האדם תאים דנדריטים ריאות: הפריסה המרחבית וזיהוי פנוטיפי ב Endobronchial ביופסיות שימוש אימונוהיסטוכימיה ו cytometry זרימה

Summary

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Abstract

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Introduction

הריאות נמצאות בקשר רצוף עם הסביבה החיצונית ונחשפות מאוד לשני חלקיקים וחיידקים מזיקים עם היכולת לגרום למחלה. לכן, חשוב עבור מערכת החיסון לעלות תגובה חיסונית חזקה נגד פתוגנים פולשים, אך חשוב לא פחות לשמור על סובלנות לאנטיגנים בשאיפה כי אינו גורם למחלות. כדי לספק מעקב חיסוני חזק, מערכת הנשימה היא מצופית עם רשת של תאי מערכת חיסון, כוללים תאים דנדריטים (DCS). DCs הם תאים מקצועיים מציגי אנטיגן עם היכולת הייחודית להפעיל תאי T נאיביים. בריאות האדם, DCS תושב נתקלים אנטיגן ולאחר מכן תהליך ולהעביר אותה אל קשרי הלימפה לנקז-ריאה להגשה והפעלה של תאי T ^{1, 2, 3.}

במערכת החיסון האנושית, DCS ניתן לחלק לכמה קבוצות משנה, עם distinct אבל פונקציות חופפות: CD1c ⁺ ו- CD141 ⁺ DCs מיאלואידית (MDCs) ו CD123 ⁺ DCs plasmacytoid (PDC) ^{4, 5.} בעוד שרוב ידעתי מפורט על אדם DCs נובע ממחקרים בדם, עכשיו זה ברור כי ריאות אדם הנמל גם אוכלוסיות נדירות של תת DC עם קיבולת ⁶ גירוי תאי ^{T, 7, 8, 9.} עם זאת, הנתונים המצטברים מראים כי תאי חיסון, כולל DCS, נבדלים תדירות, פנוטיפ, ותפקודם בהתאם למיקום האנטומי שלהם ^10. לכן, חשוב ללמוד תאים חיסוניים מן הרקמה הרלוונטית להבין תרומתם החסינה וסובלנות מקומיות. יחדיו, זה מדגיש את הצורך בלימוד DCS-תושב ריאות כאשר פונים מחלות ריאה, למרות DCs הדם להיות בקלות יותר זמין ונגיש בבני אדם.

המחקרים הראשונים שחקרו DCs תושב-ריאות בבני האדם הסתמכו בעיקר על מורפולוגיה הביטוי של סמנים יחידים, כגון HLA-DR ו CD11c, בסעיפי רקמות באמצעות אימונוהיסטוכימיה ^{11, 12, 13.} לעומת זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה יותר בדרך כלל יש לסמוך על תזרים cytometric מנתח ללמוד תת תא החיסון שונה. עם זאת, מאחר וקשה למצוא סמנו על פני קרום תא יחיד המזהה באופן ייחודי משנה DC ספציפי, ההגבלה הפוטנציאל של מחקרים החלימה רק בארבעת צבעים cytometry זרימה הוא הסיכון כולל אוכלוסיות תאים עם סמנים פנוטיפי דומים כמו DCs. לדוגמה, CD11c מתבטא בכל DCs מיאלואידית ואת הרוב המכריע של מונוציטים. מצד השני, במחקרי החלת לוחות cytometry זרימה מתקדמים יותר, רקמת ריאה שאינה סרטנית כריתות כירורגית של חולים בדרך כלל שמשהXref "> ^{10, 14, 15, 16,} אם כי לא ברור אם האוכלוסיות הנדירות אלה הן מייצגים את חומר שבאמת נוכחי DCs בנבדקים בריאים. בסך הכל, מחקרים מוגבלים במידה רבה בשל העובדה כי בניתוח או רקמת ריאה אנושית כולו הוא נדיר.

