Regeneración de microelectrodos de oro vestidas para un analizador en tiempo real de la célula

Resumen

Este protocolo describe una estrategia general para regenerar comerciales microelectrodos de oro vestidas para un analizador de célula libre de etiqueta para ahorro en los alta ejecución costos ofmicrochip-ensayos. El proceso de regeneración incluye la digestión de la tripsina, enjuague con agua y etanol y un paso de giro, que permite el uso repetido de los microchips.

Resumen

El ensayo de celular libre de etiqueta es ventajoso para estudio bioquímico, debido a no requiere el uso de animales de experimentación. Debido a su capacidad para proporcionar información dinámica sobre células bajo condiciones fisiológicas que ensayos bioquímicos clásicos, este ensayo de célula libre de etiquetas en tiempo real basado en el principio de impedancia eléctrica está atrayendo más atención durante los últimos década. Sin embargo, su utilización práctica puede ser limitado debido al costo relativamente caro de medición, en el que se utilizan microchips oro desechables consumibles costosos para el analizador de células. En este protocolo, hemos desarrollado una estrategia general para regenerar microelectrodos de oro vestidas para un analizador de célula libre de etiqueta comercial. El proceso de regeneración incluye la digestión de la tripsina, enjuague con agua y etanol y un paso de spinning. El método propuesto ha sido probado y demostrado para ser eficaz para la regeneración y el uso repetido de las placas electrónicas comerciales de al menos tres veces, que ayudará a los investigadores excepto en el alto costo de ejecución de ensayos en tiempo real de la célula.

Introducción

Debido a su eficiente y menos dependiente de trabajo proceso experimental, etiqueta-libre celular basada en tecnología ha sido testigo de un crecimiento rápido durante la última década fines analíticos como screening como en el aspecto de proteómica^1,2 , entrega³, etc.^4,5 comparada con métodos bioquímicos tradicionales dirigidos al análisis de la célula, análisis de la célula libre de etiquetas en tiempo real con el prototipo desarrollado por Giaever y compañeros de trabajo previamente^{6 la droga} se basa en el principio de registro de los cambios de la señal eléctrica en la superficie de los microchips conectados a celulares, que permiten una medición continua del crecimiento de la célula o la migración de forma cuantitativa. Siguiendo esta estrategia, se lanzó un celular en tiempo real electrónico detección sistema (RT-CES) utilizando el principio de detección basado en la impedancia eléctrica fue introducido^7,8 y más recientemente un analizador comercial celular en tiempo real (RTCA) laboratorio de investigación⁹.

El analizador celular en tiempo real comercial principalmente Lee señales evocadas de las células de impedancia eléctrica, que resultan de los cambios fisiológicos de células incubados incluyendo proliferación celular, migración, viabilidad, morfología y la adherencia en la superficie de microchips^10,11. Estas señales eléctricas se convierten más lejos por el analizador en un parámetro adimensional, denominado la célula índice (CI) para evaluar el estado de la célula. El cambio de la impedancia de los microchips refleja principalmente el entorno iónico de las células de la cubierta en la interfase electrodo/disolución. Por lo tanto, el rendimiento analítico del analizador celular depende en gran medida la unidad detección de núcleo, los microchips disponibles (es decir, llamadas placas electrónicas, por ejemplo, 96/16/8-bien), que se hacen de microelectrodos de oro vestidas litográfico impreso en la parte inferior de los pozos de incubación. Los microelectrodos oro montan en forma de círculo en la línea (figura 1) y cubren la mayor parte de la superficie de los pozos de incubación, que permiten la detección dinámica y sensible de células adjunto^{3,12,13 ,14}. El CI aumentará en el caso de más cobertura de superficie de las células en el chip y disminuye cuando las células se exponen a una sustancia tóxica que resulta en la apoptosis. Aunque el analizador en tiempo real de la célula se ha utilizado con frecuencia para determinar la citotoxicidad¹¹ y neurotoxicidad¹⁵ y proporcionar más información cinética que el método clásico de extremos, las placas electrónicas desechables son los más consumibles.

