חידוש ערוכים Microelectrodes זהב מצויד מנתח תא בזמן אמת

Summary

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה כללית להתחדש מסחרי microelectrodes זהב ערוכים מצויד מנתח תא ללא תווית שמטרתה שמירה על גבוהה זורמים עלויות מבוססות ofmicrochip מבחני. תהליך התחדשות כולל עיכול טריפסין, שטיפה עם אתנול ומים צעד ספינינג, המאפשרת שימוש חוזר ונשנה של שבבים.

Abstract

וזמינותו ללא תווית מבוססת תא הוא יתרון עבור מחקר ביוכימי בגלל זה אינו דורש השימוש של חיות ניסוי. בשל יכולתה לספק מידע דינמיות יותר על התאים בתנאים פיזיולוגיים מאשר מבחני הביוכימי הקלאסית, זו assay תא ללא תווית בזמן אמת בהתבסס על העיקרון עכבה חשמלית מושך יותר תשומת לב במהלך האחרון עשור. עם זאת, ניצול מעשי שלה עלולה להיות מוגבלת בשל העלות יקרה יחסית המדידה, שבו יקר בשבבים זהב חד פעמיים מתכלים משמשים במנתח התא. ב פרוטוקול זה, פיתחנו אסטרטגיה כללית להתחדש ערוכים microelectrodes זהב מצויד מנתח תא מסחרי ללא תווית. תהליך התחדשות כולל עיכול טריפסין, שטיפה עם אתנול ומים צעד ספינינג. השיטה המוצעת שנבדק ונמצא הוכח להיות יעיל עבור התחדשות ו חוזרות השימוש המסחרי לוחות אלקטרוניים לפחות שלוש פעמים, וזה יעזור חוקרים לשמור על ריצה העלות הגבוהה של מבחני תא בזמן אמת.

Introduction

בשל שלה יעיל ופחות עתירי עבודה התהליך ניסיוני, ללא תווית תא טכנולוגיה מבוססת חוותה צמיחה מהירה בעשור האחרון למטרות אנליטית, כמו גם הקרנת כגון בהיבט של פרוטאומיקס^1,2 , סמים משלוח³, ועוד^4,5 Compared עם שיטות מסורתיות הביוכימי מכוונות ניתוח תא, התא ללא תווית בזמן אמת assay עם האבטיפוס שפותחה על ידי Giaever ועמיתיו בעבר⁶ מבוסס על העיקרון של הקלטה אות חשמלי שינויים על פני השטח של התא-attached מיקרוצ'יפ, המתירים מדידה רציפה של צמיחת תאים או ההעברה באופן כמותי. בעקבות אסטרטגיה זו, הושק תא בזמן אמת אלקטרונית חש (RT-CES) המערכת באמצעות עקרון זיהוי מבוסס עכבה חשמלית היה הציג^7,8 ולאחרונה מנתח מסחרי תא בזמן אמת (rtca) מחקר מעבדה⁹.

במנתח תא בזמן אמת מסחרי בעיקר קורא אותות התאים עורר של עכבה חשמלית, אשר הם תוצאה של השינויים הפיזיולוגיים של תאי הדגירה כולל התפשטות תאים, הגירה, הכדאיות, מורפולוגיה, הדבקות על פני השטח של סחר חופשי^10,11. אותות חשמליים כאלה מומרים עוד יותר על ידי מנתח פרמטר שהוא בשם תא אינדקס (CI) כדי להעריך את מצב תא. השינוי של עכבה של סחר חופשי משקף בעיקר הסביבה המקומית יונית בתאי מכוסה ב הממשק אלקטרודה/פתרון. לכן, ביצועי אנליטי במנתח תא מסתמכת במידה רבה על יחידת חישה הליבה, הפיוזים חד פעמיות (קרי, לוחות אלקטרוניים כביכול, למשל, 96/16/8-ובכן), אשר עשויים ערוכים microelectrodes זהב lithographically הדפיס בחלק התחתון של דגירה בארות. Microelectrodes זהב להרכיב בתבנית עיגול-ב-line (איור 1), מכסה את רוב פני השטח הבארות דגירה, המאפשרים זיהוי דינאמי ורגיש של תאים המצורפת^{3,12,13 ,14}. המודיע להגדיל במקרה של כיסוי השטח יותר של תאים על השבב, או להקטין את כאשר תאים נחשפים toxicant וכתוצאה מכך אפופטוזיס. למרות במנתח תא בזמן אמת שימש לעתים קרובות כדי לקבוע cytotoxicity¹¹ ו neurotoxicity¹⁵ ולספק מידע קינטי יותר מאשר השיטה הקלאסית נקודות קצה, הלוחות האלקטרוניים חד פעמיות הן מהבדים מתכלים.

