면역 및 유동 세포 계측법을 사용하여 기관지 생검의 공간 분포 및 표현형 확인 : 인간의 폐 수지상 세포

요약

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

초록

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

서문

폐는 외부 환경과 연속적인 접촉이 높은 질환을 유발하는 능력 모두에 무해 입자와 미생물에 노출된다. 따라서, 침입 병원균에 대한 강력한 면역 반응을 탑재 면역계에 중요하지만, 질병의 원인이없는 흡입 항원에 대한 내성을 유지하는 것도 중요하다. 강력한 면역 감시를 제공하기 위해 호흡기는 수지상 세포를 포함하여 면역 세포의 네트워크 늘어서있다. 수지상 나이브 T 세포를 활성화 할 수있는 독특한 능력을 가진 전문적인 항원 제시 세포이다. 인간 폐, 상주 수지상 항원 다음 프로세스가 발생하여 T 세포를 ^{1, 2, 3으로} 표시 및 활성화에 대한 폐 림프절로 전송.

인간 면역계 DCS는 디스탱으로 여러 서브 세트들로 분할 될 수있다CT하지만 중복 기능 : CD1c ^+와 CD141 ⁺ 골수성 수지상 세포 (MDC에) 및 CD123 ⁺ 형질 DC가 (올라가고) ^{4, 5.} 인간 수지상 가장 상세한 기술은 혈액 유래 연구 동안, 인간의 폐는 T 세포 자극 용량 ^{6, 7, 8, 9} DC 서브 세트 드문 인구 항구 것이 이제 명백하다. 그러나, 누적 데이터는 수지상 세포를 포함하는 면역 세포가 자신의 해부학 적 위치 ^(10)에 따라 빈도, 표현형 및 기능에 차이가 있음을 보여준다. 따라서, 로컬 면역 관용에 대한 그들의 기여를 이해하기 위해 관련 조직에서 면역 세포를 연구하는 것이 중요하다. 함께 찍은,이 혈액 DC가 더 쉽게 사용 가능하고 접근에도 불구하고, 폐 질환을 해결하면 폐 상주 수지상 세포를 연구 할 필요성을 강조 인간한다.

인간 폐 상주 수지상 조사 제의 연구는 주로 면역 ^{11, 12, 13을} 이용하여 조직 절편에서 형태 및 HLA-DR의 CD11c와 같은 하나의 마커의 발현에 의존했다. 대조적으로, 통상적으로 유세포에 의존 더 최근의 연구는 다양한 면역 세포 서브 세트를 연구 분석한다. 그 고유 특정 DC 서브 세트를 식별하는 하나의 세포 표면 마커를 찾는 것은 어렵다 때문에, 연구의 전위 한계는 단지 4 색은 유세포인가하는 수지상 세포와 유사한 표현형 마커와 세포 집단 등의 위험이있다. 예를 들어, 중 CD11c 모든 골수성 수지상 세포와 단핵 세포의 대부분에 표현된다. 한편, 연구 고급 유동 세포 계측법 패널을 적용하여 환자의 수술 적 절제로부터 비 암성 폐 조직은 통상적으로 사용 된외부 참조 "> ^{10, 14, 15, 16은,} 이들 희소 인구 건강한 피험자의 DCS 본 진정 대표 불분명 않는다. 전체적으로 연구 인해 수술 제거 또는 전부를 인간 폐 조직이 부족하다는 사실에 크게 제한된다.

이러한 한계들을 극복하기 위해,이 작품은 공간 분포와 기관지 내시경을 받아야 건강한 지원자에서 얻은 점막 기관지 생검에서 수지상 세포의 표현형 식별에 대한 자세한 분석을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 작은 생검 각에서 수집 될 수 있고,이어서 절편 분석 고급 유세포 분석을위한 분해 효소를 사용하여 면역 조직 화학 또는 임베디드 될 수있다. bronchoscopies 얻은 기관지 생검 형태의 폐 조직을 사용하는 것은 가능 명세서를 수행 할 수있게하는 장점을 부여udy는 건강한 지원자에서, 폐의 개복 수술과는 달리 분명한 이유, 흉부 수술이 필요한 환자에게 제한되어있다. 또한, 건강한 지원자에서 기관지 중 샘플링되는 조직은 폐 질환을 가진 환자의 폐 조직의 영향을받지 않는 영역에 대조적으로, 생리 학적으로 정상인. 한편, 생검 작은 여러 생검 풀링에도 검색된 셀의 수는 수행 될 수있는 분석의 유형을 제한한다.

