Human Cells Lung dendritiques: Répartition spatiale et phénotypique identification dans endobronchique Biopsies par immunohistochimie et cytométrie de flux

Résumé

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Résumé

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Introduction

Les poumons sont en contact permanent avec l'environnement extérieur et sont très exposés à la fois des particules et des microbes inoffensifs ayant la capacité de provoquer une maladie. Par conséquent, il est essentiel pour le système immunitaire pour monter des réponses immunitaires puissantes contre les pathogènes envahissants, mais il est tout aussi important de maintenir la tolérance aux antigènes inhalés qui ne provoquent pas de maladie. Pour assurer la surveillance immunitaire puissante, le système respiratoire est garni d'un réseau de cellules du système immunitaire, notamment des cellules dendritiques (CD). DC sont des cellules présentatrices d'antigène professionnelles avec la capacité unique d'activer les cellules T naïves. Dans les poumons humains, les DC résidents rencontrent un antigène et ensuite traiter et de le transporter vers les ganglions lymphatiques drainant des poumons pour la présentation et à l' activation des cellules T ^{1, 2, 3.}

Dans le système immunitaire humain, les DC peuvent être divisés en plusieurs sous-ensembles, avec distinct , mais qui se chevauchent fonctions: CD1c ⁺ et CD141 ⁺ DC myéloïdes (MDC) et CD123 ⁺ DC plasmacytoïdes (PDC) ^{4, 5.} Alors que la plupart des connaissances détaillées sur les DC humaine provient des études dans le sang, il est maintenant évident que les poumons humains abritent aussi des populations rares de sous - ensembles DC avec des cellules T capacité stimulatrice ^{6, 7, 8, 9.} Cependant, les données montrent que l' accumulation des cellules immunitaires, y compris les DC, diffèrent par leur fréquence, leur phénotype et la fonction en fonction de leur emplacement anatomique ^10. Ainsi, il est important d'étudier les cellules du système immunitaire du tissu pertinent pour comprendre leur contribution à l'immunité locale et la tolérance. Pris ensemble, ce qui souligne la nécessité d'étudier les PED pulmonaires résident lorsque lutter contre les maladies pulmonaires, malgré les PED sanguins étant plus facilement disponibles et accessibles chez l'homme.

Les premières études qui a enquêté sur les PED pulmonaires résident chez l' homme sont principalement fondés sur la morphologie et l'expression de marqueurs simples, tels que HLA-DR et CD11c, dans des coupes de tissus par immunohistochimie ^{11, 12, 13.} En revanche, des études plus récentes ont généralement compté sur cytométrie de flux des analyses pour étudier les différents sous-ensembles de cellules immunitaires. Cependant, étant donné qu'il est difficile de trouver un seul marqueur de surface cellulaire qui identifie uniquement un sous-ensemble spécifique DC, la limitation potentielle des études qu'appliquer quatre couleurs cytométrie en flux est le risque d'inclure des populations de cellules avec des marqueurs phénotypiques semblables à DC. Par exemple, CD11c est exprimée sur tous les DC myéloïdes et la grande majorité des monocytes. D'autre part, dans les études appliquant plus avancées panneaux de cytométrie de flux, les tissus pulmonaires non cancéreuses de résections chirurgicales de patients ont été généralement utiliséxref "> ^{10, 14, 15, 16,} même si on ne sait pas si ces populations rares sont vraiment représentatives des PED présents chez des sujets sains. Dans l' ensemble, les études sont limitées en grande partie due au fait que chirurgicalement enlevé ou tissu entier de poumon humain est rare.

Pour surmonter certaines de ces limitations, cet ouvrage décrit comment effectuer une analyse détaillée de la distribution spatiale et une identification phénotypique des CD dans les biopsies bronchiques muqueuses obtenues chez des volontaires sains qui subissent une bronchoscopie. Plusieurs petites biopsies peuvent être collectées à partir de chaque individu et peuvent ensuite être intégrées pour sectionner et de l'analyse par immunohistochimie ou enzymatiquement digéré pour l'analyse avancée par cytométrie de flux. En utilisant le tissu pulmonaire sous forme de biopsies bronchiques obtenues à partir de bronchoscopies confère l'avantage de rendre possible la réalisation de la study sur des volontaires sains, contrairement à la chirurgie ouverte des poumons qui, pour des raisons évidentes, est limitée aux patients qui nécessitent une chirurgie thoracique. En outre, le tissu qui est échantillonné au cours d'une bronchoscopie chez des volontaires sains est physiologiquement normal, contrairement à une zone non affectée du tissu pulmonaire chez les patients présentant une maladie pulmonaire. D'autre part, les biopsies sont faibles et le nombre de cellules récupérées, même lorsque la mise en commun de plusieurs biopsies, limite le type d'analyses qui peuvent être effectuées.

