Las células dendríticas humanas de pulmón: distribución espacial y fenotípica de identificación en endobronquial biopsias mediante inmunohistoquímica y citometría de flujo

Resumen

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Resumen

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Introducción

Los pulmones están en contacto continuo con el medio externo y están muy expuestas a ambas partículas inofensivas y microbios con la capacidad de causar la enfermedad. Por lo tanto, es crítico para el sistema inmune para montar respuestas inmunes potentes contra los patógenos invasores, pero es igualmente importante para mantener la tolerancia a los antígenos inhalados que no causan enfermedad. Para proporcionar la vigilancia inmune potente, el sistema respiratorio se alinea con una red de células inmunes, incluyendo células dendríticas (DC). DC son células presentadoras de antígeno profesionales con la capacidad única de activar las células T vírgenes. En los pulmones humanos, DCs residentes encuentran un antígeno y entonces el proceso y lo transportan a los ganglios linfáticos pulmonares de drenaje para su presentación a y activación de células T ^{1, 2, 3.}

En el sistema inmune humano, los DC se puede dividir en varios subconjuntos, con Distinct pero superpuestas funciones: CD1c ⁺ y CD141 ⁺ DC mieloides (PMD) y CD123 ⁺ plasmacytoid países en desarrollo (PDC) ^{4, 5.} Mientras que la mayoría conocimiento detallado en países en desarrollo humano se deriva de estudios en la sangre, es ahora evidente que los pulmones humanos también albergan poblaciones raras de subconjuntos de DC con las células T capacidad estimuladora ^{6, 7, 8, 9.} Sin embargo, la acumulación de datos muestran que las células inmunes, incluyendo países en desarrollo, difieren en su frecuencia, fenotipo y función dependiendo de su ubicación anatómica ^10. Por lo tanto, es importante para estudiar las células inmunes del tejido relevante para entender su contribución a la inmunidad local y la tolerancia. En conjunto, esto pone de relieve la necesidad de estudiar las CD pulmonares residente hora de abordar las enfermedades pulmonares, a pesar de ser más fácilmente disponible y accesible sangre países en desarrollo en humanos.

Los primeros estudios que investigaron las CD pulmonares residente en el ser humano se basó principalmente en la morfología y la expresión de marcadores individuales, tales como HLA-DR y CD11c, en secciones de tejido mediante inmunohistoquímica ^{11, 12, 13.} Por el contrario, los estudios más recientes se han basado generalmente en los análisis de citometría de flujo para estudiar diferentes subconjuntos de células inmunes. Sin embargo, ya que es difícil encontrar un solo marcador de la superficie celular que identifica de forma única un subconjunto específico de CC, la limitación potencial de los estudios aplicando citometría de flujo de cuatro colores solamente es el riesgo de incluir poblaciones de células con marcadores fenotípicos similares a los de los países en desarrollo. Por ejemplo, CD11c se expresa en todos los DC mieloides y la gran mayoría de los monocitos. Por otro lado, en los estudios de la aplicación de los paneles de citometría de flujo más avanzados, el tejido pulmonar no canceroso de resecciones quirúrgicas de los pacientes se usa típicamentexref "> ^{10, 14, 15, 16,} aunque no está claro si estas poblaciones raras son verdaderamente representativa de los DC presente en los sujetos sanos. En general, los estudios se limitan en gran parte debido al hecho de que quirúrgicamente eliminado o tejido pulmonar humano completo es escasa.

Para superar algunas de estas limitaciones, este trabajo describe cómo realizar un análisis detallado de la distribución espacial y una identificación fenotípica de los países en desarrollo en las biopsias de mucosa de la mucosa obtenidas de voluntarios sanos que se someten a una broncoscopia. Varios biopsias pequeñas se pueden recoger de cada individuo y, posteriormente, se pueden incorporar para seccionar y el análisis mediante inmunohistoquímica o enzimáticamente digerido para el análisis avanzado de citometría de flujo. El uso de tejido pulmonar en la forma de la biopsia endobronquial obtenidos de broncoscopias confiere la ventaja de hacer posible la realización de la study en voluntarios sanos, a diferencia de la cirugía abierta de los pulmones que, por razones obvias, se limita a los pacientes que requieren cirugía torácica. Además, el tejido que se muestrea durante una broncoscopia de voluntarios sanos es fisiológicamente normal, en contraste con un área no afectada del tejido pulmonar en pacientes con una enfermedad pulmonar. Por otro lado, las biopsias son pequeñas y el número de células recuperadas, incluso cuando la agrupación de varias biopsias, limita el tipo de análisis que se pueden realizar.