본 연구는 수지상 세포에 초점을 맞추고 있지만, 직접 확장 할 수 있습니다 설명하는 방법은 인간의 점막 폐 조직에있는 관심의 다른 (면역) 세포를 포함합니다. 또한, 프로토콜은 기관지 같은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 유육종증, 폐 암으로 진단을 확립의 일부 폐 질환을 앓고있는 환자로부터 얻은 샘플에 직접 적용 할 수있다.

프로토콜

참고 :이 연구는 우메 아, 스웨덴의 지역 윤리 심의위원회에 의해 승인되었다.

인간의 주제에서 샘플링 기관지 생검 1. 기관 지경

1. 모든 참가자의 동의를 얻습니다.
2. 경구 용 미다 졸람 (4-8 mg) 및 정맥 glycopyrronium (0.2-04 mg을)를 기관지 전에 30 분으로 주제를 취급합니다. 후두와 기관지에 리도카인으로 국소 마취를 적용합니다. 리도카인 4 % ~ 3 ㎖와 제목 양치질을하자 혀베이스와 후두 주사기를 통해 후두에 3 ㎖를 적용합니다. 리도카인 스프레이의 8-10 투여와 국소 마취를 최적화합니다. 제목 앉아이 단계를 수행합니다.
3. 앙와위에서 주제와 플라스틱 마우스 피스를 통해 입을 통해 유연한 비디오 기관 지경을 삽입합니다. 기관 지경을 통해 말단 기관 및 기관지의 국소 마취를 완료 할 목적으로 만든 스프레이 카테터를 사용합니다. 여기에, 약의 복용량을 사용리도카인 2 % ~ 10 mL로.
4. 6-9 주 카리나에서 기관지 점막 생검과 유창 집게를 사용하여 주 기관지 부문 (그림 1) 가져 가라. 기관지 내시경을 다음과 병원을 떠나기 전에, 2-4 시간 동안 주제 나머지를하자 가벼운 식사와 함께 그를 / 그녀를 제공합니다.

2. 글리콜 메틸 아크릴 레이트 (GMA) 수지의 생검을 포함하기

주 : GMA의 면역 프로토콜은 원래 사우 샘프 턴 대학, 조직 화학 연구 ^(17)에서 개발되었다.

1. 고정 : 면역 조직 화학 법의 경우, 집게로부터 생검을 제거하고 (얼음 - 냉각 탈수 아세톤 및 프로테아제 저해제 3 ㎖을 함유하는 유리 병에 직접 페닐 메틸 술 포닐 플루오 라이드 (35 밀리그램 / 100 ml의 아세톤)을 넣고 요오도 아세트 아미드 (370 밀리그램 / 100 ml의 아세톤 )). -20 ° C (그림 2)에서 하룻밤 조직을 수정합니다.
   참고 : 다음 단계를 PERFO한다적절한 니트릴 장갑 흄 후드에서 rmed. 매립 키트 과민, 자극, 및 / 또는 알레르기 성 피부 반응을 일으킬 수있는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 모든 폐기물은 유해 폐기물로 폐기되어야합니다.
2. 탈수 : 억제제와 아세톤을 제거하고 실온에서 15 분 (RT)에 대한 (억제제)없이 신선한 탈수 아세톤으로 교체합니다. 아세톤을 제거하고 15 분 동안 메틸 벤조 에이트로 교체합니다.
3. 침투 : 글리콜 메타 크릴 레이트 단량체의 5 % 메틸 벤조 에이트 용액의 처리 액을 준비한다; 10 ㎖ 바이알 한 충분하다. 메틸 벤조 에이트 용액 오프 플라스틱 파스퇴르 피펫 흡입을 이용하여 처리 액 3ml를 교체. 생검 2 시간 동안 4 ° C에서 초과 처리 솔루션을 품어; 파스퇴르 피펫 용액 매립 포함한 모든 후속 용액 변화에 사용될 수있다.
4. 처리 액마다 2 시간 (3X 2 시간 인큐베이션)이므로 생체의 합계 함침 시간을주고처리 액에 psies 적어도 6 시간이다. 생검을 식별하기 위해 삽입 캡슐의 상단에 종이 라벨을 삽입합니다.
5. 글리콜 메타 크릴 레이트 단량체를 10 ml의 75 mg의 벤조일 퍼 옥사이드 매립 용액을 제조 하였다. 중합 반응을 시작하기 위해 매립 용액에 N, N -dimethylaniline 폴리 (에틸렌 옥사이드) 0.25 ㎖ (가속기)를 추가한다. 처리 액을 제거하고 집게를 사용하여 관련 매립 캡슐에 한 생검을 놓는다.
6. 천천히 솔루션을 포함로 가기 포함 캡슐을 채우고 뚜껑을 닫습니다. 생검을 방해하고 큰 공기 방울을 생성하지 마십시오. 수지가 완전히 중합 될 때까지 4 ℃에서 캡슐을 품어.
7. 실리카겔 약 5g을 함유하는 50 ㎖ 튜브에서 -20 ° C에 보관 매립 생검.