Bien que le présent travail se concentre sur les pays en développement, les méthodes décrites peuvent être directement élargi pour inclure d'autres cellules (immunitaires) d'intérêt qui résident dans le tissu muqueux de poumon humain. En outre, les protocoles sont également directement applicable à des échantillons prélevés sur des patients souffrant de maladies pulmonaires où la bronchoscopie fait partie de l'établissement du diagnostic, telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), la sarcoïdose, ou d'un cancer du poumon.

Protocole

NOTE: Cette recherche a été approuvé par le Conseil d'examen éthique régionale à Umeå, en Suède.

1. bronchoscopie pour échantillonnage endobronchique biopsies de sujets humains

1. Obtenir le consentement éclairé de tous les participants.
2. Traiter les sujets avec le midazolam par voie orale (4-8 mg) et glycopyrronium par voie intraveineuse (0,2 à 04 mg) 30 min avant la bronchoscopie. Appliquer une anesthésie topique avec de la lidocaïne dans le larynx et les bronches. Que le sujet gargariser avec ~ 3 ml de lidocaïne à 4% et appliquer 3 ml à la base de la langue et dans le larynx par l'intermédiaire d'une seringue du larynx. Optimisez l'anesthésie topique avec 8-10 doses de lidocaïne pulvérisation. Effectuer cette étape avec le sujet assis.
3. Insérez un bronchoscope vidéo flexible à travers la bouche par l'intermédiaire d'un embout en plastique avec le sujet en position couchée. Utilisez un vaporisateur cathéter spécialement fait pour compléter l'anesthésie topique de la trachée et des bronches distale via le bronchoscope. Ici, utiliser une dose d'environ5-10 ml de lidocaïne à 2%.
4. Prendre 6-9 biopsies muqueuses bronchiques de la carina principale et les principales divisions bronchiques à l' aide des pinces fenêtrées (figure 1). Suite à la bronchoscopie et avant de quitter l'hôpital, que le sujet reste pour 2-4 heures et de fournir lui / elle avec un repas léger.

2. Intégration de la Biopsies en Glycol Méthylacrylate (GMA) Résine

NOTE: Le protocole d'immunocoloration GMA a été initialement développé à l' Université de Southampton, Unité de recherche histochimie ^17.

1. Fixation: Par immunohistochimie, retirez les biopsies de la pince et les placer directement dans des flacons en verre contenant 3 ml d'inhibiteurs de l'acétone et la protéase déshydratés glacées (fluorure de phénylméthylsulfonyle (35 mg / 100 ml d'acétone) et iodoacétamide (370 mg / 100 ml d'acétone )). Fixer le tissu pendant la nuit à -20 ° C (Figure 2).
   REMARQUE: Les étapes suivantes devraient être Performé dans une hotte avec des gants en nitrile appropriés. Le kit d'intégration contient des composants qui peuvent provoquer des réactions de sensibilisation, d'irritation, de la peau et / ou allergique. Tous les déchets doivent être éliminés comme des déchets dangereux.
2. Déshydratation: éliminer l'acétone avec des inhibiteurs et remplacer avec de l'acétone déshydratée frais (sans inhibiteurs) pendant 15 min à température ambiante (RT). Éliminer l'acétone et le remplacer par le benzoate de méthyle pendant 15 minutes.
3. Infiltration: Préparer une solution de traitement d'une solution à 5% de benzoate de méthyle dans le monomère de méthacrylate de glycol; 10 ml est suffisante pour un flacon. À l'aide pipettes Pasteur en matière plastique, l'aspiration de la solution de benzoate de méthyle et le remplacer par 3 ml de solution de traitement. Incuber les biopsies et la solution de traitement en excès à 4 ° C pendant 2 heures; Pipettes Pasteur peuvent être utilisés pour tous les changements de solution ultérieurs, y compris une solution enrobage.
4. Remplacez la solution de traitement toutes les 2 heures (3x 2 incubations hr), de sorte que le temps total d'infiltration du biopsies dans la solution de traitement est d'au moins 6 heures. Insérez des étiquettes en papier dans l'extrémité supérieure des capsules d'enrobage pour identifier les biopsies.
5. Préparer une solution d'enrobage de 75 mg de peroxyde de benzoyle dans 10 ml de monomère de méthacrylate de glycol. Ajouter 0,25 ml de N, N - diméthylaniline poly (oxyde d'éthylène) (accélérateur) à la solution d'enrobage pour commencer la réaction de polymérisation. Retirer la solution de traitement et placer une biopsie dans la capsule d'enrobage pertinentes en utilisant une pince.
6. Remplir lentement la capsule enrobage vers le haut avec une solution intégrant et fermer le bouchon. Éviter de perturber la biopsie et la création de grosses bulles d'air. Incuber les capsules à 4 ° C jusqu'à ce que la résine soit complètement polymérisé.
7. Stocker les biopsies incorporés à -20 ° C dans un tube de 50 ml contenant environ 5 g de gel de silice.