Mientras que el presente trabajo se centra en los países en desarrollo, los métodos descritos se puede ampliar directamente a incluyen otras células (inmunes) de interés que residen en el tejido de la mucosa de pulmón humano. Además, los protocolos son también directamente aplicables a muestras obtenidas de pacientes que padecen enfermedades pulmonares donde broncoscopia es parte de establecer el diagnóstico, tales como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), sarcoidosis, o cáncer de pulmón.

Protocolo

NOTA: Esta investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Ética regional en Umea, Suecia.

1. La broncoscopia para el muestreo endobronquial biopsias de sujetos humanos

1. Obtener el consentimiento informado de todos los participantes.
2. El tratamiento de sujetos con midazolam oral (4-8 mg) y glicopirronio intravenosa (0,2 a 04 mg) 30 minutos antes de la broncoscopia. Aplicar anestesia tópica con lidocaína en la laringe y bronquios. Dejar que el haga gárgaras con objeto ~ 3 ml de lidocaína al 4% y se aplican 3 ml de la base de la lengua y de la laringe a través de una jeringa laringe. Optimizar la anestesia tópica con 8-10 dosis de lidocaína en aerosol. Llevar a cabo este paso con el objeto de estar.
3. Inserte un broncoscopio flexible de vídeo a través de la boca a través de una boquilla de plástico con el sujeto en posición supina. Utilizar un catéter de pulverización a tales efectos para completar la anestesia tópica de la tráquea y los bronquios distales a través del broncoscopio. Aquí, utilizar una dosis de aproximadamente5-10 ml de lidocaína al 2%.
4. Tome 6-9 biopsias de la mucosa endobronquiales de la carina principal y las principales divisiones bronquiales utilizando fórceps fenestrada (Figura 1). Tras la broncoscopia y antes de abandonar el hospital, dejar que el resto sujeto durante 2-4 horas y proveer él / ella con una comida ligera.

2. Incorporación de las biopsias en glicol metacrilato (GMA) Resina

NOTA: El protocolo inmunotinción GMA fue desarrollado originalmente en la Universidad de Southampton, Unidad de Investigación histoquímica ^17.

1. Fijación: Para la inmunohistoquímica, retire las biopsias de las pinzas y colocarlos directamente en viales de vidrio que contienen 3 ml de inhibidores de la acetona y la proteasa deshidratados enfriado con hielo (fluoruro de fenilmetilsulfonilo (35 mg / 100 ml de acetona) y yodoacetamida (370 mg / 100 ml de acetona )). Fijar el tejido durante la noche a -20 ° C (Figura 2).
   NOTA: Los siguientes pasos deben ser performó en una campana extractora con guantes de nitrilo apropiado. El kit de incrustación contiene componentes que pueden causar reacciones de sensibilización, irritación y / o de la piel alérgica. Todos los residuos deben eliminarse como residuos peligrosos.
2. Deshidratación: eliminar la acetona con inhibidores y reemplazar con acetona deshidratada fresco (sin inhibidores) durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT). Eliminar la acetona y reemplazarlo con benzoato de metilo durante 15 minutos.
3. Infiltración: Preparar una solución de procesamiento de la solución de benzoato de metilo 5% en monómero de metacrilato de glicol; 10 ml es suficiente para un vial. El uso de pipetas Pasteur de plástico, de aspiración de la solución de benzoato de metilo y reemplazar con 3 ml de solución de procesamiento. Incubar las biopsias y solución de procesamiento en exceso a 4 ° C durante 2 horas; pipetas Pasteur se pueden utilizar para todos los cambios de soluciones posteriores, incluyendo la solución de inclusión.
4. Intercambiar la solución de procesamiento de cada 2 horas (3 x 2 incubaciones hr), por lo que el tiempo total de la infiltración de la biopsies en la solución de elaboración es de al menos 6 horas. Insertar etiquetas de papel en el extremo superior de las cápsulas de incrustación para identificar las biopsias.
5. Preparar una solución de incrustación de peróxido de benzoilo 75 mg en 10 ml de monómero de metacrilato de glicol. Añadir 0,25 ml de N, N dimetilanilina poli (óxido de etileno) (acelerador) a la solución de incrustación para comenzar la reacción de polimerización. Eliminar la solución de procesamiento y coloque una biopsia en la cápsula incrustación relevante el uso de fórceps.
6. llenar lentamente la incorporación de la cápsula en la parte superior con una solución de la incrustación y cerrar la tapa. Evitar molestar a la biopsia y la creación de grandes burbujas de aire. Incubar las cápsulas a 4 ° C hasta que la resina se ha polimerizado por completo.
7. Almacenar las biopsias incorporados a -20 ° C en un tubo de 50 ml que contenía aproximadamente 5 g de gel de sílice.