כדי להתגבר על כמה מגבלות אלו, עבודה זו מתארת ​​כיצד לבצע ניתוח מפורט של הפריסה המרחבית וכן זיהוי פנוטיפי של DCs בביופסיות endobronchial הרירית המתקבל מתנדבים בריאים שעברו ברונכוסקופיה. ביופסיות קטנות אחדות ניתן לאסוף כל פרט ולאחר מכן יכולות להיות מוטבעת עבור חתך וניתוח באמצעות אימונוהיסטוכימיה או מתעכלת enzymatically עבור ניתוח התזרים cytometric מתקדם. באמצעות רקמת הריאה בצורה של ביופסיות endobronchial המתקבל bronchoscopies מקנה יתרון של מה שהופך אותו ניתן לבצע את study על מתנדבים בריאים, בניגוד ניתוח פתוח של הריאות כי, מסיבות מובנות, הוא מוגבל לחולים הדורשים ניתוח חזה. יתר על כן, אותה הרקמה תדגם במהלך ברונכוסקופיה ממתנדבים בריאים נורמלית מבחינה פיזיולוגית, בניגוד אזור שאינו מושפע של רקמת ריאה בחולים עם מחלת ריאות. מצד השני, הביופסיות קטנות ומספר התאים להיאסף, גם כאשר איגום ביופסיות כמה, מגבילים את סוג הניתוחים שניתן לבצע.

בעוד העבודה הנוכחית מתמקדת DCS, השיטות שתוארו ניתן להרחיב ישירות לכלול אחרים (חיסוניים) תאים בעלי עניין הנמצאים ברקמת ריאה רירית אדם. יתר על כן, פרוטוקולים חלים גם ישירות דגימות שהתקבלו מחולים הסובלים ממחלות ריאות שבו ברונכוסקופיה היא חלק בהקמת האבחנה, כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), סרקואידוזיס, או סרטן ריאות.

Protocol

הערה: מחקר זה אושר על ידי המועצה לביקורת האתית האזורית Umeå, שוודיה.

1. ברונכוסקופיה עבור דגימת Endobronchial ביופסיות מ בבני אדם

1. קבלת הסכמה מדעת מכל המשתתפים.
2. פנקו את הנושאים עם midazolam הפה (4-8 מ"ג) ו glycopyrronium תוך ורידי (0.2-04 מ"ג) 30 דקות לפני ברונכוסקופיה. החל הרדמה מקומית עם לידוקאין הגרון הסמפונות. בואו מגרגרים הנושא עם ~ 3 מ"ל של לידוקאין 4% ולהחיל 3 מ"ל לבסיס הלשון לתוך הגרון באמצעות מזרק הגרון. מטב את ההרדמה המקומית עם 8-10 מנות של ספריי לידוקאין. ביצוע שלב זה עם הישיבה בנושא.
3. הכנס ברונכוסקופ וידאו גמיש דרך הפה באמצעות שופר פלסטיק עם הנושא במצב שכיבה. השתמש קטטר ספריי מתוצרת בכוונה כדי להשלים את ההרדמה המקומית של קנה הנשימה הסמפונות דיסטלי באמצעות ברונכוסקופ. הנה, להשתמש במינון של כ5-10 מ"ל של 2% לידוקאין.
4. קח 6-9 ביופסיות ברירית endobronchial מ קארינה הראשי לבין חטיבות סימפונות הראשיות באמצעות מלקחי fenestrated (איור 1). בעקבות ברונכוסקופיה ולפני שעזב את בית החולים, ולתת לשאר הנושא במשך 2-4 שעות ולספק לו / לה עם ארוחה קלה.

2. הטמעת ביופסיות ב גליקול Methylacrylate (GMA) שרף

הערה: פרוטוקול immunostaining GMA פותחה במקור באוניברסיטת סאות'המפטון, היסטוכימיה יחידת המחקר ^17.

