用于实时细胞分析仪的阵列金电极再生

摘要

该协议描述了一个通用的战略, 以重新生成商业阵列金电极装备的无标签的细胞分析仪, 旨在节省高运行成本 ofmicrochip 的化验。再生过程包括胰蛋白酶消化, 用乙醇和水冲洗, 和一个纺纱步骤, 使微晶片的重复使用。

摘要

基于无标签细胞的检测有利于生物化学研究, 因为它不需要实验动物的使用。由于它能够提供更多的动态信息的细胞在生理条件比经典生化检测, 这种无标签的实时细胞分析的基础上的电阻阻抗原理是吸引更多的关注在过去十.然而, 由于测量成本相对昂贵, 因此它的实际利用可能受到限制, 在这种情况下, 用于细胞分析仪的昂贵的一次性黄金微晶片将被使用。在本议定书中, 我们制定了一个通用的战略, 以再生阵列黄金电极装备为一个商业无标签细胞分析仪。再生过程包括胰蛋白酶消化, 用乙醇和水冲洗, 以及纺纱步骤。该方法已经过测试, 证明对商业电子板的再生和重复使用至少三次是有效的, 这将有助于研究人员节省实时细胞化验的高运行成本。

引言

由于其高效和少劳动密集型的实验过程, 在过去十年中, 基于无标签的细胞技术在分析和筛选等方面取得了迅速的增长, 例如蛋白质组学^1,2, 药物传递³,等等^4,5与传统的生化方法相比, 针对细胞分析, 无标签的实时细胞检测与原型开发的 Giaever 和同事以前⁶是基于在细胞附着的微晶片表面记录电信号变化的原理, 允许以定量的方式连续测量细胞生长或迁移。根据这一策略, 采用基于电阻阻抗的检测原理的实时细胞电子传感 (RT) 系统介绍了^7、8以及最近推出的商用实时单元分析仪 (RTCA)。实验室研究⁹。

商用实时细胞分析仪主要是从细胞增殖、迁移、生存能力、形态学、黏附力等方面对培养细胞的生理变化进行分析, 以观察其产生的电阻抗的诱发信号。微芯片的表面^10,11。这种电信号由分析仪进一步转换成一个无量纲参数, 称为细胞指数 (CI) 来评估细胞的状态。微晶片阻抗的变化主要反映了电极/溶液界面上覆盖细胞的局部离子环境。因此, 细胞分析仪的分析性能很大程度上依赖于核心传感单元, 即一次性微晶片 (即, 所谓的电子板,例如, 96/16/8 井), 这是由阵列金电极lithographically 印在孵化井的底部。金电极装配在一个循环的在线格式 (图 1) 和覆盖的孵化井的大部分表面积, 这允许动态和敏感检测连接的细胞^{3,12,13 ,14}。该词将增加, 在更多的表面覆盖细胞的芯片, 并减少当细胞暴露在毒物导致细胞凋亡。虽然实时细胞分析仪经常用于确定细胞毒性¹¹和神经毒性¹⁵ , 并提供比经典端点方法更多的动力学信息, 但一次性电子板是最昂贵的消费品.

到目前为止, 还没有可用的方法来再生电子板, 这可能是由于诸如食人鱼溶液或乙酸等严酷的再生条件涉及^16,17,18, 这可能会改变金微晶片的电状态。因此, 在电子板再生过程中, 采用温和有效的方法从金片表面去除粘附细胞和其他物质是可取的。我们最近制定了一项议定书, 目的是利用非腐蚀性试剂再生一次性电子板, 再生芯片的特点是电化学和光学方法¹⁹。利用速效和适度的实验试剂, 包括胰蛋白酶和乙醇, 建立了无不良影响的商用电子板再生的一般方法, 成功地应用于再生两种主要类型用于 RTCA 的电子板 (16 和 L8)。