3. Sectionnement des biopsies endobronchiques GMA-embarqués

1. Microscope slide revêtement: Laver les lames de microscope dans unlave-vaisselle sur un cycle normal. Couvrir les diapositives et les laisser sécher à l'air.
2. Préparer une solution de revêtement de 10% de poly-L-lysine (PLL) dans de l'eau distillée. Immerger les lames dans une solution de revêtement pendant 5 min, puis laissez-les sécher à l'air. Stocker les diapositives PLL enduit sec dans leur boîte d'origine.
3. Laver les lames de verre en feuille avec 0,1% de Tween 20 dans de l'eau distillée. Rincer le verre avec 70% d'éthanol et sécher avec des serviettes en papier. Couper les lames de verre de la bande de verre à l'aide d'une machine à couteau. Stocker les lames dans un récipient qui empêche le mouvement de veiller à ce que l'arête de coupe ne soit pas endommagé ou entaillé.
4. Biopsie rognage: Placez la capsule de biopsie dans un séparateur de capsule et de réduire chaque côté à l'aide d'une seule lame de pointe en acier au carbone. Retirer la biopsie GMA intégré et placez-le fermement dans un étau. Coupez l'excédent GMA autour de la biopsie en utilisant la lame d'acier.
5. tronçonnage GMA.
   1. Préparer une solution d'ammoniaque à 0,05% avec de l'eau distillée. Placez le couteau de verre et la biopsie dans ee microtome. aligner soigneusement le bloc de biopsie avec la lame en ajustant le porte-couteau et l'angle du bloc de biopsie de telle sorte que la lame repose à plat contre la surface du bloc.
   2. Couper 2 sections um d'épaisseur à l'aide du microtome sur une vitesse de coupe lente et utiliser des pinces pour transférer et flotter sections sur l'eau de l'ammoniac. Float les sections de 45-90 sec, permettant douce récupération d'antigène et le déroulement de la partie.
   3. Pick-up sections avec lame de microscope. Vérifiez l'histologie de la biopsie par coloration rapidement avec le bleu de toluidine.
   4. Sécher les lames sur un ensemble de plaque chaude à 50 ° C et appliquer 500 pi de toluidine filtrée bleuissement à une section à l'aide d'une pipette en plastique de Pasteur. Réchauffez la section sur la plaque chaude jusqu'à ce qu'un anneau vert commence à émerger au bord de la tache, puis laver avec de l'eau.
   5. L'utilisation d'un microscope optique, vérifier l'histologie de la biopsie. Sections utilisées pour l'immunohistochimie doivent contenir les bonnes zones de lame intactepropria et l'épithélium, avec aussi peu de glandes et que peu de muscle lisse que possible.
   6. Comme dans la section 3.4.2, couper des sections qui ont une bonne histologie et les ramasser avec des lames de microscope PLL revêtus pour la coloration immunohistochimique. Couper au moins deux sections de chaque biopsie pour l'analyse. diapositives sécher pendant au moins 1 h. Après séchage, les articles peuvent être enveloppés dans une feuille d'étain et stockés à -20 ° C pendant jusqu'à 2 semaines, ou ils peuvent être immédiatement immunocoloration.