1. קיבוע: אימונוהיסטוכימיה, להסיר את ביופסיות מן מלקחיים ומניחים אותם ישירות לתוך צלוחיות זכוכית המכיל 3 מ"ל של מעכבי פרוטאז ואצטון מיובש קר כקרח (פלואוריד phenylmethylsulfonyl (35 מ"ג / 100 מ"ל אצטון) ו iodoacetamide (370 מ"ג / 100 מ"ל אצטון )). לתקן את רקמת הלילה ב -20 ° C (איור 2).
   הערה: השלבים הבאים יש performed במנדף עם כפפות ניטריל מתאימות. ערכת הטבעה מכיל רכיבים שעלולים לגרום לרגישות, גירוי, ו / או תגובה אלרגית בעור. כל הפסולת חייבת להיות מסולקת פסולת מסוכנת כמו.
2. התייבשות: הסר את אצטון עם מעכבים ולהחליף עם אצטון המיובש הטרי (ללא מעכבים) במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (RT). הסר אצטון ולהחליפה בנזואט מתיל במשך 15 דקות.
3. הסתננות: כן פתרון עיבוד של פתרון בנזואט 5% מתיל מונומר methacrylate גליקול; 10 מיליליטר מספיק עבור בקבוקון אחד. באמצעות טפטפות פסטר מפלסטיק, שאיבה את הפתרון בנזואט מתיל ולהחליף עם 3 מ"ל של תמיסת עיבוד. דגירת ביופסיות פתרון עיבוד עודף על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות; טפטפות פסטר יכולה לשמש את כל שינויי הפתרון שלאחר מכן, כולל הטבעת פתרון.
4. להחליף את פתרון עיבוד כל שעה 2 (3x 2 incubations hr), אז בפעם חדירה הכולל של ביוpsies בפתרון העיבוד הוא לפחות שעה 6. הכנס מדבקות נייר לתוך הקצה העליון של קפסולות הטבעה לזהות הביופסיות.
5. הכן פתרון הטבעה של בנזואיל פרוקסיד 75 מ"ג ב 10 מ"ל של מונומר methacrylate גליקול. להוסיף 0.25 מ"ל של N, פולי N -dimethylaniline (אתילן אוקסיד) (מאיץ) לפתרון הטבעה כדי להתחיל את התגובה פילמור. הסר את פתרון העיבוד ומניח ביופסיה אחת לתוך הקפסולה ההטבעה הרלוונטי באמצעות מלקחיים.
6. לאט למלא את הקפסולה ההטבעה לפסגה עם הטבעת פתרון ולסגור את המכסה. הימנע מפריע הביופסיה ויצירת בועות אוויר גדולות. דגירה הכמוסה ב 4 ° C. עד השרף יש polymerized לחלוטין.
7. אחסן את הביופסיות המוטבעות ב -20 ° C בתוך שפופרת 50 מיליליטר המכילה כ 5 גרם של ג'ל סיליקה.

