Человеческие клетки легких Дендритные: Пространственное распределение и фенотипической идентификации в Эндобронхиальная Биопсию Использование иммуногистохимии и проточной цитометрии

Резюме

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Аннотация

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Введение

Легкие находятся в постоянном контакте с внешней средой, и высоко подвергают воздействию как безвредные частиц и микробов со способностью вызывать заболевания. Поэтому крайне важно для иммунной системы, чтобы смонтировать сильные иммунные ответы против вторгшихся патогенов, но в равной степени важно для поддержания толерантности к вдыхаемых антигенов, которые не вызывают заболевания. Для обеспечения мощного иммунного надзора, дыхательной системы выстлана сети иммунных клеток, в том числе дендритные клетки (ДК). Контроллеры домена являются профессиональными антиген-представляющими клетками с уникальной способностью активировать наивные Т-клетки. В легких человека, РС - резиденты сталкиваются с антигеном , а затем обработать и транспортировать его в легких осушение лимфатических узлов для представления и активации Т - клеток , ^{1, 2, 3.}

В иммунной системе человека, РС можно разделить на несколько подмножеств, с DistinКТ , но пересекающиеся функции: CD1c ⁺ и CD141 ⁺ миелоидных ДК (Главгосслужбы) и CD123 ⁺ плазмоцитов контроллеры домена (PDCs) ^{4, 5.} В то время как самые подробные знания о человеческом ГЦ проистекает из исследований в крови, теперь очевидно , что человеческие легкие также питают редкие популяции DC подмножеств с Т-клеточным стимулирующим емкостью ^{6, 7, 8, 9.} Тем не менее, аккумулирующие данные показывают , что иммунные клетки, в том числе контроллеры домена, различаются по частоте, фенотип, и функции в зависимости от их анатомического расположения ^10. Таким образом, важно, чтобы изучить иммунные клетки из соответствующей ткани, чтобы понять их вклад в местный иммунитет и толерантности. Взятые вместе, это подчеркивает необходимость изучения легких резидентные РС при решении заболеваний легких, несмотря на контроллеры домена крови быть более доступными и доступными в людях.

Первые работы, изучающие легочные резидентные РС в организме человека в основном полагались на морфологии и экспрессии отдельных маркеров, таких как HLA-DR и CD11c, в срезах ткани с помощью иммуногистохимии ^{11, 12, 13.} В противоположность этому, более поздние исследования, как правило, полагаются на проточной цитометрии анализа для изучения различных подмножеств иммунных клеток. Однако, так как трудно найти хотя бы одну клеточной поверхности маркер, который однозначно идентифицирует определенное подмножество постоянного тока, потенциальное ограничение исследований применения только четыре цвета проточной цитометрии является риск в том числе клеточных популяций с аналогичными фенотипических маркеров в качестве контроллеров домена. Например, CD11c экспрессируется на всех миелоидных ДК и подавляющее большинство моноцитов. С другой стороны, в исследованиях применения более совершенных проточная цитометрия панелей, незлокачественный легочной ткани от хирургических резекций пациентов, как правило, используютсяXref "> ^{10, 14, 15, 16,} хотя остается неясным , являются ли эти редкие популяции действительно представительными ДКБ , присутствующих в здоровых субъектов. В целом, исследования ограничены во многом связано с тем , что хирургическим путем удаляется или вся ткань легких человека не хватает.

Для того, чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений, эта работа описывает, как выполнить детальный анализ пространственного распределения и фенотипической идентификации контроллеров домена в слизистой оболочке эндобронхиальные биопсий, полученных у здоровых добровольцев, которые подвергаются бронхоскопию. Несколько небольших биопсий могут быть получены от каждого отдельного человека и впоследствии могут быть внедрены для секционирования и анализ с помощью иммуногистохимии или ферментативно переваривается для расширенного анализа проточной цитометрии. Использование легочной ткани в виде эндобронхиальные биопсий из bronchoscopies дает то преимущество, что позволило выполнить стУды на здоровых добровольцах, в отличие от открытой хирургии легких, что, по понятным причинам, ограничивается пациентами, которые требуют торакальной хирургии. Кроме того, ткань, которая оцифровывается во время бронхоскопии от здоровых добровольцев является физиологически нормальным, в отличие от не-пораженный участок легочной ткани у пациентов с легочным заболеванием. С другой стороны, биопсий невелики, и количество клеток, извлекаемых, даже при объединении нескольких биопсий, ограничивает тип анализов, которые могут быть выполнены.

