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  • Resumen
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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El objetivo de este estudio fue elaborar tecnologías que permiten la transducción génica exitosa en natural killer (NK) las células primarias. La transducción lentivirales dextrano-mediada de humanos o resultados primarios de las células NK del ratón en una mayor eficiencia de expresión génica. Este método de transducción génica mejorará enormemente la manipulación genética de la célula NK.

Resumen

El transduction eficiente de genes específicos en células de naturales del asesinos (NK) ha sido un gran reto. Transducciones éxito son fundamentales para definir el papel del gen de interés en el desarrollo, diferenciación y función de las células NK. Los avances recientes relacionados con receptores de antígeno quimérico (coches) en inmunoterapia del cáncer acentúan la necesidad de un método eficiente entregar genes exógenos a los linfocitos effector. Las eficiencias de transducciones de lentivirales mediada por el gen en humanos primarios o células de NK de ratón siguen siendo considerablemente bajas, que es un factor limitante. Avances recientes usando polímeros catiónicos, como el polibreno, muestran una eficacia de transducción genética mejorada en células de T. Sin embargo, estos productos no pudo mejorar la eficiencia de la transducción de las células NK. Este trabajo muestra dextrano, un polisacárido ramificado glucan, mejora significativamente la eficiencia de la transducción de humano y ratón primaria NK. Esta metodología altamente reproducible de la transducción de señales proporciona una herramienta competente para transducing humano primario las células NK, que pueden mejorar enormemente gene clínica entrega aplicaciones y así inmunoterapia de cáncer basadas en células NK.

Introducción

Natural killer (NK) células son la población linfocítica importante del sistema inmune innato1. Las células NK funcionan como los defensores de primera línea de la respuesta inmune del huésped contra tumores e infecciones2,3,4. Las células NK también juegan un papel central en el desarrollo de la tolerancia a través de la secreción de potentes citoquinas y quimiocinas5. Debido a su potente capacidad de apuntar y eliminar las células tumorales, se están realizando varios ensayos clínicos para evaluar células NK humanas derivados de donantes como una inmunoterapia adoptiva para cáncer6,7. En contraste con las células T, la biología del desarrollo de las células NK aún tiene que ser bien caracterizado8. Esta falta de conocimiento es parcialmente debido a la ausencia de técnicas eficientes que entregan los genes de interés a ratón o humano primarias células NK. Por estas razones, se han realizado más estudios de NK-célula en líneas celulares, en lugar de células primarias. Por lo tanto, es crucial la necesidad de un protocolo eficiente y confiable transducir las células primarias de NK con genes de interés.

El objetivo general de este estudio fue elaborar un método consistente y confiable por que podrían ser transduced primaria humanas o murinas de células NK con lenti - o retrovirus.

Se han realizado estudios anteriores que han intentado resolver este problema, utilizando en gran medida la transformación transitoria de las células NK primarias. Esto incluye el plásmido transfección9,10, Virus de Epstein - Barr (EBV) / híbrido retroviral vector11, vaccinia vectores12,13y Ad5/F35 quimérica adenoviral vectores14. A pesar de la modesta eficacia de estas técnicas, la naturaleza transitoria de la transducción de señales les hace inadecuados para la utilización a largo plazo de las células NK modificadas genéticamente. Algunos estudios recientes han utilizado vectores retrovirales para transducir las células NK, que requieren varios ciclos de infección para alcanzar un nivel aceptable de gene expresión11,15. En contraste con vectores retrovirales, vectores lentivirales pueden utilizar maquinaria de importación nuclear de célula huésped para translocan el complejo de la integración viral en el núcleo. Este es un factor limitante en la replicación del virus en las células no se dividen, que incluyen las células NK primarias.

Interacciones entre los diferentes receptores de superficie celular y partículas virales permiten la absorción viral en la célula. Los combates iniciales entre las proteínas de la envoltura vírica y sus receptores cognados host podrían ser limitados debido a las cargas negativas potenciales existentes entre estos dos. El fundamento de muchas técnicas de transducción de señales es que la adición de polímeros catiónicos, como el polibreno (Pb), sulfato de protamina (PS) o dextrán, podría dar una carga positiva de los receptores de superficie celular y aumentar así la Unión de la envoltura vírica proteínas. Esto aumentará la eficacia de la fusión y la absorción de las partículas virales de las células16. Aunque se ha reportado que la Pb o PS puede mejorar la transferencia de genes en las células de T17, su aplicación no tuvo ningún efecto en la eficiencia de la transducción de las células NK primarias. Por otra parte, no se ha realizado un análisis comparativo entre estos reactivos utilizando células NK primarias. En este estudio, se compararon la eficiencia de la transducción de los tres polímeros catiónicos. Los resultados muestran que, entre estos tres polímeros catiónicos, sólo dextrano mejora significativamente eficiente transducción viral en ratón y células NK primarias humanas.