3. La sección del biopsia endobronquial incrustados-GMA

1. recubrimiento del portaobjetos del microscopio: Lavar los portaobjetos de microscopio en unalavavajillas en un ciclo normal. Tapar los portaobjetos y dejar que se sequen al aire.
2. Preparar una solución de recubrimiento de la solución de 10% de poli-L-lisina (PLL) en agua destilada. Sumergir los portaobjetos en solución de revestimiento durante 5 minutos, y luego dejar secar al aire. Almacenar diapositivas PLL recubiertos en seco en sus cajas originales.
3. Lavar las tiras de vidrio de hoja con 0,1% de Tween 20 en agua destilada. Enjuague el vaso con 70% de etanol y secar con toallas de papel. Cortar láminas de vidrio de la tira de cristal utilizando un fabricante de cuchillos. Almacenar las cuchillas en un recipiente que impide el movimiento para asegurar que el borde de corte no se dañe o mellado.
4. La biopsia de corte: Coloque la cápsula de biopsia en un divisor de la cápsula y reducir cada lado con una hoja de un solo filo de acero al carbono. Retire la biopsia incrustado-GMA y colocarlo firmemente en un tornillo de banco. Recorte el exceso de GMA de todo el biopsia utilizando la hoja de acero.
5. seccionamiento GMA.
   1. Preparar una solución de amoniaco 0,05% con agua destilada. Coloque la cuchilla de vidrio y biopsia en THe microtomo. alinear cuidadosamente el bloque de biopsia con la hoja mediante el ajuste del soporte de la cuchilla y el ángulo del bloque de biopsia de modo que la cuchilla se apoya plana contra la superficie del bloque.
   2. Cortar 2 micras de grosor utilizando el microtomo en una velocidad de corte lento y el uso de fórceps para transferir y flotar las secciones en el agua amoniacal. Flotar las secciones de 45-90 seg, lo que permite la recuperación de antígenos suave y despliegue de la sección.
   3. Recoge secciones con portaobjetos de microscopio. Compruebe la histología de la biopsia mediante tinción con azul de toluidina rápidamente.
   4. Secar los portaobjetos en un conjunto de placa caliente a 50 ° C y aplicar 500 l de toluidina filtrado mancha azul a una sección usando una pipeta de plástico Pasteur. Se calienta la sección sobre la placa caliente hasta un anillo verde comienza a emerger en el borde de la mancha, y luego lavar con agua.
   5. El uso de un microscopio de luz, compruebe la histología de la biopsia. Secciones utilizados para inmunohistoquímica deben contener buenas zonas de la lámina sin dañospropia y el epitelio, con el menor número de glándulas y tan poco músculo liso como sea posible.
   6. Al igual que en la sección 3.4.2, cortar secciones que tienen buena histología y recogerlos con portaobjetos de microscopio recubiertos de PLL para la tinción inmunohistoquímica. Corte al menos dos secciones de cada biopsia para su análisis. secar los portaobjetos durante al menos 1 hora. Después del secado, las secciones pueden ser envueltos en papel de aluminio y se almacenaron a -20 ° C durante un máximo de 2 semanas, o pueden ser inmunoti~neron inmediatamente.