GMA 내장 기관지 생검 3. 단면

1. 현미경 슬라이드 코팅 : A의 현미경 슬라이드를 씻으정상주기에 식기 세척기. 슬라이드를 덮고 건조 공기로 할 수 있습니다.
2. 증류수 10 % 폴리 -L- 리신 (PLL) 용액의 도포 액을 준비한다. 5 분 동안 코팅 용액의 슬라이드 잠수함, 다음 그들에게 자연 건조를 할 수 있습니다. 원래 상자에 건조 PLL 코팅 된 슬라이드를 저장합니다.
3. 증류수에 0.1 %의 트윈 20을 시트 유리 스트립을 씻으십시오. 종이 타월로 70 % 에탄올 건조와 유리를 씻어. 칼 메이커를 사용하여 유리 스트립 유리 블레이드를 잘라. 절삭 날이 손상되거나 흠집되지 않도록 이동을 방지 용기에 블레이드를 저장한다.
4. 생검 트리밍 : 캡슐 분배기의 생검 캡슐을 놓고 탄소 강철 단일 에지 블레이드를 사용하여 각면을 잘라. GMA 내장 조직 검사를 제거하고 그 단단히 놓습니다. 철강 블레이드를 사용하여 조직 검사 주위에서 초과 GMA을 낸다.
5. GMA의 단면.
   1. 증류수 0.05 % 암모니아 용액을 준비합니다. 일에서 유리 나이프와 조직 검사를 배치전자 마이크로톰. 조심스럽게 블레이드 블록의 표면에 대해 평평하게 걸쳐 지도록 나이프 홀더 생검 블록의 각도를 조절함으로써 블레이드 생검 블록 정렬.
   2. 느린 절단 속도에 마이크로톰을 사용하여 2 μm의 두께 부분을 잘라 전송하고 암모니아수에 섹션을 떠 집게를 사용합니다. 부드러운 항원 검색을 허용하고 섹션의 전개, 45-90 초 동안 섹션을 플로트.
   3. 현미경 슬라이드에 섹션을 선택합니다. 빨리 톨루이딘 블루 염색에 의해 생검 조직 검사를 확인합니다.
   4. 50 ° C에 핫 플레이트 세트에 슬라이드를 건조 및 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 섹션을 여과 톨루이딘 블루 염색의 500 μl를 적용합니다. 녹색 링이 얼룩의 가장자리에 등장하기 시작할 때까지 뜨거운 접시에 절을 따뜻하게 한 다음 물로 씻어 내십시오.
   5. 광학 현미경을 사용하여, 생검 조직 검사를 확인합니다. 면역 조직 화학 염색에 사용되는 섹션은 손상되지 않은 얇은 판의 좋은 부분을 포함해야적은 수의 분비 가능한 한 작은 평활근과 고유 층과는 상피.
   6. 섹션 3.4.2에서와 같이, 좋은 조직학이 부분을 절단 및 면역 조직 화학 염색을위한 PLL 코팅 현미경 슬라이드로를 선택합니다. 분석을 위해 각 조직 검사에서 적어도 두 부분을 잘라. 적어도 1 시간 동안 건조 슬라이드. 건조 후, 절편 주석 호일로 래핑 할 수 있고, 최대 2 주 동안 -20 ℃에서 보관하거나 즉시 면역 염색 할 수있다.