4. Coloration immunohistochimique des biopsies endobronchiques GMA-embarqués

NOTE: L'azoture de sodium est toxique. Préparer la solution d'azoture de sodium à 0,1% dans une hotte et à l'écart des acides. Le contact avec les acides dégage des gaz toxiques.

1. Dessiner autour sections à l'aide d'un stylo à pointe de diamant et d'organiser les diapositives sur un support de coloration.
2. Effectuer un bloc de peroxydase. Préparer une solution de Peroxydase de bloc de 0,3% de peroxyde d'hydrogène dans une solution d'azoture de sodium à 0,1%. Apply 1 ml du bloc de peroxydase aux sections et laisser incuber pendant 30 min.
3. Préparer une solution de lavage de 0,05 M de solution saline tamponnée au Tris (TBS), pH 7,6. Laver les lames dans du TBS, 3x 5 min.
4. Préparer une solution à 1% de blocs de BSA dans du DMEM. Pour ce faire à l'avance et des volumes grande, aliquoter et congeler jusqu'à ce que nécessaire. Égoutter les lames et incuber les sections en solution de bloc pendant 30 minutes pour bloquer la liaison d'anticorps non spécifique. Si une liaison non spécifique se produit encore, comprendre une étape d'incubation de 30 min avec le bloc de sérum de 5% par rapport à la même espèce que l'anticorps secondaire.
5. Diluer anticorps primaire (CD45 ou CD1a) dans du TBS à la concentration désirée (CD45 dilué à 1: 1000; CD1a dilué à 1: 1,00) et l'appliquer à des diapositives. Coverslip les sections et laisser incuber pendant une nuit à température ambiante.
6. Laver les lames dans du TBS trois fois. Diluer l' anticorps secondaire biotinylé (dirigé contre l'espèce d' anticorps de l' hôte principal, dans ce cas de lapin anti-souris F (ab _'2)) dans du TBS à la concentration désirée (1:300 dilution) et l'appliquer à des diapositives. Incuber pendant 2 heures à température ambiante.
7. Préparer une streptavidine biotine-peroxydase complexe au moins 30 minutes avant utilisation. Assurez-vous qu'il ya assez pour couvrir toutes les diapositives. Laver les lames dans du TBS trois fois. Appliquer la solution sur les lames et incuber pendant 2 h à température ambiante.
8. Laver les lames dans du TBS trois fois. Préparer le 3-amino-9-éthylcarbazole (AEC) d'une solution de substrat de peroxydase (fabriquée conformément aux instructions du fabricant). Appliquer sur les lames et incuber pendant 20 à 30 minutes, ou jusqu'à ce que l'intensité de la coloration souhaitée se développe.
9. Rincer les lames dans l'eau du robinet pendant 5 min. Counterstain les sections avec la solution hématoxyline de Mayer filtrée pendant 2 min. Laver les lames dans l'eau du robinet pendant 5 min.
10. Égoutter les diapositives et couvrir les sections avec un milieu aqueux permanent de montage. Sécher les lames à 80 ° C dans un four de séchage. Laisser les diapositives refroidir, puis les monter avec DPX et placer une lamelle.

5. StAnalyse aining

1. Analyser les sections à 40X au moyen d'un microscope optique avec une caméra montée connecté à un ordinateur.
   NOTE: Pour l'analyse cellulaire, comptez positivement colorées, les cellules nucléées au sein de la lamina propria bronchique et de l'épithélium intact, à l'exclusion des zones de muscle lisse, les glandes, les gros vaisseaux sanguins et les tissus dépareillés ou endommagés.
2. Moyenner les comptes de cellules et de corriger le nombre moyen des cellules dans la zone de la lamina propria et la longueur de l'épithélium. La superficie de la lamina propria et la longueur de l'épithélium peut être calculé en utilisant un programme d'analyse d'image.

