人肺树突状细胞:空间分布与表型鉴定支气管活检采用免疫组化和流式细胞仪

摘要

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

摘要

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

引言

肺是在与外部环境的连续接触，并且高度暴露于既无害颗粒和微生物有能力引起的疾病。因此，它是免疫系统装入针对入侵病原体有效的免疫反应的关键，但要保持耐受吸入抗原不引起疾病是同样重要的。为了提供有效的免疫监视，呼吸系统衬有免疫细胞，包括树突细胞（DC）的网络。 DC是专业的抗原呈递细胞与激活幼稚T细胞的独特能力。在人的肺部，驻留的DC遇到抗原，然后进程并将其输送到肺引流淋巴结以供呈现给和活化的T细胞^1，2，3的。

在人类的免疫系统，DCS可分为几个子集，具有次方CT但重叠的功能:CD1C ⁺和CD141 ⁺骨髓DC（的MDC）和CD123 ⁺浆的DC（PDC上^）4，5。而在人DCs最详细的知识从血液中的研究茎，现在明显的是，人体肺部也怀有DC亚群与T细胞刺激能力^{6，7，8，9}的罕见群体。然而，积累的数据表明，免疫细胞，包括树突状，不同在它们的频率，表型，和功能取决于它们的解剖位置^10。因此，为了研究免疫细胞从相关组织，以了解它们对局部免疫和容忍的贡献是重要的。总之，这强调需要解决肺部疾病时，研究肺居民的DC，尽管血液DC是更容易使用和访问在人类。

在人类研究肺驻留的DC的首批研究采用免疫组织化学^11，12，13主要依靠形态和单标记物，如HLA-DR和CD11c的表达，在组织切片。与此相反，最近的研究通常是在流式细胞依靠分析来研究不同的免疫细胞亚群。然而，由于很难找到唯一地标识特定的DC子集的单个细胞表面标记物，研究的潜在的限制施加仅四色流式细胞仪是包含具有类似表型标记如树突细胞群的风险。例如，CD11c的是在所有的骨髓DC和广大单核细胞表达。另一方面，在研究中采用更先进的流式细胞仪面板，从患者的外科手术切除非癌肺组织中通常使用外部参照"> ^{10，14，15，16，}虽然目前还不清楚这些稀有人群是否真正代表的DC存在于正常人。总体而言，研究在很大程度上是由于一个事实，即手术切除或整个人类的肺组织是稀缺的限制。

为了克服这些限制，这项工作介绍了如何执行空间分布及区议会在从谁接受支气管镜检查健康志愿者获得支气管粘膜活检表型鉴定的详细分析。几个小活检可以从每个单独的收集和随后可以嵌入用于切片和免疫组织化学或酶促消化先进流式细胞分析分析。在从支气管镜检查获得的支气管活检的形式使用的肺组织赋予使得能够执行ST的优点UDY上健康的志愿者，不像肺部开放手术，对于明显的原因，被限制为那些需要开胸手术的患者。此外，从健康志愿者支气管期间被取样的组织是生理上正常的，而相比之下，肺组织的非患部患者肺部疾病。另一方面，在活检小和检索单元的汇集几个活检即使当数，限制了可进行分析的类型。

虽然目前的工作重点是对DC，描述可以直接扩展的方法，包括其他（免疫）利益驻留在人体黏膜肺组织细胞。此外，该协议也直接适用于从肺部疾病，其中支气管镜检查是确立诊断，如慢性阻塞性肺疾病（COPD），结节病，或者肺癌的一部分的患者获得的样品。

研究方案

注:此研究于默奥，瑞典批准了区域伦理审查委员会。

1.支气管镜从人类受试者取样活检支气管

1. 获得所有参与者的知情同意。
2. 治疗口服咪达唑仑（4-8毫克）和静脉注射格隆（0.2-04毫克）的支气管镜检查前30分钟科目。应用表面麻醉用喉和支气管利多卡因。让我们用〜3个毫升利多卡因4％的受漱口并申请3毫升舌根并经由一个注射器喉喉。优化8-10剂量利多卡因喷表面麻醉。进行这一步的主题会议。
3. 通过塑料喉舌与仰卧位的主题将通过口腔灵活的视频支气管镜。使用特制的喷雾导管来完成通过支气管镜远端气管和支气管的局部麻醉。在这里，使用剂量为约5-10毫升2％利多卡因。
4. 取从主隆突6-9支气管粘膜活检和使用有孔镊子（ 图1）的主支气管分裂。继支气管镜检查，并离开医院之前，让主题休息2-4小时，并提供他/她的便餐。