Хотя настоящая работа сосредоточена на контроллерах, описанные способы могут быть непосредственно расширен за счет включения других (иммунные) клетки, представляющие интерес, которые находятся в тканях человека через слизистую оболочку легких. Кроме того, протоколы также непосредственно применимы к образцам, полученным от пациентов, страдающих легочными заболеваниями, где бронхоскопии является частью установления диагноза, таких как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), саркоидоз, или рак легких.

протокол

Примечание: Данное исследование было одобрено областным советом этической экспертизы в Умео, Швеция.

1. бронхоскопия для отбора проб Эндобронхиальная биопсий человека субъектов

1. Получить информированное согласие от всех участников.
2. Рассматривать предметы с оральной мидазолама (4-8 мг) и внутривенного гликопиррония (0.2-04 мг) за 30 мин до бронхоскопии. Применение местной анестезией с лидокаином в гортани и бронхах. Пусть предмет полоскание с ~ 3 мл лидокаина 4% и применяют 3 мл к основанию языка и в гортань через гортань шприц. Оптимизация под местной анестезией с 8-10 доз лидокаина спрея. Выполните этот шаг с темой заседания.
3. Вставьте гибкий бронхоскоп видео через рот с помощью пластмассового мундштука с субъектом в положении лежа на спине. С помощью специального назначения спрей катетер для завершения местной анестезией дистальной трахеи и бронхов через бронхоскоп. При этом используют дозу приблизительно5-10 мл лидокаина 2%.
4. Возьмите 6-9 эндобронхиальных слизистых оболочек биопсию из основного киля и основные бронхиальных подразделений с использованием Фенестрированные щипцов (Рисунок 1). После бронхоскопии и перед выходом из больницы, чтобы объект съемки покоя в течение 2-4 ч и обеспечить его / ее с легкой закуской.

2. Вложение биопсий в гликоле метилакрилата (ГМА) Смола

Примечание: Протокол иммунное GMA первоначально была разработана в Университете Саутгемптона, Гистохимия Research Unit ^17.

1. Фиксация: Для иммуногистохимии, удалите биопсий пинцетом и поместить их непосредственно в стеклянные пробирки, содержащие 3 мл обезвоженного ингибиторов ацетона и протеазы охлажденного льдом (фенилметилсульфонилфторид (35 мг / 100 мл ацетона) и иодацетамид (370 мг / 100 мл ацетона )). Закрепить ткань в течение ночи при -20 ° С (рисунок 2).
   Примечание: Следующие шаги должны быть PERFOrmed в вытяжном шкафу с соответствующими нитриловые перчатки. Комплект вложение содержит компоненты, которые могут вызвать реакцию сенсибилизации, раздражение, и / или аллергический кожи. Все отходы должны быть утилизированы как опасные отходы.
2. Обезвоживание: удаления ацетона с ингибиторами и заменить свежим обезвоженного ацетона (без ингибиторов) в течение 15 мин при комнатной температуре (RT). Удалите ацетон и заменить его метилбензоатом в течение 15 мин.
3. Проникновение: Подготовка обработки раствора 5% -ного раствора метилбензоат в гликоль метакрилата мономера; 10 мл достаточно для одного флакона. Используя пластиковые пипетки Пастера, отсос от раствора метил бензоат и заменить с 3 мл раствора для обработки. Инкубацию биопсий и избытка раствора для обработки при 4 ° С в течение 2 ч; Пипетки Пастера может быть использован для всех последующих изменений решения, включая встраивание решение.
4. Обмен на это решение для обработки через каждые 2 ч (3x 2 ч инкубациями), так что общее время инфильтрации биоpsies в растворе для обработки составляет по меньшей мере 6 ч. Вставьте бумажные этикетки в верхней части вложения капсулы идентифицировать биопсию.
5. Готовят вложение раствора 75 мг перекиси бензоила в 10 мл этиленгликоля метакрилата мономера. Добавить 0,25 мл N, N - диметиланилин поли (этиленоксида) (ускоритель) к раствору вложения , чтобы начать реакцию полимеризации. Удалите систему обработки и поместите одну биопсию в соответствующую капсулу вложения с помощью щипцов.
6. Медленно заполнить вложение капсулу в верхней части с вложением раствора и закройте крышку. Избегайте нарушения биопсию и создания больших пузырьков воздуха. Инкубируйте капсулы при температуре 4 ° С до тех пор, пока смола полностью полимеризуется.
7. Хранить встроенные биопсий при -20 ° С в 50 мл пробирку, содержащую приблизительно 5 г силикагеля.