Hasta ahora, ha habido no hay métodos disponibles para la regeneración de la placa electrónica, que es probablemente debido a que las condiciones de regeneración áspero, como solución de Piraña o ácido acético son implicados^{16,17, 18}, que puede alterar el estado eléctrico de los microchips de oro. Por lo tanto, un método suave y eficaz para eliminar las células adherentes y otras sustancias de la superficie de oro fichas será conveniente para el proceso de regeneración de la placa electrónica. Recientemente hemos desarrollado un protocolo para la regeneración de platos electrónicos desechables reactivos corrosivos y las virutas regeneradas fueron caracterizadas por métodos electroquímicos y ópticos¹⁹. Mediante el uso de reactivos de laboratorio fácilmente disponibles y moderada como tripsina y etanol, hemos establecido un método general para regenerar la placa electrónica comercial sin efectos adversos, que se aplica con éxito para regenerar los dos tipos principales de la placa electrónica (16 y L8) utilizan para la RTCA.

Protocolo

Nota: en general, el proceso de regeneración incluye la digestión de tripsina y paso enjuague con agua y etanol. El tiempo de digestión cambia según el número de células utilizadas y el tipo y número de células utilizadas pueden diferir dependiendo de la experimentación. Se aconseja comprobar los microchips regenerados mediante métodos ópticos y electroquímicos para optimizar las condiciones de regeneración. Durante el experimento, pueden estar involucrados productos químicos solubles e insolubles, y aquí se detallan estos dos casos típicos de los procedimientos de regeneración.

1. preparación de soluciones de regeneración de

Nota: Preparar y manejar todas las soluciones en condiciones estériles.

1. Preparar nueva solución de tripsina 0.25% (g/v). Tripsina puede ser comprada o recién preparada como sigue.
   1. Disolver 0,25 g de tripsina en 100 mL de solución salina con tampón fosfato de pH 7,4 (PBS).
   2. Agitar la solución hasta que la tripsina se haya disuelto completamente en 4 ^oC. Revuelva la solución a baja velocidad teniendo cuidado de evitar cualquier formación de burbujas.
   3. Filtrar la solución con un filtro de 0,22 μm en la campana de bioseguridad.
2. Preparación de etanol al 75% con etanol absoluto. Vierte 75 mL de etanol absoluto en un matraz aforado y añadir agua desionizada hasta que el volumen llegue a 100 mL. Realizar esterilización más si es necesario.

2. incubación y proliferación de las células A549 en placas electrónicas

Nota: Placa electrónica tipos 16 y L8 son hechas microelectrodos de oro vestidas litográfico impresos en la parte inferior de los pozos de incubación. Placa electrónica 16 tiene 16 mientras que la placa electrónica L8 tiene 8 pocillos. Los pocillos de la placa electrónica 16 están alrededor mientras que los pozos de la placa electrónica L8 son rectángulos redondeados. El volumen de cada placa electrónica 8 bueno es aproximadamente 830 μl y cada placa electrónica 16 bueno es aproximadamente 270 μl.