עד עכשיו, היו אין שיטות זמינות לרגנרציה של צלחת אלקטרונית, שהוא כנראה בשל העובדה כי תנאים קשים התחדשות, כגון פיראניה פתרון או חומצה אצטית הם מעורבים^{16,17, 18}, אשר עשוי לשנות המצב חשמלי של סחר חופשי זהב. לכן, שיטה קלה ויעילה להסרת התאים חסיד וחומרים אחרים מפני השטח של שבבי זהב יהיה רצוי עבור תהליך התחדשות צלחת אלקטרונית. לאחרונה פיתחנו פרוטוקול מכוון לרגנרציה של חד פעמיים צלחות אלקטרונית באמצעות מתכלה ריאגנטים, האסימונים regenerated התאפיינו שיטות אלקטרוכימיות, כמו גם אופטי¹⁹. באמצעות ריאגנטים המעבדה זמינות ולא מתון כולל טריפסין, אתנול, הקמנו שיטה כללית להתחדש לוח אלקטרוני מסחרי ללא תופעות לוואי, אשר מיושמת בהצלחה לחדש את שני סוגים עיקריים צלחת אלקטרונית (16 והן L8) משמש rtca ב.

Protocol

הערה: באופן כללי, התחדשות תהליך כולל לעיכול טריפסין, בשלב השטיפה עם אתנול ומים. זמן עיכול משתנה על פי מספר התאים בשימוש, סוג ומספר תאים בשימוש עשויות להשתנות בהתאם למטרות ניסוי. מומלץ לבדוק את הפיוזים מחדש באמצעות שיטות אלקטרוכימיות אופטי כדי למטב את התנאים התחדשות. במהלך הניסוי, עשויים להיות מעורבים כימיקלים מסיסים ובחלקם לא מסיסים, כאן אלה בשני מקרים טיפוסיים של התחדשות נהלים מפורטים.

1. הכנת התחדשות פתרונות

הערה: להכין, להתמודד עם כל הפתרונות תחת תנאים סטריליים.

1. להתכונן 0.25% (g/v) טריים טריפסין פתרון. ניתן לרכוש טריפסין או להתמחויות כדלקמן.
   1. להמיס 0.25 g של טריפסין ב- 100 מ של תמיסת באגירה פוספט pH 7.4 (PBS).
   2. מערבבים את הפתרון עד טריפסין מפורקת לחלוטין בבית 4 ^oC. מערבבים את הפתרון במהירות נמוכה מקפיד להימנע כל היווצרות בועה.
   3. לסנן את הפתרון עם מסנן מיקרומטר 0.22 בשכונה אבטחה.
2. להכין 75% אתנול באמצעות אתנול מוחלטת. שופכים 75 מ"ל אתנול מוחלטת לתוך בקבוקון הנפחי ומוסיפים מים יונים עד האחסון מגיע 100 מ. לבצע עיקור נוספות במידת הצורך.

2. דגירה והתפשטות תאים A549 לוחות אלקטרוניים

הערה: סוגי אלקטרונית צלחת 16 ואת L8 שניהם עשויים ערוכים microelectrodes זהב lithographically מודפס בחלק התחתון של דגירה בארות. צלחת אלקטרונית 16 יש 16 בארות בעוד אלקטרונית צלחת L8 יש 8 בארות. הבארות של צלחת אלקטרונית 16 עגולים בעוד הבארות צלחת אלקטרונית L8 הם מלבנים מעוגלים. הנפח של כל צלחת אלקטרונית 8 הוא µL בערך 830 והיא כל צלחת אלקטרונית 16 טוב µL 270 בערך.

