Células Humanas Lung dendríticas: distribuição espacial e fenotípica Identificação em endobrônquica Biópsias imunohistoquímica e citometria de fluxo

Resumo

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Resumo

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Introdução

Os pulmões estão em contato contínuo com o ambiente externo e estão altamente expostos a ambas as partículas inofensivas e micróbios com a capacidade de causar doença. Portanto, é crítica para o sistema imunitário para montar respostas imunitárias potentes contra patogénios invasores, mas é igualmente importante para manter a tolerância a antigénios inalados que não causam doença. Para fornecer potente vigilância imunitária, o sistema respiratório é revestido com uma rede de células imunitárias, incluindo as células dendríticas (DC). DC são células profissionais de apresentação de antigénio, com a capacidade única para activar células T ingénuas. Em pulmões humanos, as DCs residentes encontram um antigénio e, em seguida, processo e transportá-lo para os gânglios linfáticos de drenagem do pulmão para a apresentação e a activação de células T ^{1, 2, 3.}

No sistema imunológico humano, as DCs pode ser dividido em vários sub-grupos, com Distinct mas sobrepostos funções: CD1c ⁺ e CD141 ⁺ DCs mielóides (MDCs) e CD123 ⁺ DCs plasmocitóides (PDCs) ^{4, 5.} Enquanto o conhecimento mais detalhado em DC humanas provém de estudos em sangue, é agora evidente que os pulmões humanos também abrigam populações raras de subconjuntos de DC com a capacidade de células T estimuladoras ^{6, 7, 8, 9.} No entanto, os dados mostram que se acumulam as células imunitárias, incluindo as DCs, diferem na sua frequência, fenótipo e função, dependendo da sua localização anatómica ^10. Assim, é importante para estudar as células imunes do tecido relevante para compreender a sua contribuição para a imunidade local e tolerância. Tomados em conjunto, o que sublinha a necessidade de estudar DCs pulmão residente quando confrontados com doenças pulmonares, apesar de DCs do sangue sendo mais prontamente disponíveis e acessíveis em humanos.

Os primeiros estudos que investigaram DCs pulmão residente em seres humanos se baseou principalmente na morfologia ea expressão de marcadores individuais, tais como HLA-DR e CD11c, em secções de tecido usando imunohistoquímica ^{11, 12, 13.} Em contraste, estudos mais recentes têm normalmente dependiam de citometria de fluxo analisa a estudar diferentes subpopulações de células imunes. No entanto, uma vez que é difícil encontrar um único marcador de superfície celular que identifica exclusivamente um subconjunto específico DC, a limitação potencial de estudos que se aplique apenas quatro cores de citometria de fluxo é o risco de, incluindo populações de células com marcadores fenotípicos semelhantes, como DCs. Por exemplo, CD11c é expressa em todos os DCs mielóides e a grande maioria dos monócitos. Por outro lado, estudos em painéis de aplicação mais avançada de citometria de fluxo, o tecido de pulmão não-cancerosas de ressecções cirúrgicas de pacientes foram tipicamente utilizadosrefex "> ^{10, 14, 15, 16,} embora não esteja claro se estas populações raras são verdadeiramente representativa de DCs presente em indivíduos saudáveis. No geral, os estudos são limitados, em grande parte devido ao facto de cirurgicamente removidas ou de tecido de pulmão humano total é escassa.

Para superar algumas destas limitações, este trabalho descreve como realizar uma análise detalhada da distribuição espacial e uma identificação fenotípica de DCs em biópsias endobrônquicas mucosas obtidas de voluntários saudáveis ​​que se submetem a uma broncoscopia. Várias pequenas biópsias podem ser coletadas de cada indivíduo e pode, posteriormente, ser incorporado para corte e análise utilizando imuno-histoquímica ou enzimaticamente digerido para análise avançada de citometria de fluxo. Utilizando tecido pulmonar sob a forma de biópsias endobronquiais obtidos a partir de broncoscopia confere a vantagem de tornar possível realizar o rudy em voluntários saudáveis, ao contrário da cirurgia aberta dos pulmões que, por razões óbvias, é limitado a pacientes que necessitam de cirurgia torácica. Além disso, o tecido que é amostrado durante uma broncoscopia de voluntários saudáveis ​​é fisiologicamente normal, em contraste com uma área não afectada do tecido pulmonar em pacientes com uma doença pulmonar. Por outro lado, as biópsias são pequenos e o número de células recuperadas, mesmo quando o agrupamento diversas biópsias, limita o tipo de análises que podem ser realizadas.