1. Cultivo de células A549
   1. Plato de penicilina-estreptomicina en cultivo celular células A549 en cultivo en medio del Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1%.
   2. Las células de paso cuando la densidad celular alcanza el ~ 75% y luego lavar la capa de células adherentes con 1 x PBS y trypsinize solución de tripsina 0.25% durante 1 min a 37 ^oC. centrifugar las células a 179 × g por 5 min eliminar tripsina. Resuspender las células en medio de 10 mL para más cultura u otros experimentos.
      Nota: La solución de células suspendidas en el medio aquí es señalada como el buffer de suspensión celular.
   3. Extraiga 10 μl y contar el número de celular utilizando un hemocitómetro. Use el Medio RPMI-1640 para diluir más el tampón de suspensión celular para preparar 80.000 30.000 células/mL del tampón de suspensión celular para los experimentos.
2. Proliferación/citotoxicidad experimento y adquisición de datos
   1. Añadir (50 μl 150 μL para la placa electrónica L8) celular de medio a cada incubación de la placa electrónica 16 y déjela por 30 min en la bioseguridad campana para equilibrar. Inserte manualmente la placa electrónica 16 en el analizador en tiempo real de la célula en la incubadora de CO₂ a 37 ^oC.
   2. En marcha el programa de operación del analizador celular en tiempo real en el equipo. En su defecto experimento página de configuración de modelo, seleccione "Experimento modelo" y el nombre el análisis corriente.
   3. En su página de diseño, seleccione los pozos correspondientes que se incluyen en el experimento y la información como la célula tipo, número y drogas nombres en los cuadros de edición de entrada. En su página de la lista, agregue los pasos experimentales, luego seleccione el tiempo en marcha (p. ej., 12, 24 o 48 h) de cada paso y el intervalo de adquisición de datos en tiempo real.
      Nota: Aquí, el intervalo de paso 1 y 2 son 1 min y 15 min después.
   4. Guarde el archivo y haga clic en el botón "Start" para medir la impedancia de fondo de los medios de comunicación en su página índice de celda; los datos resultantes se restará automáticamente. En su página bien gráfico, se pueden visitar todas las curvas bien. En su página de la trama, añadir pozos y el gráfico del índice de tiempo celular serán demostrados.
   5. Para el experimento de proliferación celular, en primer lugar haga clic en el botón de "Pause" para detener el programa. Luego extraiga la placa electrónica y añadir 100 μl A549 células suspensión de tampón por bien a temperatura ambiente. Deje la placa durante 30 min en la campana de seguridad biológica para dejar las células asentarse en el fondo de los pozos de incubación.
   6. Inserte manualmente la placa electrónica de la estación de analizador en tiempo real de la célula. Haga clic en el botón "Inicio" para continuar el experimento.
      Nota: En la página de la trama, el analizador continuamente registra valores de índice de celda o curvas durante todo el experimento.
   7. Cuando el experimento esté completo, ingresar a la página de complot y abra el archivo de experimento. Continuación, seleccione todos los pozos de incubación probados y las curvas de índice de celda resultantes que pueden ser un promedio o normalizadas por la vez última antes de agregar fármacos o cambiar el medio para reducir las variaciones entre los ensayos. En la página de análisis de datos, pueden calcularse CE50 o CL50

3. regeneración de placas electrónicas

Nota: Para cada paso del lavado, la solución en la placa electrónica se mezcló completamente (5 - 10 veces) con una pipeta.