GMA 내장 기관지 생검 4. 면역 조직 화학 염색

주 : 아 지드 화 나트륨은 독성이있다. 흄 후드 내의 0.1 % 나트륨 아 지드의 용액을 제조하고 산으로부터 멀리. 산에 접촉하면 유독 가스를 방출합니다.

1. 다이아몬드로 만들어진 펜을 사용하여 섹션을 주위에 그려 염색 선반 위에 슬라이드를 정렬합니다.
2. 퍼 옥시 다제 블록을 수행합니다. 0.1 % 아 지드 화 나트륨 용액에 0.3 %의 과산화수소를 퍼 옥시 다제 블록 용액을 제조 하였다. 출원Y 1 부에 퍼 옥시다아제 블록 ㎖를 30 분 동안 배양한다.
3. 0.05 M 트리스 완충 식염수 (TBS), 산도 7.6의 세척 용액을 준비합니다. , TBS에서 3 배 5 분 슬라이드를 씻으십시오.
4. DMEM의 1 % BSA 블록 솔루션을 준비합니다. 사전에 큰 볼륨, 나누어지는에서이 작업을 수행하고 필요한 때까지 동결. 슬라이드 드레인 비특이적 결합 된 항체를 차단하는 블록을 30 분 동안 용액 중에서 섹션을 배양한다. 비특이적 결합은 여전히 ​​발생하면, 이차 항체와 같은 종으로부터의 5 % 혈청 블록과 함께 30 분간 배양 단계를 포함한다.
5. (:; 따라 CD1a 1로 희석 1,000 : 1,00 1 희석 CD45) 및 슬라이드에 적용하여 원하는 농도로 TBS에서 차 항체 (CD45 또는 따라 CD1a)를 희석. 섹션을 커버 슬립과 RT에서 밤새 품어.
6. TBS에서 세 번 슬라이드를 씻으십시오. (TBS에서 원하는 농도 _(2)이 경우, 토끼 항 마우스 F (AB '에서 일차 항체 숙주 종에 대해 유도) 1:30 비오틴 차 항체 희석0 희석)과 슬라이드에 적용됩니다. 실온에서 2 시간 동안 품어.
7. 사용하기 전에 스트렙 타비 딘 비오틴 - 퍼 옥시 다제 복잡한 적어도 30 분을 준비합니다. 모든 슬라이드를 커버하기에 충분 있는지 확인하십시오. TBS에서 세 번 슬라이드를 씻으십시오. 슬라이드에 대한 해결책을 적용하고 실온에서 2 시간 동안 품어.
8. TBS에서 세 번 슬라이드를 씻으십시오. 3- 아미노 9 에틸 카바 졸 (제조업체의 지침에 따라 제조) (AEC) 퍼 옥시 다제 기질 용액을 준비합니다. 슬라이드에 적용하고 20 ~ 30 분 동안 또는 원하는 얼룩 강도가 개발 될 때까지 배양한다.
9. 5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻어. 2 분 동안 여과 마이어의 헤 마톡 솔루션 섹션을 Counterstain과. 5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻으십시오.
10. 슬라이드를 배출하고 영구적 인 수성 장착 매체와 섹션을 커버한다. 건조 오븐에서 80 ℃에서 슬라이드를 건조. 슬라이드 냉각 한 다음 DPX로 장착하고 커버 슬립을 배치 할 수 있습니다.

5. 세인트aining 분석

1. 컴퓨터에 연결 탑재 된 카메라로 광학 현미경을 사용하여 40X 배율 섹션을 분석합니다.
   참고 : 세포 분석을 위해 적극적으로 부드러운 근육, 동맥, 큰 혈관과 일치하지 않는 또는 손상된 조직의 영역을 제외하고, 기관지 점막 고유 그대로 상피 세포 내 핵 세포를 염색 카운트.
2. 세포 수를 평균 고유 층의 면적 및 상피의 길이에 대한 평균 세포 수를 수정한다. 고유 판 및 상피의 길이의 영역은, 화상 해석 프로그램을 사용하여 계산 될 수있다.