4. La tinción inmunohistoquímica de biopsias endobronquiales incrustados-GMA

NOTA: La azida sódica es tóxica. Preparar la solución de azida de sodio al 0,1% dentro de una campana de ventilación y lejos de ácidos. El contacto con ácidos libera gas tóxico.

1. Dibujar alrededor de secciones usando un lápiz con punta de diamante y organizar las diapositivas sobre un estante de tinción.
2. Cabo un bloqueo de la peroxidasa. Preparar una solución de bloqueo de peroxidasa de peróxido de hidrógeno 0,3% en solución de azida de sodio 0,1%. Apply 1 ml de la peroxidasa bloque con las secciones y se incuba durante 30 min.
3. Preparar una solución de lavado de solución salina tamponada con Tris 0,05 M (TBS), pH 7,6. Se lavan los portas en TBS, 3x 5 min.
4. Preparar una solución de bloqueo BSA 1% en DMEM. Haga esto con antelación y en volúmenes grandes, alícuota y congelarlo hasta que se necesite. Escurrir las diapositivas e incubar las secciones en solución de bloqueo durante 30 minutos para bloquear la unión no específica de anticuerpos. Si se sigue produciendo la unión inespecífica, incluir una etapa de incubación de 30 min con el bloque 5% de suero de la misma especie como el anticuerpo secundario.
5. Diluir el anticuerpo primario (CD45 o CD1a) en TBS hasta la concentración deseada (CD45 diluido a 1: 1.000; CD1a diluido a 1: 1,00) y aplicarlo a las diapositivas. Cubreobjetos las secciones y se incuba durante la noche a RT.
6. Lavar los portaobjetos en TBS tres veces. Diluir anticuerpo secundario biotinilado (dirigido contra la especie huésped anticuerpo primario, en este caso de conejo anti-ratón F (ab _'2)) en TBS a la concentración deseada (1:300 dilución) y aplicarlo a las diapositivas. Incubar durante 2 horas a RT.
7. Preparar una estreptavidina biotina-peroxidasa complejo al menos 30 min antes de su uso. Asegúrese de que no es suficiente para cubrir todas las diapositivas. Se lavan los portas en TBS tres veces. Aplicar la solución a los portaobjetos y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente.
8. Se lavan los portas en TBS tres veces. Preparar 3-amino-9-etilcarbazol solución de sustrato de peroxidasa (AEC) (hecho por las instrucciones del fabricante). Aplicarlo a las diapositivas y se incuba durante 20-30 minutos o hasta que la intensidad de la mancha deseada desarrolla.
9. Enjuague los portaobjetos en agua corriente del grifo durante 5 minutos. CONTRATINCIÓN las secciones con solución de hematoxilina de Mayer filtrada durante 2 min. Se lavan los portas en agua corriente durante 5 minutos.
10. Escurrir las diapositivas y cubrir las secciones con medio de montaje acuoso permanente. Secar los portaobjetos a 80 ° C en un horno de secado. Deje que los portaobjetos se enfríen, y luego se montan con DPX y colocar un cubreobjetos.

5. StAnálisis aining

1. Analizar las secciones a un aumento de 40X utilizando un microscopio de luz con una cámara montada conectado a un ordenador.
   NOTA: Para el análisis celular, cuente con tinción positiva, las células nucleadas dentro de la lámina propia y el epitelio bronquial intacta, excluyendo las áreas de músculo liso, glándulas, vasos sanguíneos grandes, y el tejido no coinciden o dañado.
2. La media de los recuentos de células y corregir el recuento de células promedio para el área de la lámina propia y la longitud del epitelio. El área de la lámina propia y la longitud del epitelio se puede calcular utilizando un programa de análisis de imagen.