6. La digestion enzymatique des endobronchiques Biopsies

1. Biopsies de lavage: En utilisant des pinces stériles, placer des biopsies intactes dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de solution saline tamponnée de Hank (HBSS) (Figure 3). Incuber pendant 5 min à température ambiante sur une plate-forme à bascule à 30 tours. Transférer les biopsies à un d stérileish décante le contenu du tube de 15 ml avec du HBSS.
2. Perturber mucus avec TNT: Remplacer le HBSS dans le tube avec 10 ml de HBSS contenant 5 mM de 1,4-dithiothréitol (DTT). Transférer les biopsies dans le tube de 15 ml en utilisant des pinces stériles. Incuber pendant 15 min à température ambiante sur une plate-forme à bascule à 30 tours.
3. Vortex doucement le tube pendant 15 secondes. Transférer les biopsies sur une boîte stérile décante le contenu du tube de 15 ml avec du HBSS et TNT.
4. Transfert des biopsies pour le milieu de culture: Remplacer le HBSS et de la TNT dans le tube avec 10 ml de RPMI 1640 milieu de culture. Transférer les biopsies dans le tube de 15 ml en utilisant des pinces stériles. Incuber pendant 10 min à température ambiante sur une plate-forme à bascule à 30 tours.
5. Digérer biopsies avec collagénase et DNase.
   1. Préparer une solution de digestion de collagénase II (0,25 mg / ml) et de la DNase (0,2 mg / ml) dans préchauffée RPMI contenant 1 M de solution de HEPES. Ajouter 500 pi de solution de digestion par puits dans un culte de tissu 48 puitsplaque ure.
   2. Placer 1 biopsie par puits dans une solution de digestion. Incuber la plaque sur une plate-forme sous agitation pendant 60 min à 37 ° C, à 220 tours par minute. Introduire à la pipette vers le haut et vers le bas après 30 minutes pour redisperser les biopsies, et après 60 minutes, de désagréger complètement le tissu.
6. La préparation de suspensions de cellules isolées.
   1. Piscine ensemble les biopsies digérées provenant des puits dans un tube de 50 ml, en le faisant passer à travers un tamis cellulaire de 40 pm. Recueillir les cellules restantes par lavage des puits avec un tampon FACS glacé (solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 2% de sérum de fœtus bovin).
   2. Presser le tissu restant sur le tamis cellulaire en utilisant le retour du piston d'une seringue. Centrifuger les cellules digérées à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez délicatement le surnageant et remettre le culot dans 5 ml de tampon FACS glacé. Compter les cellules manuellement à l'aide d'un hémocytomètre et Trypan bleuissement pour évaluer la viabilité des cellules.

7. Cytométrie en flux Analyse des cellules simples de endobronchique Biopsies après Enzymatic Digestion

1. Remettre en suspension le culot de cellules à environ 1 x 10 ⁶ cellules dans 200 ul de tampon FACS.
2. Ajouter un colorant de viabilité cellulaire pour mort cellulaire d'exclusion, selon le protocole du fabricant.
3. Ajouter 5 ul de FcR réactif de blocage et incuber pendant 5 min à 4 ° C.
4. Ajouter des anticorps de surface cellulaire contre CD45 (2 ul), de la lignée (CD3, CD20, CD56, CD66abce, et CD14; 2 pl chacun), CD16 (0,5 ul), HLA-DR (3 ul), CD11c (5 ul), CD123 (5 pi), CD1c (3 pi), et CD103 (2 pi) et incuber pendant 15 min à 4 ° C. Les détails sur les anticorps peuvent être trouvés dans la section des méthodes, mais titrent et d'optimiser les anticorps à l'écoulement précis cytomètre en cours d'utilisation. Laver les anticorps en excès avec du PBS pendant 5 min à 400 x g. Acquérir les échantillons frais sur un cytomètre de flux ou de fixer les cellules dans 1% de paraformaldehyde avant acquisit plus tardion.
5. Identifier les CD humaines dans les biopsies pulmonaires en utilisant une cytométrie en flux dosage ¹⁸ (Figure 4).
   NOTE: L'utilisation d'un flux cytométrie logiciel d'analyse, les cellules immunitaires se distinguent des autres cellules pulmonaires par gating sur CD45. Les cellules mortes peuvent être exclus comme des cellules qui sont positives pour le colorant, LIVE / DEAD. Tout d' CD45 ⁺ cellules vivantes, des cellules de la lignée (cellules B, les cellules T, les cellules NK, les neutrophiles et monocytes) peuvent être exclus en utilisant un cocktail d'anticorps anti - CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 et CD16 dans un canal. Après que les cellules, HLA-DR ⁺ permettront l'identification de tous les CD humaines. Les MDC peuvent être distinguées des PDCs basées sur l'expression de CD11c ou l'absence de CD11c, respectivement. MDC peuvent être divisés en CD1c ⁺ ou CD141 ⁺ MDC.