2.在嵌入乙二醇丙烯酸甲酯（GMA）树脂活检

注:GMA染色协议在南安普敦大学，组织化学研究组¹⁷最初被开发。

1. 固定:对于免疫组织化学，除去从钳子的活检和直接将它们放入装有3毫升冰冷脱水丙酮和蛋白酶抑制剂的玻璃小瓶（苯甲基磺酰氟（35毫克/ 100毫升丙酮）和碘乙酰胺（370毫克/ 100毫升丙酮））。过夜修复组织在-20℃（ 图2）。
   注:以下步骤应PERFORmed指在适当的丁腈手套在通风橱。嵌入试剂盒包含可引起过敏，刺激，和/或皮肤过敏反应的组件。所有垃圾必须进行处置危险废物。
2. 脱水:用抑制剂取出丙酮并用新鲜的无水丙酮替代（没有抑制剂）在室温（RT）下15分钟。除去丙酮并用甲基苯甲酸代替它15分钟。
3. 渗透:准备在乙二醇甲基丙烯酸酯单体5％苯甲酸甲酯溶液处理解决方案; 10毫升足够用于一个小瓶。使用塑料巴斯德移液管，吸出苯甲酸甲酯溶液并用3毫升的处理溶液替换。孵育活检，并在4℃下2小时过量的处理溶液;巴斯德移液器可用于所有后续溶液的改变，包括嵌入溶液。
4. 交换处理液每2小时（3×2小时的孵育），所以生物的总浸润时间在该处理溶液psies为至少6小时。插入纸标签进入嵌入胶囊的顶端识别活检。
5. 制备的75毫克过氧化苯甲酰在10ml乙二醇甲基丙烯酸酯单体的一个嵌入溶液。加入0.25g毫升N，N-二甲基苯胺的聚（环氧乙烷）的（加速器）以嵌入溶液，开始聚合反应。除去处理溶液和一种活检放入使用镊子的有关嵌入的胶囊。
6. 慢慢地填补了嵌入胶囊顶端嵌入与解决方案，并盖上。避免干扰活检和创造大量气泡。在4℃孵育胶囊直至树脂完全聚合。
7. 储存在-20℃的嵌入活检中含有约5g硅胶的50毫升管中。

3. GMA嵌入支气管活检切片

1. 显微镜载玻片涂层:洗净显微镜载玻片在洗碗机在一个正常的周期。盖上玻片并风干。
2. 制备在蒸馏水中的10％聚-L-赖氨酸（PLL）溶液包衣溶液。淹没在涂液的幻灯片5分钟，然后让他们自然风干。存储在他们的原盒干PLL涂层的幻灯片。
3. 在蒸馏水中洗片玻璃带用0.1％吐温20。冲洗，用70％的乙醇和用纸巾擦干玻璃。使用刀制造玻璃条形切割玻璃刀片。存储刀片时，防止移动，以确保切削刃不会被损坏或有缺口的容器。
4. 活检微调:将胶囊分配器活检囊采用碳钢单刃刀片每边砍伐。取出GMA包埋活检并牢牢将其放置在副。各地使用钢刀活检修剪多余GMA。
5. GMA切片。
   1. 制备用蒸馏水0.05％的氨水溶液。在广场的第玻璃刀和活检Ë切片。仔细使刀片靠在块的表面平坦调整刀架和所述活检块的角度对准与叶片活检块。
   2. 切割用切片机2微米厚的部分在一个缓慢的切削速度和使用镊子转移和上浮部分的氨水。浮动部分为45-90秒，让温柔的抗原修复和部分展开。
   3. 拿起显微镜载玻片部分。用甲苯胺蓝染色快速检查活检组织学检查。
   4. 干燥的热板上集合的幻灯片到50℃，并应用500微升过滤甲苯胺蓝染色，以使用塑料巴斯德吸管的部分。暖节上热板，直到绿环开始在污渍的边缘出现，然后用清水洗净。
   5. 使用光学显微镜，检查活检组织学检查。用于免疫组化部分应包含完好椎板好的地区和固有上皮细胞，用尽可能少的腺体和小平滑肌越好。
   6. 正如在3.4.2节，切具有良好的组织切片，并挑选他们与PLL涂层显微镜载玻片的免疫组化染色。从每个切片进行分析切至少两个部分。干片至少1小时。干燥后，部分可以被包裹在锡箔，并储存在-20℃下长达2周，或它们可以立即进行免疫染色。