6. La digestión enzimática de las biopsias endobronquiales

1. Biopsias de lavado: El uso de pinzas estériles, lugar biopsias intactas en un tubo cónico de 15 ml que contiene 10 ml de solución salina tamponada de Hank (HBSS) (Figura 3). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente en una plataforma oscilante a 30 rpm. La transferencia de las biopsias a un d estérilish por decantación el contenido del tubo de 15 ml con HBSS.
2. La interrupción de la mucosidad con TDT: Sustituir el HBSS en el tubo con 10 ml de HBSS conteniendo 5 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT). La transferencia de las biopsias de nuevo en el tubo de 15 ml usando pinzas estériles. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente en una plataforma oscilante a 30 rpm.
3. Vortex el tubo suavemente durante 15 segundos. La transferencia de las biopsias en una placa estéril por decantación el contenido del tubo de 15 ml con HBSS y DTT.
4. La transferencia de las biopsias al medio de cultivo: Sustituir el HBSS y TDT en el tubo con 10 ml de RPMI 1640 medio de cultivo. La transferencia de las biopsias de nuevo en el tubo de 15 ml usando pinzas estériles. Incubar durante 10 min a RT en una plataforma oscilante a 30 rpm.
5. La digestión de las biopsias con colagenasa y DNasa.
   1. Preparar una solución de digestión de la colagenasa II (0,25 mg / ml) y ADNasa (0,2 mg / ml) en RPMI precalentado que contiene solución 1 M HEPES. Añadir 500 l de solución de digestión por pocillo en un culto de tejido de 48 pocillosplaca de Ure.
   2. Coloca 1 biopsia por pocillo en una solución de digestión. Se incuba la placa en una plataforma de agitación durante 60 minutos a 37 ° C a 220 rpm. Pipeta hacia arriba y abajo después de 30 minutos para volver a dispersar las biopsias, y después de 60 minutos, al desagregar por completo el tejido.
6. Preparación de suspensiones de células individuales.
   1. Piscina juntos las biopsias digeridos de los pocillos en un tubo de 50 ml pasándolo a través de un filtro de células de 40 micras. Recoger las células restantes por lavado de los pocillos con tampón de FACS enfriado con hielo (solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía suero bovino fetal al 2%).
   2. Exprimir el tejido restante en el filtro de células usando la parte posterior del émbolo de una jeringa. Centrifugar las células digeridas a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Retirar con cuidado el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 ml de tampón FACS enfriado con hielo. Contar las células de forma manual utilizando un hemocitómetro y tinción de azul de tripán para evaluar la viabilidad de las células.

7. Análisis de citometría de flujo de células individuales de endobronquial biopsias después de digestión enzimática

1. Resuspender el sedimento celular a aproximadamente 1 x 10 ⁶ células en 200 l de tampón de FACS.
2. Añadir un colorante de viabilidad celular para la exclusión de células muertas de acuerdo con el protocolo del fabricante.
3. Añadir 5 l de FcR reactivo de bloqueo y se incuba durante 5 min a 4 ° C.
4. Añadir anticuerpos de superficie celular contra CD45 (2 l), el linaje (CD3, CD20, CD56, CD66abce, y CD14; 2 l cada una), CD16 (0,5 l), HLA-DR (3 l), CD11c (5 l), CD123 (5 l), CD1c (3 l), y CD103 (2 l) y se incuba durante 15 min a 4 ° C. Los detalles de anticuerpos se pueden encontrar en la sección de métodos, pero titulan y optimizar los anticuerpos para el flujo preciso citómetro en uso. Lavar el exceso de anticuerpos con PBS durante 5 minutos a 400 x g. Adquirir las nuevas muestras en un citómetro de flujo o fijar las células en paraformaldehído al 1% antes de la tarde acquisition.
5. Identificar países en desarrollo humano en biopsias pulmonares utilizando un ensayo de citometría de flujo ¹⁸ (Figura 4).
   NOTA: El uso de un software de análisis de citometría de flujo, las células inmunes se distinguen de otras células pulmonares colocando puertas de CD45. Las células muertas se pueden excluir como células que son positivas para el colorante LIVE / DEAD. De todos CD45 ⁺ células en vivo, las células de linaje (células B, células T, células NK, neutrófilos y monocitos) se puede excluir el uso de un cóctel de anticuerpos frente a CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14, y CD16 en un canal. Después de que las células, HLA-DR ⁺ permitirán la identificación de todos los países en desarrollo humano. MDC se pueden distinguir de PDC sobre la base de la expresión de CD11c o la falta de CD11c, respectivamente. MDC se pueden dividir en CD1c ⁺ MDC o CD141 ^+.