Embora o presente trabalho se concentra em DCs, os métodos descritos podem ser diretamente ampliada para incluir outras células (imunes) de interesse que residem no tecido da mucosa do pulmão humano. Além disso, os protocolos são também directamente aplicáveis ​​às amostras obtidas de pacientes que sofrem de doenças pulmonares, onde broncoscopia faz parte de estabelecer o diagnóstico, tais como a doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), sarcoidose, ou câncer de pulmão.

Protocolo

NOTA: Esta pesquisa foi aprovada pelo Conselho de Revisão Ética regional no Umeå, na Suécia.

1. A broncoscopia para Amostragem endobrônquica Biópsias de Seres Humanos

1. Obter o consentimento informado de todos os participantes.
2. Tratar indivíduos com midazolam oral (4-8 mg) e glicopirr�nio intravenosa (0,2-04 mg) 30 minutos antes da broncoscopia. Aplicar anestesia tópica com lidocaína na laringe e os brônquios. Deixe o gargarejo assunto com ~ 3 ml de lidocaína 4% e aplicar 3 ml à base da língua e na laringe através de uma seringa laringe. Otimizar a anestesia tópica com 8-10 doses de lidocaína spray. Realizar esta etapa com a estar sujeito.
3. Inserir um broncoscópio de vídeo flexível pela boca através de um bocal de plástico com o sujeito na posição supina. Use um cateter de pulverização feita de propósito para completar a anestesia tópica da traquéia distal e brônquios através do broncoscópio. Aqui, utilizar uma dose de aproximadamente5-10 ml de lidocaína a 2%.
4. Tome 6-9 biópsias da mucosa endobrônquica da carina principal e as principais divisões brônquicas usando uma pinça fenestrados (Figura 1). Após a broncoscopia e antes de deixar o hospital, deixar o resto assunto para 2-4 horas e fornecer a ele / ela com uma refeição ligeira.

2. Incorporação das biópsias em Glicol Metiloacrilado (GMA) Resin

NOTA: O protocolo imunocoloração GMA foi originalmente desenvolvido na Universidade de Southampton, Unidade histoquímica Investigação ^17.

1. Fixação: Para imuno-histoquímica, remover as biópsias do fórceps e colocá-las directamente em frascos de vidro contendo 3 ml de inibidores de acetona e protease desidratados gelado (fluoreto de fenilmetilsulfonilo (35 mg / 100 ml de acetona) e iodoacetamida (370 mg / 100 ml de acetona )). Corrigir o tecido durante a noite a -20 ° C (Figura 2).
   NOTA: Os seguintes passos devem ser performada em um exaustor com luvas de borracha nitrílica apropriadas. O kit incorporação contém componentes que podem causar reações de sensibilização, irritação e / ou de pele alérgica. Todos os resíduos devem ser eliminados como resíduos perigosos.
2. Desidratação: Remover a acetona com inibidores e substituir com acetona desidratada fresco (sem inibidores) durante 15 min à temperatura ambiente (TA). Remova a acetona e substituí-lo com benzoato de metilo em 15 min.
3. Infiltração: Prepara-se uma solução de processamento da solução de benzoato de metilo 5% em monómero de metacrilato de glicol; 10 ml é suficiente para um frasco para injectáveis. Usando pipetas de Pasteur de plástico, de aspiração a partir da solução de benzoato de metilo e substituir com 3 ml de solução de processamento. Incubam-se as biópsias e solução de processamento em excesso a 4 ° C durante 2 horas; Pipetas de Pasteur pode ser usado para todas as alterações de solução subsequentes, incluindo a incorporação de solução.
4. Troque a solução de processamento a cada 2 horas (3x 2 incubações hr), de modo que o tempo total de infiltração do biopsies na solução de transformação é de pelo menos 6 horas. Inserir etiquetas de papel para dentro da extremidade superior das cápsulas de embebimento para identificar as biópsias.
5. Prepara-se uma solução de incorporação de 75 mg de peróxido de benzoílo em 10 mL de monómero metacrilato de glicol. Adicionar 0,25 ml de N, N-dimetilanilina poli (óxido de etileno) (acelerador) à solução de incorporação para iniciar a reacção de polimerização. Remover a solução de transformação e colocar uma biópsia de dentro da cápsula incorporação relevante usando uma pinça.
6. Lentamente encher a cápsula incorporação ao topo com uma solução de incorporação e fechar a tampa. Evitar perturbar a biópsia e criando grandes bolhas de ar. Incubam-se as cápsulas a 4 ° C até que a resina tenha polimerizado completamente.
7. Armazenar as biópsias incorporados a -20 ° C em um tubo de 50 ml contendo cerca de 5 g de gel de sílica.