研究方案

注: 一般情况下, 再生过程包括胰蛋白酶消化和漂洗步骤与乙醇和水。消化时间根据所使用的细胞数而变化, 所用细胞的类型和数量可能因实验目的而异。建议使用光学和电化学方法检查再生微晶片, 以优化再生条件。在实验中, 可溶性和不溶性的化学物质可能涉及, 这两种典型的再生程序的例子是详细的。

1. 再生溶液的制备

注: 在无菌条件下准备并处理所有溶液。

1. 准备新鲜的 0.25% (g/v) 胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶可以购买或新的准备如下。
   1. 将0.25 克的胰蛋白酶溶解在100毫升的 pH 值7.4 的磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) 中。
   2. 搅拌溶液直到胰蛋白酶完全溶解在 4 ^oc. 用低速搅拌溶液, 以避免气泡形成。
   3. 在生物安全罩中用0.22 µm 过滤器过滤解决方案。
2. 用绝对乙醇制备75% 乙醇。将75毫升绝对乙醇倒入容积瓶中, 加入去离子水, 直到体积达到100毫升。必要时进行进一步的灭菌。

2. 电子板中 A549 细胞的孵化和增殖

注: 电子板类型16和 L8 都是由排列的金电极 lithographically 打印在孵化井底部。电子板16有16个井, 而电子板 L8 有8个井。电子板16的井是圆的, 而电子板 L8 的井是圆的长方形。每台电子版8井的容积约为830µL, 每台电子板16井约270µL。

1. A549 细胞培养
   1. 在罗斯威尔公园纪念 Institute-1640 培养基 (RPMI-1640) 中培养 A549 细胞, 在细胞培养皿中补充10% 胎牛血清 (血清) 和1% 青霉素-链霉素。
   2. 通过细胞密度达到75% 然后用 1 x PBS 和胰蛋白酶处理用0.25% 胰蛋白酶溶液在 37 o c 上清洗粘附细胞层, 以1分钟的时间, 将 179 x g 的细胞分离出来以去除胰蛋白酶. 并用重悬10毫升培养基中的细胞进行进一步的培养或其他实验。
      注: 在培养基中悬浮细胞的溶液被指定为细胞悬浮缓冲器。
   3. 取出10µL, 用 hemocytometer 计数细胞数。使用 RPMI-1640 培养基进一步稀释细胞悬浮缓冲液, 为实验准备3000万细胞/毫升细胞悬浮缓冲液。
2. 增殖/细胞毒性实验与数据采集
   1. 增加50µL (150 µL 为电子板材 L8) 细胞媒介对每台孵化井16并且在生物安全罩保持30分钟为平衡。在 37 ^oC 中, 在 CO₂孵化器中手动插入电子板16在实时单元分析仪中。
   2. 在计算机上启动实时单元分析仪操作程序。在默认的实验模式设置页面上, 选择 "实验模型" 并命名运行检测。
   3. 在其布局页面上, 选择实验中包含的相应井, 并输入编辑框中的单元格类型、编号和药物名称等信息。在其 "计划" 页上, 添加实验步骤, 然后选择每个步骤的运行时间 (例如, 12、24或 48 h) 以及实时数据采集的时间间隔。
      注: 在这里, 步骤1和2的间隔是1分钟和15分钟之后。
   4. 保存文件并单击 "开始" 按钮, 测量其单元格索引页上介质的背景阻抗;结果数据将被自动减去。在它的井图页, 所有井曲线可以被参观。在其绘图页上, 加水井和时间细胞指数图将被显示出来。
   5. 对于细胞增殖实验, 首先单击 "暂停" 按钮暂停程序。然后取出电子板, 在室温下添加100µL A549 细胞悬浮缓冲液。把盘子放在生物安全罩里30分钟, 让细胞沉淀到孵化井的底部。
   6. 在实时单元分析仪工作站上手动插入电子版。单击 "开始" 按钮继续进行实验。
      注意: 在绘图页上, 分析器在整个实验过程中连续记录单元格索引值或曲线。
   7. 实验完成后, 输入绘图页并打开实验文件。然后选择所有经过测试的孵化井和产生的细胞指数曲线, 在添加药物或改变培养基以减少化验之间的差异之前, 最后一次可以对其进行平均或规范化。在数据分析页上, 可以计算 EC50 或 IC50

