית ישפר במידה רבה מניפולציה גנטית של תאי NK.

Abstract

התמרה חושית יעילה של גנים ספציפיים לתאי (NK) רוצח טבעי היה אתגר גדול. Transductions מוצלחת הם קריטיים באשר להגדרת תפקידו של הגן עניין בפיתוח, בידול, התפקוד של תאי NK. התפתחויות אחרונות הקשורות חיסוני סרטן אנטיגן chimeric רצפטורים (מכוניות) להדגיש את הצורך שיטה יעילה לספק גנים אקסוגני לימפוציטים. היעילות של transductions lentiviral בתיווך גנים לתוך האדם העיקרי או תאי NK בעכבר להישאר נמוך באופן משמעותי, וזה גורם מגביל הגדולות. התפתחויות אחרונות באמצעות פולימרים cationic, כגון polybrene, מראים יעילות התמרה חושית משופרת גנים בתאי T. עם זאת, מוצרים אלה נכשל לשפר את היעילות התמרה חושית של תאי NK. זה מצביעה לתוספי הזה, רב-סוכר קנים גלוקן, משפר באופן משמעותי את יעילות התמרה חושית של האדם ואת העכבר הראשי תאי NK. מתודולוגיה זו התמרה חושית מאוד לשחזור מספק כלי מוכשר transducing האנושי תאי NK העיקרי, אשר יכול מאוד לשפר את ג'ין קליניים מסירה יישומים ובכך חיסוני סרטן המבוסס על תאי NK.

Introduction

תאים (NK) רוצח טבעי הם האוכלוסייה לימפוציטית העיקריים של מערכת החיסון המולדת¹. תאי NK לפעול המגינים השורה הראשונה של התגובה החיסונית מארח נגד גידולים ודלקות^2,3,4. תאי NK גם לשחק תפקיד מרכזי בהתפתחות של סובלנות דרך ההפרשה של ציטוקינים חזק ונוגדנים⁵. בשל היכולת שלהם חזק כדי למקד לחסל תאים סרטניים, מתנהלים ניסויים קליניים מרובים כדי להעריך נגזר תורם תאי NK אדם כמו חיסוני המאמצת עבור סרטן^6,7. בניגוד תאי T, ביולוגיה התפתחותית תאי NK טרם להיות מאופיין היטב⁸. חוסר ידע היא חלקית בשל העדר של טכניקות יעיל לספק הגנים של עניין מהעכבר או תאי NK ראשי אדם. מסיבות אלה, רוב תאי NK מחקרים נערכו שורות תאים, ולא בתאים הראשי. לכן, הצורך פרוטוקול אמין ויעיל מגלי תאי NK ראשי עם הגנים של עניין חיוני.

המטרה הכוללת של מחקר זה היה לגבש שיטה עקבית ומהימנה שבו תאי NK אנושית או מאתר ראשי יכול להיות transduced עם lenti - או רטרווירוסים.

מחקרים מוקדמים יותר לניסיון כדי לטפל בבעיה זו בוצעו, בעיקר באמצעות הטרנספורמציה ארעית של תאי NK העיקרי. זה כולל פלסמיד תרביות תאים^9,10, וירוס אפשטיין בר (EBV) / היברידית retroviral וקטור¹¹, vaccinia המומנט^12,13, ו Ad5/F35 וקטורים adenoviral chimeric¹⁴. למרות היעילות צנוע של טכניקות אלה, הארעיות התמרה חושית גורם להם מתאים ניצול לטווח ארוך של תאי NK מהונדסים. מספר מחקרים שנערכו לאחרונה השתמשו וקטורים retroviral כדי מגלי תאי NK, הדורשות מספר מחזורים של זיהום להשגת רמת גן ביטוי^11,15. בניגוד retroviral וקטורים, וקטורים lentiviral ניתן להשתמש מכונות ייבוא גרעיני התא המארח כדי translocate המתחם אינטגרציה קדם נגיפי לתוך הגרעין. זה גורם מרכזי הגבלת השכפול של הנגיף ללא חלוקת תאים, אשר כוללים תאי NK העיקרי.