4. GMA嵌入支气管活检免疫组化染色

注:叠氮化钠是有毒的。通风橱内制备0.1％叠氮化钠溶液和从酸路程。与酸接触释放出有毒气体。

1. 周围画用金刚石尖笔段和安排幻灯片到染色架。
2. 执行过氧化物块。制备在0.1％叠氮化钠溶液中的0.3％的过氧化氢的过氧化物酶块溶液。申请Y 1毫升过氧化物块部分，并且孵育30分钟。
3. 制备0.05M的Tris缓冲盐水（TBS），pH值7.6的洗涤溶液中。洗净的幻灯片在TBS，3 5分钟。
4. 准备在DMEM一个的1％BSA封闭液。提前大批量，等分做到这一点，它冻结直到需要。漏的幻灯片，并培育在块溶液区段30分钟以封闭非特异性抗体结合。如果非特异性结合仍然出现，包括来自相同物种作为第二抗体5％血清块30分钟温育步骤。
5. 稀释在TBS中的第一抗体（CD45或的CD1a）至所需浓度（CD45在1稀释:1000;的CD1a稀释为1:1.00），并把它应用到幻灯片。盖玻片的章节，并在室温下孵育过夜。
6. 在TBS中洗涤载玻片三次。稀释生物素化的次级抗体（针对第一抗体宿主物种，在这种情况下_，2）的兔抗小鼠的F（ab'）在TBS至所需浓度（1:300稀释）并将其应用到幻灯片。在室温下孵育2小时。
7. 使用前制备链霉抗生物素 - 过氧化物酶复合物至少30分钟。确保有足够覆盖所有幻灯片。洗载玻片在TBS三次。应用溶液的幻灯片和在室温下孵育2小时。
8. 洗载玻片在TBS三次。制备3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）过氧化物酶底物溶液（每制造商的说明制备）。将其应用到幻灯片和孵育20-30分钟或直到所需的染色强度发展。
9. 冲洗载玻片在流动的自来水进行5分钟。染液的部分用2分钟过滤Mayer的苏木解决方案。在流动的自来水进行5分钟洗涤载玻片。
10. 沥干幻灯片和覆盖永久安装水介质中的部分。干燥在80℃下将载玻片在干燥炉中。允许的幻灯片冷却，然后使用DPX安装它们并放置盖玻片。

5.圣癌宁分析

1. 使用连接到计算机的安装照相机的光学显微镜在40X放大率分析部分。
   注:对于细胞分析，计数阳性染色，核细胞支气管固有层和完整上皮内，不含平滑肌，腺体，大血管，和不匹配的或受损的组织的区域。
2. 平均的细胞计数和纠正的平均细胞数为固有层的面积和上皮的长度。固有层和上皮的长度的面积可以使用图像分析程序来计算。

6.支气管活检酶消化

1. 洗涤活检:在含有10ml Hank氏缓冲盐溶液（HBSS）（ 图3）的15毫升锥形管中使用无菌镊子，地点完整活检。以30rpm在室温下孵育5分钟，在摇摆平台上。转移活检到无菌ð通过滗析15ml试管用HBSS的内容杂交。
2. 扰乱粘液用DTT:在管用10ml的HBSS含5mM 1,4-二硫苏糖醇（DTT）更换的HBSS。转移活检回用无菌镊子15毫升管。以30rpm在室温下孵育15分钟在摇摆平台上。
3. 轻轻涡管15秒。通过滗析15毫升管与HBSS和DTT的内容转移到活检无菌培养皿。
4. 传送活检到培养基中:用10ml RPMI 1640培养基的更换HBSS和DTT在管。转移活检回用无菌镊子15毫升管。以30rpm在室温下孵育10分钟在摇摆平台上。
5. 消化胶原酶和DNA酶活检。
   1. 制备在预热的RPMI含有1M HEPES溶液胶原酶II（0.25毫克/毫升）和DNA酶（0.2毫克/毫升）的消化溶液。加入500μL的每孔消解液在48孔邪教组织URE板。
   2. 将每孔1活检消化解决方案。孵育60分钟的摇动平台上的板在37℃在220rpm。移液器上下30分钟后，以再分散的活检，并在60分钟后，以完全分解的组织。
6. 准备单细胞悬液。
   1. 池一起消化活组织检查从孔到50毫升管中使其通过一个40微米的细胞滤网。通过用冰冷的FACS缓冲液（磷酸盐缓冲的盐水（PBS）含有2％胎牛血清）洗涤各孔收集剩余的细胞。
   2. 挤在使用注射器的柱塞背面的细胞过滤剩余的组织。离心消化细胞以400×g离心在4℃下5分钟。小心取出上清液和悬浮颗粒在5毫升冰冷的FACS缓冲。算使用手动血球和台盼蓝染色来评估细胞的生存力的细胞。