3. 电子板的再生

注: 对于每个冲洗步骤, 电子版中的溶液完全混合 (5-10 次) 使用吸管。

1. 案例 1: 对抗癌症药物的细胞毒性评价
   1. 在电子版上的种子 A549 细胞, 如第2节所述。
   2. 首先在细胞培养基中溶解抗癌药物阿霉素 (DOX)。慢慢地添加 DOX 到细胞 (DOX 的最终浓度是30µg/毫升) 使用吸管。记录该词, 如第2节所述。
      注: 实验完成后, 所用的电子板立即再生。在这种情况下, 由于 DOX 是一种可溶性化学物质, 在协议后的电子板的再生相对容易处理, 不需要额外的步骤。
   3. 再生
      1. 从实时细胞分析仪站取出含有细胞的电子板。将二手电子板放在室温灭菌的生物安全罩中, 用吸管彻底混合培养基。把所有的培养基都吸掉。
      2. 在室温下用200µL 去离子水冲洗电子板3次。
      3. 使用 37 ^oC, 在孵化器中用0.25% 个新鲜制备的胰蛋白酶 (200 µL/井) 消化电子板上的剩余细胞。当消化完成后, 用吸管将孵化液混合5-10 次, 并在室温下将生物安全罩中的所有溶液吸出。
      4. 分别用200µL 乙醇和200µL 水冲洗电子板, 如下: 去离子水2次, 100% 乙醇2次;75% 乙醇2次;去离子水2次。在无菌纱布或纸巾上反转电子版, 以醒酒在室温下的剩余水分。
      5. 紫外线杀菌的再生电子板在生物安全罩的室温下1-2 小时。
         注: 双容量的所有解决方案的再生电子版 L8。
2. 案例 2: 使用介孔材料进行药物输送。
   1. 像以前报告的²⁰一样, 使用以 5.6 nm 的平均孔径作为药物传递矩阵的棒状介孔二氧化硅材料。
      注: 在这里, 电子板被用来监测药物释放对细胞的影响。
      1. 将介孔材料添加到电子板各井的孵化液中。由于二氧化硅材料在电子版中不溶于沉淀, 因此应将板材冲洗如下:
   2. 执行步骤 3.1. 3.1-3.1. 3.3, 如案例1所述。
   3. 在室温下, 在生物安全罩内用200µL 去离子水冲洗微晶片。
   4. 在室温下用200µL 绝对乙醇冲洗微晶片2次。
   5. 在室温下用200µL 75% 乙醇冲洗微晶片。
   6. 在每个井中加250µL 75% 乙醇, 在室温下用密封膜封住电子板。
   7. 旋转 114 x g 2 分钟, 并清空电子版。在无菌纱布或纸巾上反转电子版, 以醒酒在室温下的剩余水分。
   8. 重复步骤 3.2. 5-3. 2.7 次。
   9. 紫外线杀菌的再生电子板在生物安全罩的室温下1-2 小时。
      注: 清洗 L8 电子板时, 将所有溶液的体积加倍。