3. Seccionamento de endobrônquicos Biópsias GMA-encaixados

1. revestimento de lâmina de microscópio: Lavar as lâminas de microscópio em ummáquina de lavar louça num ciclo normal. Cobrir os slides e permitir-lhes a secar ao ar.
2. Prepara-se uma solução de revestimento de 10% de poli-L-lisina solução (PLL) em água destilada. Submergir as lâminas em solução de revestimento para 5 min, e depois deixá-los secar ao ar. Armazenar lâminas revestidas com PLL secos em suas caixas originais.
3. Lavar as tiras da folha de vidro com 0,1% de Tween 20 em água destilada. Lavar o copo com 70% de etanol e seco com toalhas de papel. Cortar lâminas de vidro da faixa de vidro usando um fabricante de faca. Armazenar as lâminas num recipiente que impede o movimento para garantir que a aresta de corte não seja danificada ou cortada.
4. Biópsia aparar: Coloque a cápsula biópsia em um divisor de cápsula e reduzir cada lado usando uma lâmina de ponta única em aço carbono. Remova a biópsia GMA-incorporado e coloque-a firmemente em um vício. Apare o excesso GMA de todo o biópsia usando a lâmina de aço.
5. seccionamento GMA.
   1. Preparar uma solução de amoníaco a 0,05% com água destilada. Coloque a faca de vidro e biópsia em the micrótomo. alinhar cuidadosamente o bloco de biópsia com a lâmina, ajustando o suporte da faca e o ângulo do bloco de biópsia de modo que a lâmina assenta plana contra a superfície do bloco.
   2. Corte 2 mm de espessura utilizando o micrótomo em uma velocidade de corte lento e utilize uma pinça para transferir e flutuar as seções sobre a água de amônia. Flutuar as seções de 45-90 segundos, permitindo a recuperação antigênica gentil e desdobramento da seção.
   3. Pegar seções com lâmina de microscópio. Verifique a histologia da biópsia pela coloração rapidamente com azul de toluidina.
   4. Secam-se as lâminas em conjunto uma placa quente a 50 ° C e aplica 500 ul de corante azul de toluidina filtrou-se para uma secção utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico. Aqueça a seção sobre a chapa quente até um anel verde começa a surgir na borda da mancha, e, em seguida, lave-a com água.
   5. Usando um microscópio de luz, verifique a histologia biópsia. Secções utilizados para imuno-histoquímica deve conter boas áreas da lâmina não danificadopropria e do epitélio, com o menor número de glândulas e tão pouco músculo liso possível.
   6. Como no ponto 3.4.2, cortar seções que têm boa histologia e buscá-las com lâminas de microscópio PLL-revestidos para coloração imuno-histoquímica. Cortar, pelo menos, duas secções de cada biópsia para análise. lâminas secar por pelo menos 1 hora. Depois da secagem, as secções podem ser embrulhados em papel de alumínio e armazenadas a -20 ° C durante até 2 semanas, ou eles podem ser imediatamente imunocoradas.