Résultats

Les études caractérisant les cellules immunitaires humaines respiratoires tissus-résident, y compris les pays en développement, sont limitées, en grande partie en raison du fait que chirurgicalement enlevé ou tissu entier de poumon humain est rare. Ici, une méthode moins invasive d'obtenir le tissu pulmonaire à partir de biopsies bronchiques (EBB) des volontaires sains et des protocoles mis au point pour étudier les cellules immunitaires dans le tissu par immunohistochimie o...

Discussion

Cet article décrit comment générer une caractérisation spatiale et phénotypique détaillée du poumon PED tissus résidents chez l'homme sain par immunohistochimie et cytométrie en flux sur des biopsies muqueuses bronchiques recueillies au cours de la bronchoscopie. Dans les paragraphes qui suivent les étapes critiques dans le protocole sont discutés en détail.

Étapes critiques avec le Protocole

Sectionner et immunohistochimie: Il est essentiel de gard...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160	Olympus	BF1T160
Light source	Olympus	Exera CV-160
Fenestrated forceps	Olympus	FB21C	Used to take biopsies
Bite Block	Conmed	1429	20 mm x 27 mm
Glucose 25%			500 ml intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml			Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o			Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40 mg/ml			Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100 mg/ml spray			Administered to back of throat
Lidocaine 20 mg/ml spray			Administered via bronchoscope to airways
GMA processing and embedding
Glass vials			5 ml
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-1L
Molecular sieves, 4 Å	Alfa Aesar	88120	3-4 mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P-7626	0.035 g/100 ml acetone
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I-6125	0.37 g/100 ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules	TAAB laboratories	C094	500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder	TAAB laboratories	C054	Holds 25 8 mm capsules
JB-4 GMA embedding kit	Polysciences	00226	Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate	Sigma-Aldrich	27614-1L
Silica gel with humidity indicator	Scharlau	GE0043	2.5-6 mm
GMA sectioning
Glass microscope slides	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy	Alkar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker	LKB
Capsule splitter	TAAB laboratories	C065
Carbon steel single edge blades	TAAB laboratories	B054
Vice
Ammonia, 25%	VWR	1133.1000	2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%)
Microtome	Leica		Leica RM 2165
Light source	Leica		Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand	Leica		Leica MZ6
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen	Histolab	5218
Hydrogen peroxide 30% solution	AnalaR Normapur	23619.264
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
Sodium chloride	VWR chemicals	27810.295
Bovine serum albumin	Millipore	82-045-2	Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anti-human CD45 antibody	BioLegend	304002	Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody	AbD Serotech	MCA80GA	Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control	Abcam	ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control	Dako	X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit	Vector Labs	PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite	Vector Labs	SK-4200
Mayers haematoxylin	HistoLab	01820
Permanent Aqueous Mounting Medium	AbD Serotech	BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution	VWR	360292F
Light microscope	Leica		Leica DMLB
Microscope camera	Leica		Leica DFC 320
Analysis software	Leica		Leica Qwin V3
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	55021C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885
DNase	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Forceps
Platform rocker	Grant instruments	PMR-30
50 ml conical tubes	Falcon	14-432-22
40 µm cell strainer	Falcon	352340
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit	Life Technologies	L34957
CD45	BD	555485
CD3	BD	557757
CD20	BD	335829
CD56	Biolegend	318332
CD66abce	Miltenyi	130-101-132
HLA-DR	BD	555813
CD14	BD	557831
CD16	Biolegend	302026
CD11c	BD	560369
CD1c	Miltenyi	130-098-009
CD141	Miltenyi	130-090-514
CD103	Biolegend	350212
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
LSR II Flow cytometer	BD		Flow cytometer
FlowJo	FlowJo		Software for analysis