1. Caso 1: para la evaluación de la citotoxicidad de anti -fármaco contra el cáncer
   1. Células A549 de semilla en la placa electrónica y como se describe en la sección 2.
   2. Disolver primero el fármaco contra el cáncer el clorhidrato de doxorubicina (DOX) en el medio celular. Lentamente añadir DOX a las células (concentración final de DOX es 30 μg/mL) usando una pipeta. Grabar el CI como se describe en la sección 2.
      Nota: La placa electrónica utilizada fue regenerada inmediatamente después de que el experimento fue completado. En este caso, como DOX es una sustancia soluble, la regeneración de la placa electrónica siguiendo el protocolo es relativamente fácil de manejar y no hay pasos adicionales son necesarios.
   3. Regeneración
      1. Sacar la placa electrónica que contiene las células de la estación de analizador en tiempo real de la célula. Coloque la placa de electrónica usada en una campana de bioseguridad estéril a temperatura ambiente y mezclar cuidadosamente con una pipeta de medio de cultivo. Pipetee hacia fuera el medio.
      2. Enjuague las placas electrónicas con agua desionizada μl 200 por 3 veces a temperatura ambiente.
      3. Digerir las células restantes de las placas electrónicas con tripsina 0.25% recién preparado para 1-2 h (200 μL/pocillo) en una incubadora a 37 ^oC. Una vez terminada la digestión, mezclar la solución de incubación 5 - 10 veces utilizando una pipeta y pipeta de la solución en la campana de bioseguridad a temperatura ambiente.
      4. Enjuague las placas electrónicas con 200 μL etanol y 200 μL de agua, respectivamente, como sigue: agua desionizada 2 veces, 100% etanol 2 veces; 75% etanol 2 veces; agua desionizada 2 veces. Invertir la placa electrónica en una gasa estéril o el papel de tejido para decantar el agua restante a temperatura ambiente.
      5. Radiación ultravioleta esteriliza la placa electrónica regenerada para 1-2 h en la campana de bioseguridad a temperatura ambiente.
         Nota: El doble del volumen de todas las soluciones para la regeneración de la placa electrónica L8.
2. Caso 2: entrega de la droga usando el material mesoporoso.
   1. Utilizar materiales de sílice mesoporosa de barra-como con un tamaño de poro promedio de 5,6 nm como matrices de entrega de drogas, como previamente divulgados²⁰.
      Nota: Aquí, la placa electrónica fue empleada para supervisar el efecto de liberación del fármaco en las células.
      1. Añadir materiales mesoporosos en la solución de incubación de cada pocillo de las placas electrónicas. Como materiales de silicona no son solubles y precipitado de la placa electrónica, lavar la placa como sigue:
   2. Realice pasos 3.1.3.1-3.1.3.3 como se describe para el caso 1.
   3. Enjuague los microchips con agua desionizada μl 200 una vez en la campana de bioseguridad a temperatura ambiente.
   4. Enjuague los microchips con etanol absoluto de 200 μL 2 veces a temperatura ambiente.
   5. Enjuague los microchips con etanol del 75% de 200 μL de una vez a temperatura ambiente.
   6. Añadir 250 μl de etanol al 75% en cada pozo y sellar la placa electrónica con la película a temperatura ambiente.
   7. Vuelta a 114 x g durante 2 min y vaciar la placa electrónica. Invertir la placa electrónica en una gasa estéril o el papel de tejido para decantar el agua restante a temperatura ambiente.
   8. Repita el paso 3.2.5-3.2.7 una vez.
   9. Radiación ultravioleta esteriliza la placa electrónica regenerada para 1-2 h en la campana de bioseguridad a temperatura ambiente.
      Nota: Doble el volumen de solución de todo caso de las placas electrónicas de L8.