4. imuno Coloração de endobrônquicos Biópsias GMA-encaixados

NOTA: A azida sódica é tóxica. Preparar a solução de azida de sódio a 0,1% dentro de um extractor de fumo e de distância a partir de ácidos. Em contacto com ácidos liberta gases tóxicos.

1. Desenhar em torno seções usando uma caneta com ponta de diamante e organizar os slides em um rack de coloração.
2. Execute um bloco peroxidase. Prepara-se uma solução de bloqueio da peroxidase de peróxido de hidrogénio a 0,3% em solução de azida de sódio a 0,1%. Apply 1 ml de peroxidase para o bloco de secções e incubar durante 30 min.
3. Prepara-se uma solução de lavagem com solução salina 0,05 M tamponada com Tris (TBS), pH 7,6. Lavar as lâminas em TBS, 3x 5 min.
4. Prepara-se uma solução do bloco de BSA a 1% em DMEM. Fazer isso com antecedência e em volumes grandes, alíquota e congelá-lo até que seja necessário. Escorra os slides e incubar as seções de solução de bloco para 30 min para bloquear anticorpo inespecífico vinculativo. Se a ligação não específica ainda ocorre, incluem um passo de incubação de 30 minutos com 5% de soro de bloco a partir das mesmas espécies como o anticorpo secundário.
5. Dilui-se o anticorpo primário (CD45 ou CD1a) em TBS até à concentração desejada (CD45 diluído a 1: 1000; CD1a diluído a 1: 1,00) e aplicá-lo a slides. Lamela as seções e incubar durante a noite à temperatura ambiente.
6. Lavar as lâminas em TBS três vezes. Dilui-se o anticorpo secundário biotinilado (dirigido contra as espécies hospedeiras anticorpo primário, no caso de coelho anti-rato F (ab _'2)) em TBS até à concentração desejada (1:300 diluição) e aplicá-lo aos slides. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente.
7. Prepara-se uma estreptavidina-peroxidase de biotina complexo de pelo menos 30 min antes da utilização. Certifique-se de que não é suficiente para cobrir todos os slides. Lavar as lâminas em TBS três vezes. Aplicar a solução para as lâminas e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente.
8. Lavar as lâminas em TBS três vezes. Preparar 3-amino-9-etilcarbazole solução de substrato de peroxidase (AEC) (feita segundo as instruções do fabricante). Aplicá-lo para as lâminas e incubar durante 20-30 minutos ou até que a intensidade da coloração desejada desenvolve.
9. Lavar as lâminas em água corrente durante 5 min. Contracoloração das secções com solução de hematoxilina de Mayer filtrada por 2 min. Lavar as lâminas em água corrente durante 5 minutos.
10. Escorra as lâminas e cobrir as seções com meio de montagem aquoso permanente. Seca-se as lâminas a 80 ° C num forno de secagem. Permitir que os slides para esfriar, e depois montá-los com DPX e colocar uma lamela.

5. StAnálise aining

1. Analisar as secções de ampliação de 40X usando um microscópio óptico com uma câmara montada ligado a um computador.
   NOTA: Para a análise celular, contagem positivamente coradas, as células nucleadas na lâmina própria e epitélio brônquico intacto, excluindo as áreas de músculo liso, glândulas, grandes vasos sanguíneos e tecido incompatíveis ou danificado.
2. Calcular a média dos contagens de células e corrigir a contagem celular média para a região da lâmina própria e o comprimento do epitélio. A área da lâmina e o comprimento do epitélio pode ser calculado utilizando um programa de análise de imagem.