3. Секционирование ГМА встраиваемый Эндобронхиальная Биопсию

1. Микроскоп слайд-покрытие: Вымойте стекла микроскопа вПосудомоечная машина на обычном цикле. Накройте слайды и дайте им высохнуть на воздухе.
2. Готовят раствор для нанесения покрытия из 10% поли-L-лизина (ФАПЧ) в дистиллированной воде. Погрузите слайды в растворе для нанесения покрытия в течение 5 минут, а затем дайте им высохнуть на воздухе. Хранить в сухом месте слайды ФАПЧ покрытием в оригинальных коробках.
3. Промыть листового стекла полоски с 0,1% Tween 20 в дистиллированной воде. Промыть стекла с 70% -ным этанолом и насухо бумажным полотенцем. Разрежьте стеклянные ножи из стеклянной полосы с использованием ножа производителя. Храните ножи в контейнере, который предотвращает движение, чтобы гарантировать, что передний край не повреждены или поцарапан.
4. Биопсия обрезки: Поместите капсулу биопсии в капсулу сплиттер и вырубить каждую сторону с использованием углеродистой стали одной кромки лезвия. Удалите ГМА Встраиваемый биопсию и поместить его твердо в тисках. Обрезают избыток ГМА из вокруг биопсии с использованием стального лезвия.
5. GMA секционирования.
   1. Готовят 0,05% раствор аммиака с дистиллированной водой. Поместите стеклянный нож и биопсию гое микротома. Тщательно выровняйте блок биопсии с лезвием путем регулировки держателя ножа и угла блока биопсии, так что лезвие лежит плоско к поверхности блока.
   2. Вырезать толстые секции 2 мкм с использованием микротома на медленной скорости резания и использовать пинцет для передачи и всплывают из секций на воде аммиака. Поплавок секции на 45-90 сек, что позволяет нежную извлечение антигена и раскладывания секции.
   3. Возьмите секции с предметного стекла микроскопа. Проверьте гистологию биопсии, быстро окрашивания толуидиновым синим.
   4. Высушить слайды на горячей пластине набора до 50 ° С и применять 500 мкл фильтруется толуидиновым синим красителем в секцию с помощью пластиковой пипетки Пастера. Подогреть раздел на горячей плите, пока зеленое кольцо не начнет появляться на краю пятна, а затем смыть водой.
   5. С помощью светового микроскопа, проверьте гистологию биопсии. Разделы, используемые для иммуногистохимии должны содержать хорошие участки неповрежденной листовой пластинкиPropria и эпителий, с наименьшим количеством желез и как мало гладких мышц, насколько это возможно.
   6. Как и в разделе 3.4.2, вырезать участки, которые имеют хорошую гистологию и забрать их с ФАПЧ покрытием микроскопа для иммуногистохимического окрашивания. Вырезать по меньшей мере, две секции из каждой биопсии для анализа. Сухие скользит по меньшей мере, 1 ч. После сушки, секции могут быть завернуты в фольгу и хранили при -20 ° С в течение до 2-х недель, или они могут быть немедленно иммуноокрашиванию.