4. evaluación del efecto de la regeneración

1. Características ópticas de la superficie de la placa electrónica regenerado
   1. Uso un acero cuchara para desmontar con cuidado la parte inferior de la incubación de fresco y regenerado placa electrónica que contiene v. oro microelectrodos. Llevaba un guante de plástico, con cuidado Limpie la parte que contiene el microchip de la placa electrónica con la cuchara de acero.
   2. Coloque ambas piezas en el centro de los portaobjetos de vidrio y recoger los espectros Raman resultantes por microscopio de Raman equipado con un detector CCD del²¹.
      Nota: El espectrómetro fue equipado con un láser 633 y los espectros se registró en un intervalo de 30 exposición láser a una longitud de onda en el rango de 500-3500 cm^-1. Las imágenes ópticas obtuvieron un microscopio Raman utilizando una lente de ojo de 10 x y objetivo de 50 x. Figura 1A y figura 1 también se obtuvieron usando el aparato instalado de microscopio de Raman.
   3. Para evaluar la viabilidad de las células conectadas después de la absorción de fármaco contra el cáncer en el fresco y regenerado electronica placas, utilice un confocal laser microscopio para controlar la fluorescencia espontánea de moléculas DOX absorbidas por A549.
      1. Para registrar la fluorescencia espontánea de DOX absorbida por las células (fresco y regenerado electronica placas con células A549), uso un 63 X aceite objetiva y 485 nm como la longitud de onda de excitación.
2. Comportamiento electroquímico de electrodos regenerados
   Nota: Como desmontaje manual de una placa electrónica comercial es difícil y no es lo ideal para la evaluación del estado eléctrico superficial como comprobado, la eficiencia de regeneración del Protocolo se evaluó mediante el uso de electrodos de carbón oro/vidrioso normal (CME) como una prueba de plataforma, que se realizó espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS). Los diámetros de los electrodos de Au y CME son 3 mm. datos electroquímicos se obtuvieron mediante un analizador electroquímico con un sistema de tres electrodos y las mediciones de impedancia se llevaron a cabo usando una señal de corriente alterna (CA) de 10 amplitud de mV en un amplio rango de frecuencias de 100 kHz 0,01 Hz.
   1. Antes de la medición, el electrodo de Au y polacos CME a una superficie de espejo con una mezcla de alúmina en un paño de limpieza, seguido de sonicación en agua para eliminar cualquier partícula.
   2. Activar el electrodo de Au en 0,5 M H₂hasta₄. Obtener datos EIS del pelado electrodo de Au y CME en 10 mM la solución de electrolito KCl que contiene 1mM K₃[Fe(CN)₆] describe²².
   3. Prepare solución celular A549 según 2.1.2 y 2.1.3. Suspensión de células de 10 μl de la gota en la superficie del electrodo de Au y CME. Incubar electrodo de Au y modificado con las células en una incubadora de C ^o37 para 3 h. EIS obtener datos del electrodo Au CME y CME modificado con las células en 10 mM la solución de electrolito KCl que contiene 1 mM K₃[Fe(CN)₆].
   4. Regenerar los electrodos utilizando el protocolo y medida EIS.
      1. Sumerja el electrodo de Au y CME modificado con células en tripsina 0.25% para 0,5-2 h. Enjuague el electrodo de Au CME suavemente con agua y 4 veces. Enjuague los electrodos suavemente con etanol absoluto 4 veces. Sumergir el electrodo de Au y CME en etanol 75% ~ 5 minutos enjuague las virutas suavemente con etanol 75% 4 veces.
      2. Obtener datos EIS regenerado electrodo de Au y CME en la solución de electrolito KCl 10 mM con 1mM K₃[Fe(CN)₆].

Resultados

Propiedades de superficie de oro microchips: los procedimientos de regeneración usados en este protocolo fueron descritos en la figura 1. La figura 2 muestra el microscópico superficial fotos de fresco y regenerado electronica placas por el microscopio óptico. Como se muestra en la figura 2A y figura 2, microscópicas observaciones ...

Discusión

Resumimos varios métodos disponibles^{17,23,24,25,26} para regenerar microchips en la tabla 1. Básicamente, estos métodos involucrados condiciones experimentales relativamente fuertes para lograr la regeneración completa de fichas debido a la presencia de interacciones fuertes de molécula-molécula como la del complejo inmune utilizado para ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Stock reagents	reconstitution	Concentration used	Storage
Apo-transferrin	10 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
N-acetyl cysteine	5 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Sodium selenite	2.5 mg/mL in H2O	1:25,000	-20°C
Collagen IV	200 μg/mL in PBS	1:100	-80°C
TGF-b2	20 μg/mL in PBS	1:10,000	-20°C
IL-34	100 μg/mL in PBS	1:1,000	-80°C
Ovine wool cholesterol	1.5 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparan sulfate	1 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Oleic acid/Gondoic acid	Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparin	50 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
Solutions	Recipe		Comments
Perfusion Buffer	50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)		Use when ice-cold
Douncing Buffer	200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++		Use when ice-cold
Panning Buffer	2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)	DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite		Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating	MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2		Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)	MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid		Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.