1. תרבית תאים A549
   1. התרבות התאים A549 ממוריאל פארק רוזוול המכון-1640 בינוני (RPMI-1640) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין בתרבות תא מגישים.
   2. המעבר את התאים צפיפות התאים מגיע ל ~ 75% ולאחר מכן לשטוף את שכבת תאים חסיד עם 1 × PBS, trypsinize עם פתרון טריפסין 0.25% 1 דקות ב- 37 ^oג צנטריפוגה התאים ב 179 g × במשך 5 דקות כדי להסיר טריפסין. Resuspend התאים בינוני 10 מ"ל לתרבות נוסף או ניסויים אחרים.
      הערה: הפתרון של תאים resuspended בטווח הבינוני כאן מיועדת כמו המאגר ההשעיה התא.
   3. להוציא את 10 µL, לספור את מספר הנייד באמצעות של hemocytometer. השתמש המדיום RPMI-1640 לדלל יותר המאגר התליה תא כדי להתכונן 30,000-80,000 תאים למ"ל תא ההשעיה מאגר הניסויים.
2. רכישת הניסוי והנתונים התפשטות/cytotoxicity
   1. להוסיף 50 µL (150 µL לצלחת אלקטרונית L8) תא בינוני אינקובציית כל טוב צלחת אלקטרונית 16 ולהשאיר אותו למשך 30 דקות באבטחה הוד עבור equilibration. להוסיף באופן ידני לוח אלקטרוני 16 במנתח תא בזמן אמת בחממה₂ CO-37 ^oC.
   2. להפעיל את תוכנית מבצע מנתח תא בזמן אמת על המחשב. על המחדל שלו להתנסות דף הגדרות תבנית, בחר "ניסוי דגם" ותנו שם פועל וזמינותו.
   3. בדף שלה פריסה ', בחר הבארות המתאימים כלולים הניסוי ולהזין את המידע כמו התא: סמים, מספר וסוג שמות בתיבות עריכה. בדף ' לוח הזמנים שלה, להוסיף את השלבים ניסיוני ולאחר מכן בחר הזמן רץ (כגון: 12, 24, או 48 שעות) של כל שלב, מרווח של רכישת נתוני זמן-אמת.
      הערה: כאן, מרווח הזמן של שלב 1 ו-2 הינם 1 דקות 15 דקות לאחר מכן.
   4. שמור את הקובץ ולחץ על לחצן "התחל" כדי למדוד את הרקע אימפדנס של המדיה על דף אינדקס התא שלה; הנתונים שיתקבלו להיות מופחתים באופן אוטומטי. בדף שלה טוב הגרף, ניתן לבקר כל עקומות היטב. עמוד העלילה שלה, להוסיף בבארות גרף זמן-תא אינדקס להיות הראה.
   5. לניסוי התפשטות תאים, ראשית לחץ על לחצן 'השהה' כדי להשהות את התוכנית. לאחר מכן להוציא את הצלחת אלקטרונית, להוסיף 100 µL A549 תא ההשעיה מאגר לכל טוב בטמפרטורת החדר. להשאיר את הצלחת למשך 30 דקות בשכונה אבטחה כדי לאפשר את התאים ליישב לתחתית של דגירה בארות.
   6. הוספה ידנית את הצלחת אלקטרונית בתחנה מנתח תא בזמן אמת. לחץ על לחצן "התחל" כדי להמשיך את הניסוי.
      הערה: בדף ' עלילה ', מנתח ברציפות רשומות ערכי אינדקס התא או עקומות לאורך כל הניסוי.
   7. בתום הניסוי, היכנסו לדף מגרש ופתח את הקובץ הניסוי. ולאחר מכן בחר כל הבארות הדגירה שנבדקו ועיקולים אינדקס התא שנוצר, שניתן בממוצע או מנורמל בפעם האחרונה לפני הוספת תרופות או שינוי בינוני כדי להפחית וריאציות בין מבחני. בדף ' ניתוח נתונים ', EC50 או IC50 יכול להיות מחושב

3. התחדשות של לוחות אלקטרוניים

הערה: עבור כל שלב השטיפה, הפתרון בצלחת אלקטרונית היה מעורב באופן יסודי (5 - 10 פעמים) באמצעות פיפטה של.