4. Иммуногистохимическое Окрашивание ГМА встраиваемый Эндобронхиальная Биопсию

Примечание: Азид натрия является токсичным. Готовят 0,1% раствор азида натрия в вытяжном шкафу и вдали от кислот. При контакте с кислотами выделяет токсичный газ.

1. Нарисуйте вокруг участков с использованием алмазным пером и организовать слайдов на окрашивании стойку.
2. Выполните пероксидазы блок. Приготовьте пероксидаза блок раствор 0,3% перекиси водорода в 0,1% растворе азида натрия. Applу 1 мл блока пероксидазы к разделам и инкубировать в течение 30 мин.
3. Приготовьте промывочный раствор 0,05 М Трис-буферном солевом растворе (TBS), рН 7,6. Вымойте слайды в TBS, 3x 5 мин.
4. Готовят 1% раствор БСА блока в DMEM. Сделайте это заранее и в больших объемах, аликвоты и заморозить его до тех пор, пока это необходимо. Слить слайды и инкубировать секций в блоке растворе в течение 30 мин, чтобы блокировать связывание неспецифических антител. Если неспецифическое связывание все еще имеет место, включают в себя 30-минутной инкубации шаг с 5% блок сыворотки из того же вида в качестве второго антитела.
5. Развести первичных антител (CD45 или CD1a) в TBS до нужной концентрации (CD45, разбавленного в соотношении 1: 1000; CD1a разводили в соотношении 1: 1,00) и применить его к слайдам. Покровное секций и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре.
6. Вымойте слайды в TBS три раза. Развести биотинилированного вторичного антитела (направленное против первичных вида хозяина антител, в данном случае кролика против мышиного F (аb _'2)) в TBS до нужной концентрации (1:300 разведение) и применить его к слайдам. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
7. Приготовьте стрептавидин биотин-пероксидаза сложный, по крайней мере за 30 минут до использования. Убедитесь в том, что есть достаточно, чтобы охватить все слайды. Вымойте слайды в TBS три раза. Нанесите раствор на слайдах и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
8. Вымойте слайды в TBS три раза. Приготовьте 3-амино-9-ethylcarbazole (AEC) раствора субстрата пероксидазы (сделано в соответствии с инструкциями завода-изготовителя). Применить его к слайдам и инкубировать в течение 20-30 мин или до желаемой интенсивности пятна развивается.
9. Промыть слайды в проточной водопроводной воде в течение 5 мин. Контрастное секции раствором гематоксилином Майера фильтруется в течение 2 мин. Вымойте слайды в проточной водопроводной воде в течение 5 мин.
10. Слить слайды и охватывают участки с постоянной водной монтажной среды. Высушить слайды при температуре 80 ° С в сушильной печи. Разрешить слайды остыть, а затем установить их с DPX и поместите покровное.

5. StAining Анализ

1. Проанализировать секции при 40-кратном увеличении с помощью светового микроскопа с смонтированной камерой, подключенной к компьютеру.
   Примечание: Для получения клеточного анализа, граф положительно окрашенных, ядросодержащих клеток в бронхиальном пластинке слизистой и неповрежденной эпителием, за исключением участков гладких мышц, желез, крупных кровеносных сосудов, а также несовпадением или поврежденной ткани.
2. Среднее значение на основании количества клеток и корректировать среднее число клеток в области собственной пластинке слизистой оболочки и длины эпителия. Площадь собственной пластинке слизистой оболочки и длины эпителия можно рассчитать с помощью программы анализа изображений.