3. חתך של ביופסיות Endobronchial GMA-מוטבע

1. ציפוי שקופיות מיקרוסקופ: שטפו את השקופיות למיקרוסקופמדיח כלים על מחזור רגיל. מכסים את השקופיות ולאפשר להם אוויר יבש.
2. כן פתרון ציפוי של 10% פולי- L- ליזין (PLL) פתרון במים מזוקקים. להטביע את שקופיות פתרון ציפוי למשך 5 דקות, ולאחר מכן לתת להם להתייבש באוויר. אחסן שקופיות PLL מצופה יבש בקופסאות המקוריות שלהם.
3. לשטוף רצועות זכוכית וכו 'עם 0.1% Tween 20 במים מזוקקים. יש לשטוף את הזכוכית עם 70% אתנול ו יבש עם מגבות נייר. חותך להבי זכוכית מרצועת הזכוכית באמצעות יצרנית סכין. אחסן את הלהבים במכל המונע תנועה על מנת להבטיח כי חוד החנית לא ולהינזק או פצע.
4. ביופסית זמירה: מניח את הקפסולה ביופסית מפצל הקפסולה ולכרות כל צד באמצעות סכין חד קצה פחמן פלדה. סר ביופסית GMA-מוטבעת ולמקם אותו היטב סגן. חתוך עודף GMA מרחבי הביופסיה באמצעות להב הפלדה.
5. חתך GMA.
   1. כן פתרון אמוניה 0.05% עם מים מזוקקים. מניח את סכין זכוכית ביופסיה ב הדואר microtome. בזהירות ליישר את בלוק הביופסיה עם הלהב ידי התאמת בעל סכין ואת הזווית של בלוק הביופסיה כך להב המוטלת שטוח נגד פני השטח של הבלוק.
   2. חותכים 2 חלקים עבים מיקרומטר באמצעות microtome על מהירות חיתוך איטי להשתמש במלקחיים להעביר ולהציף חלקים על פני המים אמוניה. Float בסעיפים עבור 45-90 שניות, המאפשר אחזור אנטיגן עדין ופתיחה של הסעיף.
   3. תרים קטעים עם שקופיות מיקרוסקופ. בדוק את היסטולוגיה ביופסיה על ידי צביעה במהירות עם toluidine כחול.
   4. לייבש את השקופיות על סט צלחת חמה עד 50 מעלות צלזיוס וליישם 500 μl של כתם כחול toluidine מסוננים קטע בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק. מומלץ לחמם את החלק על הצלחת החמה עד טבעת ירוקה מתחילה להסתמן בקצה הכתם, ולאחר מכן לשטוף אותה עם מים.
   5. באמצעות מיקרוסקופ אור, לבדוק את היסטולוגיה ביופסיה. סעיפים המשמשים אימונוהיסטוכימיה יכילו אזורים טובים של lamina הניזוקpropria אפיתל, עם בלוטות מעטות ככל ואת שריר חלק כמה שפחות.
   6. כמו בסעיף 3.4.2, לחתוך קטעים שיש היסטולוגיה טוב לאסוף אותם עם שקופיות מיקרוסקופ PLL מצופה מכתים immunohistochemical. חותכים לפחות שני קטעים מתוך כל ביופסיה לניתוח. מגלשות יבשות לפחות שעה 1. לאחר ייבוש, ניתן לזהות קטעים עטופים בנייר כסף פח ומאוחסן ב -20 ° C עד 2 שבועות, או שהם יכולים להיות immunostained מייד.

4. מכתים immunohistochemical של ביופסיות Endobronchial GMA-מוטבע

הערה: אזיד הנתרן הוא רעיל. הכן את הפתרון אזיד הנתרן 0.1% בתוך במנדף והרחק חומצות. לתקשר עם חומצות משחררות גזים רעילים.