אינטראקציות בין חלקיקים נגיפיים שונים התא קולטנים היתר ספיגת ויראלי לתוך התא. למשימות הראשונית בין החלבונים מעטפת נגיפית קולטנים cognate המארח שלהם יכולה להיות מוגבלת האישומים שלילית פוטנציאלית הקיימת בין השניים. הרציונל מאחורי טכניקות התמרה חושית רבים נמצא כי התוספת של פולימרים cationic, כגון polybrene (Pb), מה לעזאזל קרה סולפט (PS) או לתוספי, יכול לתת התא קולטנים מטען חיובי, ובכך להגדיל את הכריכה של מעטפת נגיפית חלבונים. זה יהיה להגדיל את היעילות פיוז'ן, תפיסה של חלקיקי נגיפי על ידי תאי ה-¹⁶. למרות דווח כי חמאת בוטנים או PS יכולים לשפר העברה גנטית בתאי T¹⁷, היישום שלהם לא היה כל השפעה יעילות התמרה חושית של תאי NK העיקרי. יתר על כן, ניתוח השוואתי בין אלה ריאגנטים באמצעות תאי NK הראשי לא בוצעה. במחקר זה, היעילות התמרה חושית פולימרים cationic שלושה הושוו. התוצאות מציגות, בין פולימרים cationic, שלושה אלה רק לתוספי מחזק באופן ניכר את התמרה חושית ויראלי יעיל לתוך גם העכבר וגם תאי NK ראשי אדם.

Protocol

כל הפרוטוקולים בעלי חיים עקב הטיפול הומאני ומוסרי של בעלי חיים, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) בתוך ביו מחקר מרכז (BRC) של הרפואי של ויסקונסין (MCW), מילווקי, אינטרנט אלחוטי. השימוש של תאי תאי דם היקפיים אנושי (PBMCs) אושרה על-ידי המוסדיים סקירה לוח (IRB) של מכון המחקר דם של מרכז דם של ויסקונסין, מילווקי, אינטרנט אלחוטי.

1. עכברים, שורות תאים ווקטורים

1. להשיג C57BL/6 עכברים של ספקים מסחריים. לשמור על המושבות העכבר בתנאים ללא הפתוגן ולהשתמש עכברים הנקביים והזכריים בין הגילאים 6 עד 12 שבועות. להשיג בטל מזוהה PBMCs האנושי ממקורות שאושרו על-ידי IRB.
2. עזים ומתנגד החיות בתערובת של 20-30% איזופלוריין וי/v בפרופילן גליקול (1, 2-propanediol, כיתה USP) כדי עזים ומתנגד העכברים. החל הוטרינר משחה לעיניים למניעת יובש ואילו העכברים הם תחת הרדמה.
3. להרדים את החיות, לבצע פריקה צוואר הרחם לאחר תנאי הגיוס של הרדמה.
   1. לרסן את העכברים מאת אוחז בחוזקה בבסיס הזנב עם יד אחת. הצב עט מקל חסון-סוג או את האגודל והאצבע הראשון של היד השנייה נגד האחורי של הצוואר, בבסיס הגולגולת.
   2. כדי לייצר את פריקה, לדחוף את היד הרחקה ראש החיה קדימה ויש לדחוף למטה תוך משיכת לאחור עם היד אוחזת בזנב הבסיס. לאמת את האפקטיביות של פריקה על ידי רגש כלפי הפרדה של רקמות צוואר הרחם.
4. להרחיק את החיות הקאמרית/כלוב לפחות 5 דקות ולהסיר אותם רק כאשר פעילות הנשימה נעדר או כאשר יש חוסר דופק לזיהוי.
5. לקבל K562 ותאי YAC-1 של ספקים מסחריים ולשמור אותם ב RPMI1640 בינוני המכיל 10% חום-לא פעיל FBS. מבחן שורות תאים אלו מעת לעת כדי לא לכלול את האפשרות לזיהום mycoplasma.