6. Digestão Enzimática de endobrônquico Biópsias

1. Biópsias de lavagem: Utilizando fórceps estéreis, lugar biópsias intactas num tubo cónico de 15 ml contendo 10 ml de solução salina tamponada de Hank (HBSS) (Figura 3). Incubar durante 5 min à temperatura ambiente numa plataforma de agitação a 30 rpm. Transferir as biópsias para um d estérilish por decantação o conteúdo do tubo de 15 ml com HBSS.
2. Interrompendo muco com DTT: Substituir a HBSS no tubo com 10 ml de HBSS contendo 5 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT). Transferir as biópsias de volta para o tubo de 15 ml usando uma pinça estéril. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente numa plataforma de agitação a 30 rpm.
3. Vortex suavemente o tubo por 15 s. Transferir as biópsias num prato esterilizado por decantação o conteúdo do tubo de 15 ml com HBSS e DTT.
4. Transferir as biópsias para o meio de cultura: Substituir a HBSS e DTT no tubo com 10 ml de meio de cultura RPMI 1640. Transferir as biópsias de volta para o tubo de 15 ml usando uma pinça estéril. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente numa plataforma de agitação a 30 rpm.
5. A digestão com colagenase biópsias e ADNase.
   1. Prepara-se uma solução de digestão de colagenase II (0,25 mg / ml) e ADNase (0,2 mg / ml) em RPMI pré-aquecido contendo uma solução 1 M de HEPES. Adicionar 500 uL de solução de digestão por poço numa culto de tecido de 48 poçosplaca ure.
   2. Coloque uma biópsia por poço em solução digestão. Incubar a placa sobre uma plataforma de agitação durante 60 min a 37 ° C a 220 rpm. Pipeta-se para baixo e depois de 30 minutos para re-dispersam as biópsias, e após 60 min, para desagregar o tecido completamente.
6. Preparação de suspensões de células únicas.
   1. Piscina em conjunto as biópsias digeridos a partir dos poços para um tubo de 50 mL passando-a através de um filtro celular de 40 uM. Recolher os restantes células por lavagem dos poços com tampão de FACS gelada (soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) contendo soro fetal bovino a 2%).
   2. Apertar o tecido remanescente no filtro de células utilizando a parte de trás do êmbolo de uma seringa. Centrifugar as células digeridos a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Cuidadosamente remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão de FACS gelada. Contar as células utilizando um hemocitómetro e manualmente Tripano mancha azul para avaliar a viabilidade das células.

7. Análise citométrica de fluxo de células individuais de endobrônquica biópsias após digestão enzimática

1. Ressuspender o sedimento celular a aproximadamente 1 X 10 ⁶ células em 200 ul de tampão de FACS.
2. Adicionar um corante de viabilidade celular para a exclusão de células mortas de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Adicionam-se 5 ul de reagente de bloqueio FcR e incubar durante 5 min a 4 ° C.
4. Adicionar anticorpos de superfície celular contra CD45 (2 ul), linhagem (CD3, CD20, CD56, CD66abce, e CD14; 2 ul cada), CD16 (0,5 mL), HLA-DR (3 mL), CD11c (5 ul), CD123 (5 ul), CD1c (3 mL), e CD103 (2 uL) e incubar durante 15 min a 4 ° C. Detalhes sobre anticorpos pode ser encontrado na secção Métodos, mas dosear e optimizar os anticorpos para o fluxo preciso citómetro em uso. Lavar anticorpos em excesso com PBS durante 5 min a 400 x g. Adquirir as amostras frescas em um citômetro de fluxo ou corrigir as células em paraformaldeído 1% antes da acquisit tardeíon.
5. Identificar DC humanas em biópsias pulmonares utilizando um ensaio de citometria de fluxo de ¹⁸ (Figura 4).
   NOTA: Usando uma citometria de fluxo de software de análise, as células imunes são distinguidos de outras células do pulmão por gating em CD45. As células mortas pode ser excluída como células que são positivas para o corante VIVO / MORTO. De todos CD45 ⁺ células vivo, células de linhagem (células B, células T, células NK, neutrófilos e monócitos) pode ser excluída usando um cocktail de anticorpos contra CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14, e CD16 em um canal. Seguindo que as células, HLA-DR ⁺ permitirá a identificação de todos os DCs humanas. MDCs pode ser distinguida de PDC com base na expressão de CD11c ou a falta de CD11c, respectivamente. MDCs pode ainda ser dividido em cd1c ⁺ MDCs ou CD141 ^+.