Protocolo

Todos los protocolos de animales siguieron el tratamiento humano y ético de los animales y fueron aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en el centro de investigación biomédica (BRC) de la Universidad médica de Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. El uso de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) fue aprobado por la Junta de revisión institucional (IRB) del Instituto de investigación de sangre de la sangre centro de Wisconsin, Milwaukee, WI.

1. ratones, líneas celulares y vectores

  1. Obtener ratones C57BL/6 de proveedores comerciales. Mantener las colonias de ratón en condiciones libres de patógenos y utilizar ratones femeninos y masculinos entre las edades de 6 y 12 semanas. Obtener PBMCs humanos desidentificados de fuentes aprobados por el IRB.
  2. Anestesiar los animales con una mezcla de 20-30% v/v isoflurano en glicol de propileno (1, 2-propanediol, grado USP) para anestesiar los ratones. Aplicar ungüento veterinario en los ojos para evitar sequedad, mientras que los ratones están bajo anestesia.
  3. Para la eutanasia de los animales, realizar la dislocación cervical después de la inducción de la anestesia.
    1. Refrenar los ratones sujetando firmemente la base de la cola con una mano. Coloque un lápiz resistente tipo palo o el pulgar y primer dedo de la otra mano contra la parte posterior del cuello, en la base del cráneo.
    2. Para producir la dislocación, empuje la restricción de mano de la cabeza del animal hacia adelante y empuje hacia abajo mientras tira hacia atrás con la mano que sujeta la cola base. Verificar la efectividad de la dislocación por la sensación de separación de tejido del cuello uterino.
  4. Los animales en la cámara y la jaula durante al menos 5 minutos y quitarlo cuando existe actividad respiratoria o cuando hay una ausencia de un latido perceptible.
  5. Obtener células K562 y cromosoma artificial de levadura-1 de proveedores comerciales y mantener en RPMI1640 medio que contiene 10% SFB inactivado con calor. Prueba estas líneas celulares periódicamente para excluir la posibilidad de contaminación por micoplasma.

2. preparación y titulación de vectores lentivirales

  1. Células en cultivo 5 × 106 293T durante la noche en un matraz de2 cm T75 que contiene una solución de 20 mL de medio RPMI1640 con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina μg/mL 100, piruvato de sodio 1 m m, 5% de solución de bicarbonato de sodio 7.5% y 0.001% Β-mercaptoetanol. Colocar el matraz en una incubadora de 37 ° C con 5,2% CO2.
  2. Cosechar las células 293T utilizando tripsina (0.025%)/EDTA (1 mM) en tampón fosfato salino (PBS). Añadir 5 mL de tripsina/EDTA en PBS e incubar los frascos por 10 min a 37 ° C una incubadora, que permite la separación de las células 293T de los frascos de2 cm de T75.
    1. Recoger las células separadas y lavar dos veces en PBS para eliminar cualquier rastro de tripsina y EDTA. Contar las células con un hemocitómetro y ajustar el número de celular de 1 millón de células por mL.
  3. Transfectar las células 293T18 3.95 μg de psPAX2 y 1.32 μg de pMD2G 5.26 μg de pLEP-GFP-Puro (generado en casa de BRI por clonación promotor de EF1alpha de pWPI en lugar de un promotor del CMV en pLenti CMV-GFP-Puro)19.
    1. Preparar 1 mL de NaCl 150 mM plus 63 μl de 0.6 mg/mL polietilenimina (PEI; 25.000 kD, lineal). Mezclar bien y luego añadir la plásmidos y mezclar. Incubar por 20 min a temperatura ambiente y añada a las células.
    2. transfección después de 16 h, sustituir el medio de transfección con medio fresco además de butirato de 4,5 mM. Coseche el sobrenadante que contiene la transfección de virus 48 h y concentrarse por centrifugación durante la noche a 5.000 x g. Consulte la tabla de materiales.
  4. Determinar los títulos virales utilizando células 293T realizando diluciones seriadas y análisis por citometría de flujo 72 h post-transducción20. Utilizar la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) como una medida para cuantificar los títulos virales.