2. והכנה טיטור של וקטורים lentiviral

1. תרבות 5 × 10⁶ 293T תאים לינה בקבוקון² ס מ T75 המכיל פתרון של 20 מ של RPMI1640 בינוני עם 10% FBS, פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100, 1 מ מ נתרן פירובט, 5% של 7.5% סודיום ביקרבונט פתרון ו- 0.001% Β-mercaptoethanol. מקם את הבקבוקון חממה 37 ° C עם 5.2% CO₂.
2. לקצור את התאים 293T באמצעות טריפסין (0.025%)/EDTA (1 מ מ) בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS). הוסף 5 מ של טריפסין/EDTA ב- PBS, דגירה המבחנות 10 דקות ב 37 ° C אינקובטור כדי לאפשר התנתקות של תאים 293T T75 המבחנות² ס מ.
   1. לאסוף את התאים מנותקת ולשטוף אותם פעמיים ב- PBS להסיר את עקבות של טריפסין, EDTA. לספור את התאים עם hemocytometer ולהתאים את המספר של התא מיליון תאים לכל mL.
3. Transfect תאים 293T¹⁸ עם 3.95 µg של psPAX2, ב- 1.32 µg של pMD2G µg 5.26 של pLEP-GFP-פורו (נוצר בחברה ב BRI על-ידי שיבוט יזם EF1alpha מ- pWPI במקום מקדם CMV ב pLenti CMV-GFP-Puro)¹⁹.
   1. להכין 1 מ"ל של 150 מ מ NaCl פלוס µL 63 של 0.6 מ"ג/מ"ל polyethylenimine (פיי; 25,000 kD, לינארית). מערבבים היטב, ואז מוסיפים את פלסמידים ומערבבים. תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להוסיף זה לתאים.
   2. 16 h שלאחר תרביות תאים, החלף המדיום תרביות תאים עם טרי בינוני פלוס 4.5 מ מ נתרן butyrate. לקצור את תגובת שיקוע המכיל וירוס 48 שעות שלאחר תרביות תאים, להתרכז על ידי צנטריפוגה לילה ב 5,000 × g. עיין בטבלה חומרים.
4. לקבוע את titers ויראלי באמצעות תאים 293T על-ידי ביצוע דילולים טורי ואת וזמינותו לזרום cytometry 72 h התמרה חושית שלאחר²⁰. השתמש בביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כאמצעי לכמת את titers ויראלי.

3. הרחבת תאי NK העיקרי מאתר וטיהור

1. לטהר מאתר ראשי NK תאים²¹. בקצרה, עוברים מתא בודד הטחול המתלים באמצעות ניילון עמודות צמר כדי לרוקן את אוכלוסיות חסיד המורכב תאים B ו מקרופאגים.
2. תרבות האוכלוסיות שאינם מחסידי eluted ניילון צמר עמודה המכילה תאי NK מאתר עם אינטרלוקין U/mL 1,000 (IL)-2 RPMI1640 בינוני עם 10% FBS, פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100, 1 מ מ נתרן פירובט, 5% של 7.5% סודיום ביקרבונט הפתרון, 0.001% β-mercaptoethanol (בינוני מלא RPMI1640).
3. לשנות את המדיום מן המבחנות ביום 4 של תרבות זו להסיר את הלא-חסיד T ואת NKT תאים; תאים אשר נותרו מודבקת על המבחנות הם בעיקר תאי NK. הוסף 20 מ של טרי RPMI1640 מלאה בינונית, 1,000 U/mL il-2 לחדש המבחנות.
4. לבדוק את הטוהר של התרבויות התא NK מאתר ביום 7 עד cytometry זרימה עם סמנים ייחודיים תא NK²⁰ באמצעות תכשירים עם יותר מ- 95% של CD3^–NK1.1⁺ האוכלוסיה.