Resultados

Estudos que caracterizam as células do tecido residente respiratórias humanas imunes, incluindo as DCs, são limitadas, principalmente devido ao fato de que cirurgicamente removidas ou de tecido de pulmão humano total é escassa. Aqui, um método menos invasivo de obtenção de tecido de pulmão a partir de biópsias endobronquiais (EBB) de voluntários saudáveis ​​e os protocolos desenvolvidos para estudar as células do sistema imunológico no tecido usando imuno-histoquímica ...

Discussão

Este artigo descreve como gerar uma caracterização espacial e fenotípica detalhada do pulmão DCs tecido residentes em humanos saudáveis ​​utilizando imuno-histoquímica e citometria de fluxo em biópsias da mucosa endobrônquica recolhidos durante broncoscopia. Nos parágrafos seguintes etapas críticas do protocolo são discutidos em detalhe.

Passos críticos com o Protocolo

Seccionamento e imuno-histoquímica: É crítico para manter os blocos de biópsia...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160	Olympus	BF1T160
Light source	Olympus	Exera CV-160
Fenestrated forceps	Olympus	FB21C	Used to take biopsies
Bite Block	Conmed	1429	20 mm x 27 mm
Glucose 25%			500 ml intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml			Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o			Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40 mg/ml			Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100 mg/ml spray			Administered to back of throat
Lidocaine 20 mg/ml spray			Administered via bronchoscope to airways
GMA processing and embedding
Glass vials			5 ml
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-1L
Molecular sieves, 4 Å	Alfa Aesar	88120	3-4 mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P-7626	0.035 g/100 ml acetone
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I-6125	0.37 g/100 ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules	TAAB laboratories	C094	500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder	TAAB laboratories	C054	Holds 25 8 mm capsules
JB-4 GMA embedding kit	Polysciences	00226	Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate	Sigma-Aldrich	27614-1L
Silica gel with humidity indicator	Scharlau	GE0043	2.5-6 mm
GMA sectioning
Glass microscope slides	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy	Alkar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker	LKB
Capsule splitter	TAAB laboratories	C065
Carbon steel single edge blades	TAAB laboratories	B054
Vice
Ammonia, 25%	VWR	1133.1000	2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%)
Microtome	Leica		Leica RM 2165
Light source	Leica		Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand	Leica		Leica MZ6
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen	Histolab	5218
Hydrogen peroxide 30% solution	AnalaR Normapur	23619.264
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
Sodium chloride	VWR chemicals	27810.295
Bovine serum albumin	Millipore	82-045-2	Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anti-human CD45 antibody	BioLegend	304002	Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody	AbD Serotech	MCA80GA	Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control	Abcam	ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control	Dako	X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit	Vector Labs	PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite	Vector Labs	SK-4200
Mayers haematoxylin	HistoLab	01820
Permanent Aqueous Mounting Medium	AbD Serotech	BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution	VWR	360292F
Light microscope	Leica		Leica DMLB
Microscope camera	Leica		Leica DFC 320
Analysis software	Leica		Leica Qwin V3
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	55021C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885
DNase	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Forceps
Platform rocker	Grant instruments	PMR-30
50 ml conical tubes	Falcon	14-432-22
40 µm cell strainer	Falcon	352340
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit	Life Technologies	L34957
CD45	BD	555485
CD3	BD	557757
CD20	BD	335829
CD56	Biolegend	318332
CD66abce	Miltenyi	130-101-132
HLA-DR	BD	555813
CD14	BD	557831
CD16	Biolegend	302026
CD11c	BD	560369
CD1c	Miltenyi	130-098-009
CD141	Miltenyi	130-090-514
CD103	Biolegend	350212
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
LSR II Flow cytometer	BD		Flow cytometer
FlowJo	FlowJo		Software for analysis