4. 再生效果评估

1. 再生电子板表面的光学特性
   1. 使用钢勺仔细拆卸新鲜和再生电子板的孵化井的底部, 其中包含阵列金电极。戴着塑料手套, 小心地用钢勺从电子板上抹去含有微芯片的部分。
   2. 将两个零件放在玻璃显微镜的中心, 并通过拉曼显微镜收集得到的拉曼光谱, 并配有 CCD 探测器²¹。
      注: 光谱仪配备了633纳米激光, 光谱记录在三十年代激光照射的间隔, 波长在500-3500 厘米^-1范围内。利用10x 眼透镜和50x 物镜, 用拉曼显微镜获得光学图像。图 1A和图 1C也使用已安装的拉曼显微镜设备获得。
   3. 为了评估在新鲜和再生电子板上抗癌药物摄取后附着细胞的生存能力, 使用共焦激光扫描显微镜对 A549 吸收的 DOX 分子的自发荧光进行监测。
      1. 为了记录细胞吸收 DOX 的自发荧光 (新鲜和再生电子板与 A549 细胞), 使用63X 油目标和485毫微米作为激发波长。
2. 再生电极的电化学行为
   注: 由于商用电子板的手动掩饰是困难的, 不太适合对表面电状态进行检测, 因此使用常规的金/玻碳电极作为试验, 评估了该协议的再生效率。平台上进行电化学阻抗谱 (EIS)。金电极的直径和两个均为3毫米. 电化学分析仪采用三电极系统获得电化学数据, 采用 10 mV 振幅的交流电流信号进行阻抗测量。宽频率范围的100赫到0.01 赫兹。
   1. 测量前, 用抛光布上的氧化铝浆料抛光金电极, 并将其涂成镜面状表面, 然后在水中超声波去除任何颗粒。
   2. 在0.5 米 H₂中激活 Au 电极, 因此₄。在10毫米氯化钾电解质溶液中获得裸金电极的 EIS 数据, 其中包含 1mM K₃[Fe (CN)₆], 如所述²²。
   3. 根据2.1.2 和2.1.3 准备库存 A549 细胞溶液。在金电极表面上滴下10µL 细胞悬浮液。孵育金电极和经 37 ^oC 型孵化器中的细胞修饰的 3 h. 获得金电极的 EIS 数据和在10毫米氯化钾电解质溶液中经细胞修饰的, 含 1mM K₃[Fe (CN)₆]。
   4. 使用协议重新生成电极并测量 EIS。
      1. 将金电极和经0.25% 胰蛋白酶修饰的细胞浸泡在 0.5-2 h 上, 将其浸洗4次。用绝对乙醇轻轻冲洗电极4次。浸入金电极和75% 乙醇中的5分钟, 用75% 乙醇 (4 倍) 轻轻冲洗。
      2. 在含 1mM K₃[Fe (CN)₆] 的10毫米氯化钾电解质溶液中获得再生金电极和剑桥的 EIS 数据。

结果

金微芯片的表面特性: 在图 1中概述了此协议中使用的再生过程。 图 2显示了光学显微镜下的新鲜和再生电子版的显微表面图片。如图 2A和图 2C所示, 显微观察表明, 在新鲜和经过处理的电子板之间, 微晶片表面的光学特性几乎没有差别。使用阿霉素自发荧光?...

讨论

我们总结了几种可用的方法^{17,23,24,25,26} , 用于在表 1中再生微晶片。基本上, 这些方法涉及相对苛刻的实验条件, 以实现芯片的完全再生, 因为存在着强大的分子-分子相互作用, 如用于 SPR 芯片的免疫复合体。然而, 这些苛刻的实验条件可能对 RTCA 中使用的阵列金微?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Stock reagents	reconstitution	Concentration used	Storage
Apo-transferrin	10 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
N-acetyl cysteine	5 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Sodium selenite	2.5 mg/mL in H2O	1:25,000	-20°C
Collagen IV	200 μg/mL in PBS	1:100	-80°C
TGF-b2	20 μg/mL in PBS	1:10,000	-20°C
IL-34	100 μg/mL in PBS	1:1,000	-80°C
Ovine wool cholesterol	1.5 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparan sulfate	1 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Oleic acid/Gondoic acid	Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparin	50 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
Solutions	Recipe		Comments
Perfusion Buffer	50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)		Use when ice-cold
Douncing Buffer	200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++		Use when ice-cold
Panning Buffer	2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)	DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite		Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating	MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2		Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)	MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid		Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.