4. טיהור והרחבה של תאי NK ראשי אדם

1. לבודד PBMCs על ידי צפיפות הדרגתי של מעילים באפי של מתנדבים בני אדם בריאים. בקצרה, בזהירות שכבה 35 מ של תאים חצי-מדולל (עם HBSS) מעל 15 מ"ל של דחיסות צבע בשפופרת הקנוני 50-mL. צנטריפוגה ב g × 400 למשך 30 דקות ב- 20 ° C ברוטור דלי מתנדנדים ללא בלם.
2. השתמש את ערכות הבחירה שלילי נוגדן מבוססי מסחרי לטהר את תאי NK ראשי אדם על פי הפרוטוקול של היצרן.
3. בעקבות הבידוד, לקבוע את הטוהר של ההכנות התא NK על ידי ניתוחים immunofluorescence. כתם ההכנות התא NK עם 2 µg/mL אנטי CD3 ו- 2 µg/mL נוגדנים anti-CD56 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לשטוף את התאים פעמיים עם אוכלוסיות התא PBS NK נקבע על ידי העדר של CD3 ואת נוכחותם של CD56 על פני התא.
4. דגירה ההכנות תא עם נוגדנים במשך 20 דקות ב 4 ° C, לשטוף עם PBS, לנתח ב- cytometer זרימה. השתמש ההכנות התא NK עם יותר מ-85% טוהר עבור התמרה חושית ג'ין מבחני²⁰.

5. התמרה חושית של מאתר אנושי ראשוני NK ותאי עם lentivirus

1. להשעות את העכבר או תאי NK ראשי אדם לתוך צלחת 24-ובכן-0.5 × 10⁵/mL של מדיום בנוכחות GFP lentivirus supernatant-5, 10 ו- 20 הריבוי של זיהום (MOI) ובפני Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL) או לתוספי (8 µg/mL).
2. Centrifuge הלוחות ב g × 1000 עבור 60 דקות.
3. בלי decanting את תגובת שיקוע, התרבות התאים בין לילה (16-18 h) חממה 37 ° C עם 5.2% CO_2-
4. לשטוף עם 10 מ"ל של PBS ו resuspend ב 2 מ"ל של מדיום תרבות RPMI1640 מלא בנוכחות il-2 (300 U/mL).
5. מבחן האדם ואת העכבר הראשי NK תאית cytotoxicity נגד K562, YAC-1, בהתאמה על-ידי ביצוע ⁵¹כרום (Cr)-שחרור מבחני-מגוונות אפקטור-כדי--תא היעד יחסי²².
   1. בקצרה, לתת מיליון היעד תאים 50 µCi של נתרן radiolabeled כרומט ⁵¹Cr. במהלך זמן הדגירה 4-h, הם ספיגת ⁵¹Cr לתוך החלבונים. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים כדי להסיר כל תווית לא מעובדות.
   2. לחשב גידול ספציפי תא פירוק לפי כמות שחרור מוחלט, ספונטנית, ניסיוני של ⁵¹Cr תאי היעד.
      הערה: החישוב של אחוז מסוים פירוק של ניסויים pentaplicate נעשה באמצעות המשוואה הבאה: פירוק ספציפית % = ((⁵¹Cr אומר מהדורה ניסויית - ⁵¹Cr לשחרור ספונטני מרושע) / (⁵¹Cr אומר שחרור מקסימלי - ⁵¹Cr אומר לשחרור ספונטני)) х 100, כאשר "⁵¹Cr לשחרור ספונטני מרושע" הוא ⁵¹Cr שוחרר מן התאים היעד בהיעדרו של תאי NK ו- "⁵¹Cr שחרור מקסימלי רעה" היא ⁵¹Cr שוחרר מן התאים היעד בעת פירוק על ידי 2 N חומצת מימן כלורי (HCl).
6. לקצור תאי NK transduced ביום 7 על-ידי בעדינות הקשה המבחנות.
   1. להפעיל את התאים שנקטפו עם ריכוזים, טיטרציה של mAb מאוגד-צלחת אנטי-NKG2D (A10) על ידי ציפוי לוחות פוליסטירן 96-ובכן, מאוד חלבון-כושר ספיגה עם µg/mL 2.5, ריכוזי mAb אנטי-NKG2D בן לילה.
   2. לשטוף כל טוב עם µL 100 ל- PBS שלוש פעמים לפני התוספת של תאי NK העיקרי.
7. לאסוף את התרבות supernatants באמצעות פיפטה רב ערוצית של בין 16 ו 18 h אחר-הפעלה לכמת ציטוקינים כגון IFN-γ. ליצור עקומות רגיל באמצעות של ציטוקינים רקומביננטי סיפק מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) ערכות.
8. לבחון את הכדאיות התא NK באמצעות annexin-V/7-אמינו-ואקטינומיצין D (7-מ) צביעת²³ ולקבוע את האחוזים של תאים עם נמק בין תאי NK טרנספורמציה באמצעות cytometer של זרימה.
   1. לביצוע הזה assay, קציר תאי NK מאתר והאנושי ארבעה ימים לאחר התמרה חושית, לשטוף פעמיים עם 10 מ"ל של PBS קר ב 500 g × למשך 5 דקות ולאחר דגירה עם Annexin-V (PE) / ערכת 7-מ.
9. להשתמש בתוכנה cytometry זרימה המתאים כדי לנתח את הנתונים. בחר את האוכלוסייה לחיות תאים ולנתח את הביטוי של GFP (ערוץ FITC) כאמצעי של התמרה חושית ויראלי²⁴.