6. ферментативным расщеплением Эндобронхиальная Биопсию

1. Стиральные биопсий: С помощью стерильного пинцета, место интактные биопсий в 15 мл коническую пробирку , содержащую 10 мл Хенкса солевом буферном растворе (HBSS) (рисунок 3). Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре на ротационном платформе при 30 оборотах в минуту. Передача биопсий в стерильную DМОГ декантацией содержание 15 мл пробирку с HBSS.
2. Срыв мокроту с DTT: Заменить HBSS в пробирку с 10 мл HBSS, содержащем 5 мМ 1,4-дитиотреитола (DTT). Передача биопсий обратно в 15 мл пробирку с помощью стерильного пинцета. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре на ротационном платформе при 30 оборотах в минуту.
3. Vortex трубку осторожно в течение 15 сек. Перенесите биопсий на стерильную блюдо декантацией содержание 15 мл пробирку с HBSS и DTT.
4. Перенос биопсий в культуральную среду: Заменить HBSS и DTT в пробирку с 10 мл среды RPMI 1640 культуральной среды. Передача биопсий обратно в 15 мл пробирку с помощью стерильного пинцета. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре на ротационном платформе при 30 оборотах в минуту.
5. Переваривание биопсию с коллагеназой и ДНКазой.
   1. Приготовьте переваривания раствор коллагеназы II (0,25 мг / мл) и ДНКазы (0,2 мг / мл) в предварительно нагретую RPMI, содержащего 1 М раствора HEPES. Добавить 500 мкл раствора сбраживания на лунку в культе ткани 48-луночногоЮр пластины.
   2. Поместите 1 биопсию на лунку в пищеварении растворе. Инкубируют планшет на качалке платформу в течение 60 мин при 37 ° C при 220 оборотах в минуту. Пипетка вверх и вниз, после того, как 30 мин до повторного диспергирования биопсий, и через 60 мин, чтобы полностью детализировать ткани.
6. Подготовка одноклеточных суспензий.
   1. Бассейн вместе переваренные биопсий лунки в 50 мл пробирку, пропуская его через сито 40 клеток мкм. Собрать оставшиеся клетки путем промывки лунок с охлажденным льдом буфером FACS (фосфатный буферный солевой раствор (PBS), содержащем 2% фетальной бычьей сыворотки).
   2. Сожмите оставшиеся ткани на ситечко клеток с использованием задней части плунжера шприца. Центрифуга переваренные клетки при 400 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл охлажденного льдом буфера FACS. Подсчитайте клетки вручную с помощью гемоцитометра и трипановым синим пятном для оценки жизнеспособности клеток.

7. Flow Cytometric Анализ одиночных клеток эндобронхиальных Биопсию после ферментативного переваривания

1. Ресуспендируют осадок клеток приблизительно 1 × 10 ⁶ клеток в 200 мкл буфера FACS.
2. Добавьте жизнеспособность клеток краситель для исключения мертвой ячейки в соответствии с протоколом производителя.
3. Добавьте 5 мкл блокирующего реагента FcR и инкубировать в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
4. Добавить клеточной поверхности антитела против CD45 (2 мкл), линии (CD3, CD20, CD56, CD66abce и CD14, 2 мкл каждого), CD16 (0,5 мкл), HLA-DR (3 мкл), CD11c (5 мкл), CD123 (5 мкл), CD1c (3 мкл) и CD103 (2 мкл) и инкубировали в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Более подробная информация о антител можно найти в разделе методов, но титруют и оптимизации антител к точному проточного цитометра в использовании. Смыть избыток антител с PBS в течение 5 мин при 400 х г. Приобретать образцы свежей на проточном цитометре или фиксации клеток в 1% параформальдегидом до поздней acquisitиона.
5. Идентификация человека контроллеры домена в биопсий легких с использованием проточной цитометрии анализа ¹⁸ (рисунок 4).
   Примечание: С помощью проточной цитометрии программного обеспечения для анализа, иммунные клетки отличаются от других легочных клеток путем стробирования на CD45. Мертвые клетки могут быть исключены как клетки, которые являются положительными для LIVE / DEAD красителя. Из всех живых CD45 ⁺ клеток, линии дифференцировки клеток (В - клетки, Т - клетки, NK - клетки, нейтрофилы и моноциты) могут быть исключены с помощью коктейль из антител против CD20, CD3, CD56, CD14, CD66abce и CD16 в одном канале. После этого, HLA-DR ⁺ клетки позволит идентифицировать человека всех контроллеров домена. MDCs можно отличить от контроллерах PDC на основе экспрессии CD11c или отсутствие CD11c, соответственно. MDCs можно дополнительно разделить на CD1c ⁺ MDCs или CD141 ^+.