1. צייר את מיקומם של חלקים באמצעות עט יהלום שהקצה ולסדר את השקופיות על מתלה מכתימה.
2. בצע בלוק Peroxidase. כן פתרון לחסום peroxidase של חמצן 0.3% מימן בתמיסה יזיד הנתרן 0.1%. Apply 1 מ"ל של גוש peroxidase סעיפים דגירה במשך 30 דקות.
3. כן פתרון לשטוף של 0.05 מ 'טריס שנאגר מלוח (TBS), pH 7.6. שטפו את השקופיות TBS, 3x 5 דקות.
4. כן פתרון לחסום BSA 1% ב DMEM. האם זה מראש בכמויות גדולות, aliquot ומקפיאים עד הצורך. מסננים את השקופיות ו דגירת מקטעי פתרון לחסום למשך 30 דקות כדי לחסום מחייב נוגדן ספציפי. אם מחייב נוקב עדיין מתרחש, כולל שלב דגירה 30 דקות עם גוש סרום 5% מאותו המין כמו נוגדנים משני.
5. לדלל הנוגדן הראשוני (CD45 או CD1a) ב TBS לריכוז הרצוי (CD45 מדולל ב 1: 1,000; CD1a מדולל ב 1: 1,00) ולהחיל אותו על שקופיות. Coverslip בסעיפים ו דגירה לילה ב RT.
6. לשטוף שקופיות ב TBS שלוש פעמים. לדלל נוגדנים משני biotinylated (מכוונת נגד הפונדקאי נוגדן ראשוני, ארנב במקרה זה אנטי עכבר F (ab _'2)) ב TBS לריכוז הרצוי (1:300 דילול) ולהחיל אותו על שקופיות. דגירה עבור שעה 2 ב RT.
7. כן 30 דקות מורכבות ביוטין-peroxidase streptavidin לפחות לפני השימוש. ודא שיש מספיק כדי לכסות את כל השקופיות. שטפו את השקופיות TBS שלוש פעמים. החל פתרון השקופיות ו דגירה של שעה 2 ב RT.
8. שטפו את השקופיות TBS שלוש פעמים. כן 3-אמינו-9-ethylcarbazole (AEC) פתרון מצע peroxidase (עשה בהתאם להוראות היצרן). ולהחיל אותו על שקופיות דגירה במשך 20-30 דקות או עד עוצמת הכתם הרצויה מתפתחת.
9. יש לשטוף את השקופיות במים זורמים מהברז למשך 5 דקות. Counterstain את החלקים עם פתרון haematoxylin של מסוננים מאיירים למשך 2 דקות. שטפו את השקופיות במים זורמים מהברז למשך 5 דקות.
10. מסנן את השקופיות ולכסות את החלקים עם הרכבה בינונית מימי קבע. ייבש את השקופיות ב 80 מעלות צלזיוס בתנור ייבוש. אפשר השקופיות להתקרר, ולאחר מכן לטעון אותם עם DPX ומקום coverslip.

5. Stניתוח aining

1. לנתח את הסעיפים בהגדלה 40X באמצעות מיקרוסקופ אור עם מצלמה רכובה המחוברת למחשב.
   הערה: לקבלת ניתוח הסלולר, רוזן מוכתם חיובי, תאי בעלי גרעין בתוך שכבת הרירית מיוחדת הסמפונות האפיתל ללא פגע, למעט באזורים של שריר חלק, בלוטות, כלי דם גדולים, ורקמות תואמות או פגומות.
2. הממוצע את ספירת התאים ולתקן את ספירת התא הממוצעת באזור של שכבת הרירית מיוחדת ואת האורך של האפיתל. האזור של שכבת הרירית המיוחדת ואורך האפיתל ניתן לחשב באמצעות תוכנית ניתוח התמונה.