תוצאות

לתוספי המניע את העברה גנטית יעיל של וקטור lentiviral תאי NK העיקרי של מאתר ואנושי

תאי NK אדם היו מבודדים מטוהרת מכל PBMC (עם טוהר של יותר מ-85%), מודגרות בין לילה עם rIL-2 300 U/mL. אלה בתאי NK העיקרי היו אז transduced עם lentivirus GFP-multiplicities מגוונת של זיהום (MOI; 3, 10, ו- 20 לכ?...

Discussion

מחקר זה מדגים את השימוש לתוספי כמו סוכן פולימר cationic משפר את היעילות התמרה חושית lentiviral של תאי NK מאתר והאדם העיקרי. בנוסף, cationic סוכנים אחרים, כגון חמאת בוטנים או PS, יש השפעה ניכרת על המסירה של וקטורים ויראלי לתוך תאי NK ראשי אדם. בעבר, זה הוכח כי Pb אפשר להגדיל התמרה חושית הגן האנושי T תאים

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran	Sigma-Aldrich	90-64-91-9
polybrene (Pb)	Sigma-Aldrich	TR-1003
protamine sulfate (PS)	Sigma-Aldrich	p3369
Trypsin	Corning	25-052-CI
RPMI1640	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	ATALANTA	S11150
Penicillin	Corning	30-001-CI
B-mercaptoethanol	SIGMA	M3148
sodium pyruvate	Corning	MT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ )	eBioscience	14-7311-85
Propidium lodding staining solution	BD	51-66211E
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher	L3000015
Isoflurane	PHOENIX	NDC 57319-559-05
NK cell negative selection kit	Stem Cell	19855
Yac-1	ATCC	TIB-160
K562	ATCC	CCL-243
Mice	Jakson	664
293T cells	ATCC	CRL-3216
T75 flasks	Cornnig	430641U
antibody-based negative selection kits	Stem Cell	19055
51Chromium (Cr)-release assays	perkin elmer's	NEZ030
ELISA kits	Ebioscience	00-4201-56
Sodium Butyrate	Sigma	5887-5G
Linear polyethylenimine	polysciences	23966-2
Ficoll	GE Life Science	17-1440-03
HBSS	Corning	21-022-CV