3. purificación y expansión de las células NK primarias murinas

  1. Purificar el murino primario de las células NK21. Pasar brevemente, suspensiones unicelular bazo a través de columnas de lana de nylon a agotar la población adherente de los macrófagos y las células de B.
  2. Cultura de las poblaciones no adherente eluidas de la columna de lana de nylon que contiene las células NK murinas con 1.000 U/mL interleukin (IL) -2 en medio RPMI1640 con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina μg/mL 100, piruvato de sodio 1 m m, de 5% de bicarbonato de sodio 7.5% solución y 0.001% β-mercaptoetanol (RPMI1640 medio completo).
  3. Cambiar el medio de los matraces el día 4 de esta cultura para eliminar la no adherente T y las células NKT; las células que permanecen adheridas a los matraces son en gran parte de las células NK. Añadir 20 mL de medio completo fresco de RPMI1640 y 1.000 U/mL IL-2 para llenar los frascos.
  4. Compruebe la pureza de las culturas de célula NK murinas en el día 7 por citometría de flujo con marcadores específicos de la célula NK20 utilizando preparaciones con más del 95% de CD3–NK1.1+ población.

4. purificación y expansión de células NK primarias humanas

  1. Aislar PBMCs por gradiente de densidad de las capas buffy de voluntarios humanos sanos. Brevemente, con cuidado la capa 35 mL de células diluidas en medio (con HBSS) más 15 mL de gradiente de densidad en un tubo de 50 mL canónico. Centrifugar a 400 x g durante 30 min a 20 ° C en un rotor de cubo basculante sin freno.
  2. Use la selección negativa basados en anticuerpos comerciales para purificar células NK primarias humanas según protocolo del fabricante.
  3. Tras el aislamiento, determinar la pureza de las preparaciones de células NK por análisis de la inmunofluorescencia. Tinción de preparaciones de células NK con 2 μg/mL de anti-CD3 y anticuerpos anti-CD56 de 2 μg/mL a 4 ° C durante 20 min lavado las células dos veces con las poblaciones de la célula de NK PBS determinadas por la ausencia de CD3 y la presencia de CD56 en la superficie celular.
  4. Incubar los preparativos de la célula con anticuerpos por 20 min a 4 º C, lavar con PBS y analizar en un citómetro de flujo. Utilizar preparaciones de células NK con más del 85% de pureza para la transducción de genes ensayos20.

5. transducción de células NK primarias murinas y humanas con lentivirus

  1. Suspender el ratón o células NK primarias humanas en una placa de 24 pozos en 0,5 × 105/ml de medio en presencia de lentivirus GFP sobrenadante en 5, 10 y 20 multiplicidad de infección (MOI) y en presencia de Pb (8 μg/mL), PS (8 μg/mL) o dextrán (8 μg/mL).
  2. Centrifugue las placas en 1.000 × g durante 60 minutos.
  3. Las células durante la noche (16-18 h) en una incubadora de 37 ° C con 5.2% de la cultura sin decantación el sobrenadante, CO2.
  4. Lavar con 10 mL de PBS y resuspender en 2 mL de medio de cultivo de RPMI1640 completado en presencia de IL-2 (300 U/mL).
  5. Prueba de humano y ratón primaria Citotoxicidad mediada por células NK contra K562 y cromosoma artificial de levadura-1, respectivamente realizando 51cromo (Cr)-ensayos de liberación en variaron proporciones célula efectora a destino22.
    1. Brevemente, dar 1 millón blanco células 50 μCi de cromato de sodio radiactivo 51Cr. Durante el tiempo de 4 h de incubación, absorción el 51Cr en proteínas celulares. Al final de la incubación, lavar las células para quitar cualquier etiqueta no incorporada.
    2. Calcular la lisis de células de tumor específico por la cantidad de liberación absoluta, espontánea y experimental de 51Cr de las células diana.
      Nota: El cálculo del porcentaje de lisis específica de pentaplicate experimentos se realizó utilizando la siguiente ecuación: % lisis específica = ((51Cr significa liberación experimental - 51lanzamiento espontáneo media de Cr) / (51Cr significa liberación máxima - 51Cr significa lanzamiento espontáneo)) х 100, donde "51lanzamiento espontáneo media Cr" es el 51Cr de células Diana en la ausencia de las células NK y "51media liberación máxima de Cr" es el 51Cr liberados de las células diana a lisis por 2 N de ácido de clorhídrico (HCl).
  6. Cosecha de las células NK transduced en día 7 golpeando suavemente los frascos.
    1. Activan las células cosechadas con concentraciones valoradas de mAb anti-NKG2D de limite de placa (A10) cubriendo la noche 96-well, altamente absorbente de proteína las placas de poliestireno con 2,5 concentraciones μg/mL de anti-NKG2D mAb.
    2. Lavar cada pozo con 100 μl de PBS tres veces antes de la adición de las células NK primarias.
  7. Recoger el sobrenadante de cultivo utilizando una pipeta multicanal entre 16 y 18 h después activación cuantificar citocinas como IFN-γ. Generar curvas estándar usando las citoquinas recombinantes que se proporcionan con los kits de ensayo (ELISA) de enzima-ligado del inmunosorbente.
  8. Probar la viabilidad de las células NK mediante tinción de annexin-V/7-amino-actinomicina D (7-AAD)23 y determinar el porcentaje de células necróticas entre las células NK transformadas usando un citómetro de flujo.
    1. Para realizar este ensayo, cosecha las NK murina y humana células cuatro días después de la transducción de señales, lavar dos veces con 10 mL de PBS frío a 500 x g durante 5 min e incubar con una anexina V (PE) / kit 7-AAD.
  9. Utilizar software de citometría de flujo apropiado para analizar los datos. Seleccione la población de células vivas y analizar la expresión de GFP (canal de FITC) como una medida de transducción viral24.