Resultados

Los estudios que caracterizan las células del tejido residente respiratorias humanas inmunes, incluyendo países en desarrollo, es limitado, debido en gran parte al hecho de que quirúrgicamente eliminado o tejido pulmonar humano completo es escasa. Aquí, un método menos invasivo para obtener tejido pulmonar a partir de biopsias endobronquiales (EBB) de voluntarios sanos y protocolos desarrollados para estudiar las células inmunes en los tejidos mediante inmunohistoquímica o citomet...

Discusión

En este documento se describe cómo generar una caracterización espacial y fenotípica detallada de las CD pulmonares de tejido residentes en los seres humanos sanos mediante inmunohistoquímica y citometría de flujo en biopsias de la mucosa endobronquiales recogidos durante la broncoscopia. En los párrafos siguientes pasos críticos en el protocolo se discuten en detalle.

Los pasos críticos con el Protocolo

Seccionamiento e inmunohistoquímica: Es fundamental p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160	Olympus	BF1T160
Light source	Olympus	Exera CV-160
Fenestrated forceps	Olympus	FB21C	Used to take biopsies
Bite Block	Conmed	1429	20 mm x 27 mm
Glucose 25%			500 ml intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml			Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o			Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40 mg/ml			Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100 mg/ml spray			Administered to back of throat
Lidocaine 20 mg/ml spray			Administered via bronchoscope to airways
GMA processing and embedding
Glass vials			5 ml
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-1L
Molecular sieves, 4 Å	Alfa Aesar	88120	3-4 mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P-7626	0.035 g/100 ml acetone
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I-6125	0.37 g/100 ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules	TAAB laboratories	C094	500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder	TAAB laboratories	C054	Holds 25 8 mm capsules
JB-4 GMA embedding kit	Polysciences	00226	Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate	Sigma-Aldrich	27614-1L
Silica gel with humidity indicator	Scharlau	GE0043	2.5-6 mm
GMA sectioning
Glass microscope slides	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy	Alkar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker	LKB
Capsule splitter	TAAB laboratories	C065
Carbon steel single edge blades	TAAB laboratories	B054
Vice
Ammonia, 25%	VWR	1133.1000	2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%)
Microtome	Leica		Leica RM 2165
Light source	Leica		Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand	Leica		Leica MZ6
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen	Histolab	5218
Hydrogen peroxide 30% solution	AnalaR Normapur	23619.264
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
Sodium chloride	VWR chemicals	27810.295
Bovine serum albumin	Millipore	82-045-2	Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anti-human CD45 antibody	BioLegend	304002	Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody	AbD Serotech	MCA80GA	Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control	Abcam	ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control	Dako	X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit	Vector Labs	PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite	Vector Labs	SK-4200
Mayers haematoxylin	HistoLab	01820
Permanent Aqueous Mounting Medium	AbD Serotech	BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution	VWR	360292F
Light microscope	Leica		Leica DMLB
Microscope camera	Leica		Leica DFC 320
Analysis software	Leica		Leica Qwin V3
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	55021C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885
DNase	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Forceps
Platform rocker	Grant instruments	PMR-30
50 ml conical tubes	Falcon	14-432-22
40 µm cell strainer	Falcon	352340
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit	Life Technologies	L34957
CD45	BD	555485
CD3	BD	557757
CD20	BD	335829
CD56	Biolegend	318332
CD66abce	Miltenyi	130-101-132
HLA-DR	BD	555813
CD14	BD	557831
CD16	Biolegend	302026
CD11c	BD	560369
CD1c	Miltenyi	130-098-009
CD141	Miltenyi	130-090-514
CD103	Biolegend	350212
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
LSR II Flow cytometer	BD		Flow cytometer
FlowJo	FlowJo		Software for analysis