기관지 생검 6. 효소 소화

1. 세탁기 생검 : 행크 완충 식염수 용액 (HBSS) (도 3) 10 ㎖를 함유하는 15 ml의 원추형 튜브에 무균 핀셋 장소 생검 그대로 사용. 30 rpm에서 락을 플랫폼에서 RT에서 5 분 동안 품어. 멸균 D에 조직 검사로 이동HBSS로 15ml의 튜브의 함유량을 경사하여 틱.
2. DTT와 점액을 중단 : 5 mM의 1,4- 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 포함 HBSS 10 ㎖로 튜브의 HBSS를 교체합니다. 멸균 집게를 사용하여 15 ML 튜브에 다시 조직 검사를 전송합니다. 30 rpm에서 락 플랫폼에서 실온에서 15 분 동안 품어.
3. 15 초 동안 부드럽게 튜브를 소용돌이. HBSS DTT와 함께 15 ml의 튜브의 함유량을 경사 분리하여 멸균 접시 상 생검을 전송.
4. 문화 매체에 조직 검사를 전송 : RPMI 1640 배지 10 ㎖로 튜브의 HBSS과 DTT를 교체합니다. 멸균 집게를 사용하여 15 ML 튜브에 다시 조직 검사를 전송합니다. 30 rpm에서 락 플랫폼에서 실온에서 10 분 동안 품어.
5. 콜라게나 제와 DNase의와 생검을 소화.
   1. 1 M HEPES 용액을 함유하는 예비 가온 RPMI에서 콜라게나 제 II (0.25 ㎎ / ㎖)과의 DNase (0.2 ㎎ / ㎖)의 분해 용액을 제조 하였다. 48 웰 조직 숭배에 500 μL 잘 당 소화 용액 추가URE 판.
   2. 소화 용액 아니라 당 조직 검사를 놓습니다. 220 rpm에서 37 ° C에서 60 분 동안 진탕 플랫폼에서 접시를 품어. 피펫 30 분의 생검을 재 분산 한 후 아래로, 그리고 60 분 후가 완전히 조직들을 분해한다.
6. 단일 세포 현탁액을 준비.
   1. 함께 수영장 40 μm의 셀 스트레이너를 통과하여 50 ㎖ 튜브에 우물에서 소화 생검. 얼음처럼 차가운 FACS 완충액 (인산염 완충 식염수 (PBS)를 함유하는 2 % 소 태아 혈청)으로 웰을 세척하여 잔여 세포를 수집한다.
   2. 주사기의 플런저의 뒷면을 사용하여 세포 여과기에 남아있는 조직을 짠다. 4 ℃에서 5 분 동안 400 XG에서 소화 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 얼음 - 냉각 된 FACS 완충액 5 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 수동으로 세포의 생존력을 평가하기 혈구 및 트립 판 블루 염색을 이용하여 세포 수를 계산.

7. 효소 분해 후 기관지 생검의 단일 세포의 유세포 분석

1. FACS 완충액 200㎕를 약 1 × ¹⁰⁶ 세포의 세포 펠렛을 resuspend.
2. 제조 업체의 프로토콜에 따라 죽은 세포 배제에 대한 세포 생존 염료를 추가합니다.
3. 의 FcR 차단 시약의 5 ​​μl를 추가하고 4 ℃에서 5 분 동안 품어.
4. , CD16 (0.5 μL), HLA-DR (3 μL)의 CD11c (5 μL), CD123, CD45 (2 μL), 계보 (2 ㎕를 각 CD3, CD20, CD56, CD66abce 및 CD14)에 대한 세포 표면 항체 추가 (5 μL), CD1c (3 μL), 및 CD103 (2 μL), 4 ℃에서 15 분 동안 품어. 항체에 대한 세부 사항은 방법 섹션에서 찾을 수 있지만, 사용 사이토 정확한 흐름에 항체를 적정하고 최적화 할 수 있습니다. 400 X g에서 5 분 동안 PBS로 여분의 항체를 씻으십시오. 사이토의 흐름에 신선한 샘플을 취득 이상 acquisit 이전에 1 % 파라 포름 알데히드의 세포를 고정이온.
5. 분석 ⁽¹⁸⁾ (그림 4) 세포 계측법 흐름을 사용하여 폐 조직 검사에서 인간의 수지상 세포를 식별합니다.
   주 : 분석 소프트웨어 유세포를 사용하여, 면역 세포가 CD45에 게이팅하여 다른 폐 세포로부터 구별된다. 죽은 세포는 LIVE / DEAD 염료에 대한 긍정적 인 세포로 제외 할 수 있습니다. 모든 살아있는 CD45 ⁺ 세포 계통 세포 (B 세포, T 세포, NK 세포, 호중구 및 단핵 세포)의 한 채널에서 CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 및 CD16에 대한 항체의 칵테일을 사용하여 배제 할 수있다. , HLA-DR ⁺ 세포가 인간의 모든 DC가의 식별을 허용 할 것을 다음과 같습니다. 이 중 CD11c MDC에 발현하는 CD11c 또는 각각의 부재에 기초하여 올라가고 구별 될 수있다. MDC에 더 CD1c ⁺ MDC에 또는 CD141 ^+로 나눌 수 있습니다.