6. אנזימתי עיכול של ביופסיות Endobronchial

1. ביופסיות כביסה: בעזרת מלקחיים סטריליות, ביופסיות שלם ומכניסים צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של תמיסת בופר של האנק (HBSS) (איור 3). דגירה במשך 5 דקות ב RT על פלטפורמת נדנדה ב 30 סל"ד. מעביר את הביופסיות על ד סטריליish באמצעות אחסון התוכן של הצינור 15 מ"ל עם HBSS.
2. שיבוש ריר עם DTT: החלף את HBSS בצינור עם 10 מ"ל של HBSS המכיל 5 1,4-dithiothreitol מ"מ (DTT). מעביר את הביופסיות בחזרה לתוך צינור 15 מיליליטר באמצעות מלקחיים סטרילית. דגירה במשך 15 דקות ב RT על פלטפורמת נדנדה ב 30 סל"ד.
3. וורטקס הצינור בעדינות במשך 15 שניות. מעבירים את ביופסיות על צלחת סטרילי באמצעות אחסון התוכן של הצינור 15 מ"ל עם HBSS DTT.
4. העברת ביופסיות עד בינוני התרבות: החלף את HBSS DTT בצינור עם 10 מ"ל של מדיום תרבות RPMI 1640. מעביר את הביופסיות בחזרה לתוך צינור 15 מיליליטר באמצעות מלקחיים סטרילית. דגירה של 10 דקות ב RT על פלטפורמת נדנדה ב 30 סל"ד.
5. לעכל ביופסיות עם collagenase ו DNase.
   1. הכן פתרון העיכול של collagenase השנייה (0.25 מ"ג / מ"ל) ו DNase (0.2 מ"ג / מ"ל) ב RPMI מחומם מראש המכיל 1 פתרון M HEPES. הוספת 500 μL של פתרון העיכול לכל היטב כת רקמת 48-היטב צלחת יור.
   2. מקום 1 ביופסיה לכל היטב פתרון העיכול. דגירה את הצלחת על פלטפורמת רעד במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב 220 סל"ד. עד פיפטה ומטה לאחר 30 דקות מחדש לפזר את הביופסיות, ולאחר 60 דקות, כדי disaggregate לחלוטין את הרקמה.
6. הכנת תרחיפים תא בודד.
   1. ברכה יחד הביופסיות מתעכלות מבאר לתוך צינור 50 מיליליטר על ידי העברתו דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. אוסף את התאים הנותרים על ידי שטיפת הבארות עם חיץ FACS קר כקרח (בופר פוספט (PBS) בסרום שור 2% עובריים המכיל).
   2. סוחטים את הרקמה הנותרת על מסננת התא באמצעות האחורי של הבוכנה של המזרק. בצנטריפוגה תאים מתעכל ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. מוציאים בזהירות את supernatant ו resuspend גלולה ב 5 מ"ל של חיץ FACS קר כקרח. ספירת התאים באופן ידני באמצעות hemocytometer כתם כחול Trypan כדי להעריך את הכדאיות של תאים.

= "Jove_title"> 7. ניתוח תזרים Cytometric של תאים בודדים של ביופסיות Endobronchial לאחר אנזימתי עיכול

1. Resuspend התא גלולה של כ 1 x 10 ⁶ תאים 200 μl של חיץ FACS.
2. הוספת צבע כדאיויות תא להוצאת תאים מתים על פי הפרוטוקול של היצרן.
3. הוסף 5 μl של מגיב חסימת FCR דגירה במשך 5 דקות ב 4 °.
4. הוספת נוגדנים פני התא נגד CD45 (2 μl), השושלת (CD3, CD20, CD56, CD66abce, ו CD14; 2 μl כל אחד), CD16 (0.5 μl), HLA-DR (3 μl), CD11c (5 μl), CD123 (5 μl), CD1c (3 μl), ו CD103 (2 μl) ו דגירה במשך 15 דקות ב 4 °. פרטים על נוגדנים ניתן למצוא בסעיף שיטות, אבל לכייל לייעל את הנוגדנים לזרימה המדויקת cytometer בשימוש. לשטוף נוגדנים עודפים עם PBS במשך 5 דקות ב g x 400. רוכשים את הדגימות טריות על cytometer זרימה או לתקן את תאי paraformaldehyde 1% לפני acquisit מאוחר יותריוֹן.
5. זהה DCs האנושי בביופסיות ריאות באמצעות זרימת cytometry assay ¹⁸ (איור 4).
   הערה: שימוש cytometry זרימה תוכנת ניתוח, תאי מערכת החיסון נבדלים מתאי ריאה אחרות על ידי gating על CD45. תאים מתים ניתן לשלול כתאים כי הם חיוביים עבור צבע חי / מת. מכל CD45 ⁺ תאי החיים, תאי שושלת (תאי B, תאי T, תאי NK, נויטרופילים, מונוציטים ו) ניתן לשלול באמצעות קוקטייל של נוגדנים נגד CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14, CD16 ו בערוץ אחד. לאחר מכן, HLA-DR ⁺ תאים יאפשר זיהוי של כל DCs האנושי. MDCs ניתן להבחין בין PDCs מבוסס על הביטוי של CD11c או חוסר CD11c, בהתאמה. MDCs ניתן לחלוקה נוספת לתוך CD1c ⁺ MDCs או CD141 ^+.