7。酶消化后活检支气管内的单细胞的流式细胞仪分析

1. 重悬细胞沉淀到约1×10 ^6个细胞在200μl的FACS缓冲液中。
2. 根据制造商的方案中添加细胞生存力染料为死细胞排除。
3. 添加5微升的FcR阻断试剂的孵育在4℃下5分钟。
4. 添加的细胞表面的抗体抗CD45（2微升），谱系（CD3，CD20，CD56，CD66abce，和CD14;每个2微升），CD16（0.5微升），HLA-DR（3微升），的CD11c（5微升），CD123 （5微升），CD1C（3微升），和CD103（2微升），并孵育在4℃下15分钟。抗体上的细节可以在方法部分中找到，但在使用流式细胞仪滴定和优化抗体的精确的流量。洗去过量的抗体用PBS在400×g下5分钟。获取关于一个流动新鲜样品流式细胞仪或先于后来acquisit固定在1％多聚甲醛的细胞离子。
5. 确定在使用流式细胞仪测定^18（ 图4）的流肺活检人DC。
   注意:使用流式细胞仪分析软件的流，免疫细胞被门控CD45从其它肺细胞区分开来。死细胞可以排除，因为是积极为LIVE / DEAD染色细胞。所有活^的 CD45 ⁺细胞，细胞谱系细胞（B细胞，T细胞，NK细胞，中性粒细胞和单核细胞）的可使用针对CD20，CD3，CD56，CD66abce，CD14，和CD16抗体的鸡尾酒中一个信道被排除。以下即，HLA-DR ⁺细胞将允许所有人DCs的识别。的MDC可以基于的CD11c的表达或分别缺少的CD11c的，的pdc加以区分。的MDC可以进一步分为CD1C ⁺的MDC或CD141 ^+。

结果

研究表征人呼吸道组织驻留的免疫细胞，包括树突状，是有限的，这主要是由于这一事实，即外科手术切除或整个人肺组织是稀少。这里，从健康志愿者和开发的协议的支气管活检（EBB）获得的肺组织使用免疫组织化学研究中的组织中的免疫细胞或流式细胞术的微创方法进行了概述。

健康志愿者进行支气管镜检查，如前所述

讨论

本文介绍了如何利用免疫组织化学生成健康人肺组织居民DC的详细的空间和表型鉴定和支气管镜检查期间收集支气管粘膜活检流式细胞仪。在以下各段中的协议的关键步骤中详细讨论。

关键步骤议定书

切片和免疫组化:这是至关重要的，当不使用它们（步骤2.5），以保持活检块在-20℃。温馨块有时会变得柔软，不会一节为好。此外，保持块在-20℃将保留抗原?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160	Olympus	BF1T160
Light source	Olympus	Exera CV-160
Fenestrated forceps	Olympus	FB21C	Used to take biopsies
Bite Block	Conmed	1429	20 mm x 27 mm
Glucose 25%			500 ml intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml			Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o			Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40 mg/ml			Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100 mg/ml spray			Administered to back of throat
Lidocaine 20 mg/ml spray			Administered via bronchoscope to airways
GMA processing and embedding
Glass vials			5 ml
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-1L
Molecular sieves, 4 Å	Alfa Aesar	88120	3-4 mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P-7626	0.035 g/100 ml acetone
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I-6125	0.37 g/100 ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules	TAAB laboratories	C094	500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder	TAAB laboratories	C054	Holds 25 8 mm capsules
JB-4 GMA embedding kit	Polysciences	00226	Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate	Sigma-Aldrich	27614-1L
Silica gel with humidity indicator	Scharlau	GE0043	2.5-6 mm
GMA sectioning
Glass microscope slides	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy	Alkar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker	LKB
Capsule splitter	TAAB laboratories	C065
Carbon steel single edge blades	TAAB laboratories	B054
Vice
Ammonia, 25%	VWR	1133.1000	2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%)
Microtome	Leica		Leica RM 2165
Light source	Leica		Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand	Leica		Leica MZ6
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen	Histolab	5218
Hydrogen peroxide 30% solution	AnalaR Normapur	23619.264
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
Sodium chloride	VWR chemicals	27810.295
Bovine serum albumin	Millipore	82-045-2	Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anti-human CD45 antibody	BioLegend	304002	Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody	AbD Serotech	MCA80GA	Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control	Abcam	ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control	Dako	X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit	Vector Labs	PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite	Vector Labs	SK-4200
Mayers haematoxylin	HistoLab	01820
Permanent Aqueous Mounting Medium	AbD Serotech	BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution	VWR	360292F
Light microscope	Leica		Leica DMLB
Microscope camera	Leica		Leica DFC 320
Analysis software	Leica		Leica Qwin V3
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	55021C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885
DNase	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Forceps
Platform rocker	Grant instruments	PMR-30
50 ml conical tubes	Falcon	14-432-22
40 µm cell strainer	Falcon	352340
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit	Life Technologies	L34957
CD45	BD	555485
CD3	BD	557757
CD20	BD	335829
CD56	Biolegend	318332
CD66abce	Miltenyi	130-101-132
HLA-DR	BD	555813
CD14	BD	557831
CD16	Biolegend	302026
CD11c	BD	560369
CD1c	Miltenyi	130-098-009
CD141	Miltenyi	130-090-514
CD103	Biolegend	350212
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
LSR II Flow cytometer	BD		Flow cytometer
FlowJo	FlowJo		Software for analysis