Результаты

Исследования, характеризующие дыхательные иммунные клетки человеческой ткани-резидентов, включая контроллеры домена, ограничены, в основном из-за того, что хирургическим путем удаляется или вся ткань легких человека не хватает. При этом, менее инвазивный метод получ...

Обсуждение

В данной статье описывается, как создавать подробные пространственные и фенотипическую характеристику легочных тканей РС-резидентов у здоровых людей с помощью иммуногистохимии и проточной цитометрии на эндобронхиальные слизистых оболочек биопсий, собранных во время бронхоскопии. ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160	Olympus	BF1T160
Light source	Olympus	Exera CV-160
Fenestrated forceps	Olympus	FB21C	Used to take biopsies
Bite Block	Conmed	1429	20 mm x 27 mm
Glucose 25%			500 ml intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml			Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o			Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40 mg/ml			Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100 mg/ml spray			Administered to back of throat
Lidocaine 20 mg/ml spray			Administered via bronchoscope to airways
GMA processing and embedding
Glass vials			5 ml
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-1L
Molecular sieves, 4 Å	Alfa Aesar	88120	3-4 mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P-7626	0.035 g/100 ml acetone
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I-6125	0.37 g/100 ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules	TAAB laboratories	C094	500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder	TAAB laboratories	C054	Holds 25 8 mm capsules
JB-4 GMA embedding kit	Polysciences	00226	Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate	Sigma-Aldrich	27614-1L
Silica gel with humidity indicator	Scharlau	GE0043	2.5-6 mm
GMA sectioning
Glass microscope slides	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy	Alkar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker	LKB
Capsule splitter	TAAB laboratories	C065
Carbon steel single edge blades	TAAB laboratories	B054
Vice
Ammonia, 25%	VWR	1133.1000	2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%)
Microtome	Leica		Leica RM 2165
Light source	Leica		Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand	Leica		Leica MZ6
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen	Histolab	5218
Hydrogen peroxide 30% solution	AnalaR Normapur	23619.264
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
Sodium chloride	VWR chemicals	27810.295
Bovine serum albumin	Millipore	82-045-2	Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anti-human CD45 antibody	BioLegend	304002	Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody	AbD Serotech	MCA80GA	Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control	Abcam	ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control	Dako	X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit	Vector Labs	PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite	Vector Labs	SK-4200
Mayers haematoxylin	HistoLab	01820
Permanent Aqueous Mounting Medium	AbD Serotech	BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution	VWR	360292F
Light microscope	Leica		Leica DMLB
Microscope camera	Leica		Leica DFC 320
Analysis software	Leica		Leica Qwin V3
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	55021C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885
DNase	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Forceps
Platform rocker	Grant instruments	PMR-30
50 ml conical tubes	Falcon	14-432-22
40 µm cell strainer	Falcon	352340
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit	Life Technologies	L34957
CD45	BD	555485
CD3	BD	557757
CD20	BD	335829
CD56	Biolegend	318332
CD66abce	Miltenyi	130-101-132
HLA-DR	BD	555813
CD14	BD	557831
CD16	Biolegend	302026
CD11c	BD	560369
CD1c	Miltenyi	130-098-009
CD141	Miltenyi	130-090-514
CD103	Biolegend	350212
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
LSR II Flow cytometer	BD		Flow cytometer
FlowJo	FlowJo		Software for analysis