תוצאות

מחקרים לאפיון תאים חיסוניים רקמות תושב נשימה של אדם, כולל DCS, מוגבלים, בעיקר בשל העובדה כי הוסרו בניתוח או רקמת ריאה אנושית כולו הוא נדיר. כאן, שיטה פחות פולשנית קבלת רקמת הריאה ביופסיות endobronchial (גאות) של מתנדבים בריאים ופרוטוקולים פותח על מנת ללמוד את...

Discussion

מאמר זה מתאר כיצד ליצור אפיון מרחבי phenotypical מפורט של DCs ריאות רקמות תושב בבני אדם בריא באמצעות אימונוהיסטוכימיה וזרימת cytometry על ביופסיות ברירית endobronchial שנאספו במהלך ברונכוסקופיה. בפסקאות הבאות צעדים קריטיים בפרוטוקול הם דנו בפירוט.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160	Olympus	BF1T160
Light source	Olympus	Exera CV-160
Fenestrated forceps	Olympus	FB21C	Used to take biopsies
Bite Block	Conmed	1429	20 mm x 27 mm
Glucose 25%			500 ml intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2 mg/ml			Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o			Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40 mg/ml			Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100 mg/ml spray			Administered to back of throat
Lidocaine 20 mg/ml spray			Administered via bronchoscope to airways
GMA processing and embedding
Glass vials			5 ml
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-1L
Molecular sieves, 4 Å	Alfa Aesar	88120	3-4 mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P-7626	0.035 g/100 ml acetone
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I-6125	0.37 g/100 ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules	TAAB laboratories	C094	500x 8 mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder	TAAB laboratories	C054	Holds 25 8 mm capsules
JB-4 GMA embedding kit	Polysciences	00226	Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate	Sigma-Aldrich	27614-1L
Silica gel with humidity indicator	Scharlau	GE0043	2.5-6 mm
GMA sectioning
Glass microscope slides	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy	Alkar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker	LKB
Capsule splitter	TAAB laboratories	C065
Carbon steel single edge blades	TAAB laboratories	B054
Vice
Ammonia, 25%	VWR	1133.1000	2 ml in 1 L, 1:500 (0.05%)
Microtome	Leica		Leica RM 2165
Light source	Leica		Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand	Leica		Leica MZ6
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen	Histolab	5218
Hydrogen peroxide 30% solution	AnalaR Normapur	23619.264
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
Sodium chloride	VWR chemicals	27810.295
Bovine serum albumin	Millipore	82-045-2	Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anti-human CD45 antibody	BioLegend	304002	Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody	AbD Serotech	MCA80GA	Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control	Abcam	ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control	Dako	X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit	Vector Labs	PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite	Vector Labs	SK-4200
Mayers haematoxylin	HistoLab	01820
Permanent Aqueous Mounting Medium	AbD Serotech	BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution	VWR	360292F
Light microscope	Leica		Leica DMLB
Microscope camera	Leica		Leica DFC 320
Analysis software	Leica		Leica Qwin V3
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	55021C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C6885
DNase	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Forceps
Platform rocker	Grant instruments	PMR-30
50 ml conical tubes	Falcon	14-432-22
40 µm cell strainer	Falcon	352340
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit	Life Technologies	L34957
CD45	BD	555485
CD3	BD	557757
CD20	BD	335829
CD56	Biolegend	318332
CD66abce	Miltenyi	130-101-132
HLA-DR	BD	555813
CD14	BD	557831
CD16	Biolegend	302026
CD11c	BD	560369
CD1c	Miltenyi	130-098-009
CD141	Miltenyi	130-090-514
CD103	Biolegend	350212
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
LSR II Flow cytometer	BD		Flow cytometer
FlowJo	FlowJo		Software for analysis