결과

DC를 비롯한 인간 호흡기 조직 상주 면역 세포를 특성화 연구는 주로 수술로 인해 제거되거나 전체 인간 폐 조직이 부족하다는 사실을 한정한다. 여기서, 면역 세포 계측법을 사용하여 조직의 면역 세포를 분석하거나, 유동 건강한 지원자 및 개발 프로토콜 기관지 생검 (EBB)로부터 폐 조직을 얻는 덜 침습적 방법이 설명된다.

?...

토론

이 논문은 면역 조직 화학 염색을 이용하여 건강한 인간의 폐 조직 상주 수지상의 상세한 공간 및 표현형 특성을 생성하고 기관지 동안 수집 된 기관지 점막 생검에 유동 세포 계측법하는 방법에 대해 설명합니다. 다음 단락에서 프로토콜의 중요한 단계를 자세히 설명합니다.

프로토콜과 중요한 단계

단면 및 면역 : 그것은 그들이 (단계 2.5)를 사용하지 않...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160	Olympus	BF1T160
Light source	Olympus	Exera CV-160
Fenestrated forceps	Olympus	FB21C	Used to take biopsies
Bite Block	Conmed	1429	20 mm x 27 mm
Glucose 25%			500 ml intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml			Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o			Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40 mg/ml			Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100 mg/ml spray			Administered to back of throat
Lidocaine 20 mg/ml spray			Administered via bronchoscope to airways
GMA processing and embedding
Glass vials			5 ml
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-1L
Molecular sieves, 4 Å	Alfa Aesar	88120	3-4 mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P-7626	0.035 g/100 ml acetone
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I-6125	0.37 g/100 ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules	TAAB laboratories	C094	500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder	TAAB laboratories	C054	Holds 25 8 mm capsules
JB-4 GMA embedding kit	Polysciences	00226	Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate	Sigma-Aldrich	27614-1L
Silica gel with humidity indicator	Scharlau	GE0043	2.5-6 mm
GMA sectioning
Glass microscope slides	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy	Alkar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker	LKB
Capsule splitter	TAAB laboratories	C065
Carbon steel single edge blades	TAAB laboratories	B054
Vice
Ammonia, 25%	VWR	1133.1000	2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%)
Microtome	Leica		Leica RM 2165
Light source	Leica		Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand	Leica		Leica MZ6
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen	Histolab	5218
Hydrogen peroxide 30% solution	AnalaR Normapur	23619.264
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
Sodium chloride	VWR chemicals	27810.295
Bovine serum albumin	Millipore	82-045-2	Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anti-human CD45 antibody	BioLegend	304002	Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody	AbD Serotech	MCA80GA	Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control	Abcam	ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control	Dako	X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit	Vector Labs	PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite	Vector Labs	SK-4200
Mayers haematoxylin	HistoLab	01820
Permanent Aqueous Mounting Medium	AbD Serotech	BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution	VWR	360292F
Light microscope	Leica		Leica DMLB
Microscope camera	Leica		Leica DFC 320
Analysis software	Leica		Leica Qwin V3
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	55021C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885
DNase	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Forceps
Platform rocker	Grant instruments	PMR-30
50 ml conical tubes	Falcon	14-432-22
40 µm cell strainer	Falcon	352340
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit	Life Technologies	L34957
CD45	BD	555485
CD3	BD	557757
CD20	BD	335829
CD56	Biolegend	318332
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LSR II Flow cytometer	BD		Flow cytometer
FlowJo	FlowJo		Software for analysis