Resultados

Dextrano induce a la transferencia génica eficiente de vectores lentivirales en primaria murinas y humanas de las células NK

Células NK humanas fueron aisladas y purificadas de PBMC (con una pureza de más del 85%) y se incubó toda la noche con U/mL de rIL-2 300. Estas células NK primarias fueron entonces transduced con lentivirus GFP en variados multiplicidades de infección (MOI; 3, 10 y 20 UI por la célula) en placas de 24...

Discusión

Este estudio demuestra que el uso de dextrano como un polímero catiónico agente aumenta la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primarias murinas y humanas. Además, otros agentes catiónicos, como el Pb o PS, no tienen ningún efecto discernible sobre la entrega de vectores virales en las células NK primarias humanas. Previamente, se ha demostrado que Pb puede aumentar la transducción de genes en el humano de células T17. Sin embargo, estos resultados, sugieren que ni ...

Divulgaciones

Los autores afirman no hay conflicto de intereses financiero.

Agradecimientos

Agradecemos a Lucía Sammarco y su Lulu Lemonade Stand de inspiración, motivación y apoyo. Este trabajo fue apoyado en parte por los NIH R01 AI102893 y NCI R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); el Alex Lemonade Stand Foundation (S.M.); el programa HRHM del fondo MACC (S.M.; S.R.; [M.S.T); la Fundación de la familia de Nicholas (S.M.); la familia Gardetto (S.M.); Programa de los eruditos de Hyundai (M.S.T.); Hyundai esperanza sobre ruedas (S.R.); el fondo MACC (M.S.T. y S.M.); Instituto de investigación de los niños, MCW (S.R.); y el Premio de Kathy Duffey Fogerty (M.J.R.).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
DextranSigma-Aldrich90-64-91-9
polybrene (Pb)Sigma-AldrichTR-1003
protamine sulfate (PS)Sigma-Aldrichp3369
TrypsinCorning25-052-CI
RPMI1640Corning10-040-CV
Fetal Bovine SerumATALANTAS11150
PenicillinCorning30-001-CI
B-mercaptoethanolSIGMAM3148
sodium pyruvateCorningMT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ )eBioscience14-7311-85
Propidium lodding staining solutionBD51-66211E
Lipofectamine 3000Thermo FisherL3000015
IsofluranePHOENIXNDC 57319-559-05
NK cell negative selection kitStem Cell19855
Yac-1ATCCTIB-160
K562ATCCCCL-243
MiceJakson664
293T cellsATCCCRL-3216
T75 flasksCornnig430641U
antibody-based negative selection kitsStem Cell19055
51Chromium (Cr)-release assaysperkin elmer'sNEZ030
ELISA kitsEbioscience00-4201-56
Sodium ButyrateSigma5887-5G
Linear polyethyleniminepolysciences23966-2
FicollGE Life Science17-1440-03
HBSSCorning21-022-CV

Referencias

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