1. מקרה 1: עבור הערכה cytotoxicity של אנטי -תרופת סרטן
   1. זרעי A549 תאים בצלחת אלקטרונית כמפורט בסעיף 2.
   2. יש להמיס הידרוכלוריד דוקסורוביצין תרופה נגד סרטן (DOX) במדיום תא קודם. לאט לאט להוסיף DOX התאים (ריכוז DOX האחרון הוא µg 30/mL) באמצעות פיפטה של. שיא המודיע כמתואר בסעיף 2.
      הערה: לוח אלקטרוני המשמש היה מחדש מיד לאחר הניסוי היה שלם. במקרה זה, כפי DOX הוא כימיקל מסיסים, לרגנרציה של צלחת אלקטרונית בעקבות הפרוטוקול קל יחסית לטפל, אין בצעדים נוספים הדרושים.
   3. התחדשות
      1. להוציא לצלחת אלקטרוני המכיל תאים מתחנת מנתח תא בזמן אמת. שמים את הצלחת אלקטרוניים בשימוש בשכונה אבטחה סטרילי בטמפרטורת החדר ומערבבים בינוני תרבות ביסודיות באמצעות פיפטה. פיפטה החוצה כל המדיום.
      2. לשטוף צלחות אלקטרונית עם מים µL יונים 200 עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר.
      3. לעכל את התאים הנותרים על לוחות אלקטרוניים עם 0.25% להתמחויות טריפסין במשך 1-2 h (200 µL טוב) בתוך אינקובטור ב 37 ^oC. כאשר העיכול הושלם, מערבבים את הפתרון הדגירה 5 - 10 פעמים באמצעות פיפטה פיפטה את כל הפתרון בשכונה אבטחה בטמפרטורת החדר.
      4. לשטוף צלחות אלקטרונית עם אתנול µL 200 ומים µL 200, בהתאמה, כדלקמן: יונים מים 2 פעמים, אתנול 100% 2 פעמים; 75% אתנול 2 פעמים; יונים מים פי 2. היפוך על הלוחית אלקטרונית גזה סטרילית או נייר טישו כדי decant את יתרת כמות המים בטמפרטורת החדר.
      5. אולטרה סגול לעקר את הצלחת אלקטרונית מחדש עבור 1-2 h בשכונה אבטחה בטמפרטורת החדר.
         הערה: כפול הנפח של פתרונות לכל לרגנרציה של צלחת אלקטרונית L8.
2. מקרה 2: משלוח סמים באמצעות חומר mesoporous.
   1. להשתמש בחומרים סיליקה, כמו רוד mesoporous עם גודל נקבובית ממוצע של 5.6 nm כמו מטריצות משלוח סמים, כפי שדווחה בעבר²⁰.
      הערה: כאן, לוח אלקטרוני הועסק לעקוב אחר השפעת סמים-שחרור על תאים.
      1. להוסיף חומרים mesoporous לתוך הפתרון דגירה של כל טוב של הלוחות האלקטרוניים. סיליקה חומרים אינם מסיסים ובחלקם precipitate בצלחת אלקטרונית, לשטוף את הצלחת כדלקמן:
   2. בצע צעדים 3.1.3.1-3.1.3.3 כמתואר עבור מקרה 1.
   3. יש לשטוף את הפיוזים במים µL יונים 200 פעם בשכונה אבטחה בטמפרטורת החדר.
   4. לשטוף את הפיוזים עם אתנול מוחלטת µL 200 פי 2 בטמפרטורת החדר.
   5. יש לשטוף את הפיוזים עם 200 µL 75% אתנול פעם בטמפרטורת החדר.
   6. מוסיפים 250 µL של 75% אתנול מכל קידוח, לאטום את הצלחת אלקטרונית עם הסרט איטום בטמפרטורת החדר.
   7. ספין-114 g x למשך 2 דקות ולרוקן את הצלחת אלקטרונית. היפוך על הלוחית אלקטרונית גזה סטרילית או נייר טישו כדי decant את יתרת כמות המים בטמפרטורת החדר.
   8. חזור על שלב 3.2.5-3.2.7 פעם.
   9. אולטרה סגול לעקר את הצלחת אלקטרונית מחדש עבור 1-2 h בשכונה אבטחה בטמפרטורת החדר.
      הערה: כפול הנפח של כל פתרון בעת שטיפה L8 לוחות אלקטרוניים.

4. הערכה של אפקט התחדשות

1. מאפיינים אופטיים משטח regenerated צלחת אלקטרונית
   1. השימוש מפלדה כפיות לפרק בזהירות את החלק התחתון של הדגירה של טרי מחדש צלחת אלקטרוני המכיל מסודרים בשורות microelectrodes זהב... לובש כפפה פלסטיק, בזהירות לחסל את החלק המכילים שבב מהצלחת אלקטרונית באמצעות הכפית פלדה.
   2. מקום שני החלקים במרכזו של שקופיות מיקרוסקופ זכוכית ולאסוף ספקטרום ראמאן הנוצרת על ידי מיקרוסקופ ראמאן מצויד עם גלאי CCD²¹.
      הערה: ספקטרומטר היה מצויד עם לייזר nm 633, הספקטרום הוקלט במרווח של חשיפה ללייזר s 30 באורך-גל בטווח של 500-3500 ס מ^-1. התמונות אופטי התקבלו על ידי מיקרוסקופ ראמאן באמצעות עדשת העין 10 x ויעד x 50. איור 1A ו- 1C איור התקבלו גם שימוש במנגנון ראמאן מיקרוסקופ המותקנים.
   3. כדי להעריך את הכדאיות של תאים המצורף לאחר ספיגת תרופות נגד סרטן על טריות ועל regenerated לוחות אלקטרוניים, להשתמש קונאפוקלית לייזר מיקרוסקופ סריקה כדי לפקח על ידי קרינה פלואורסצנטית ספונטנית של DOX מולקולות נקלטו על ידי A549.
      1. כדי להקליט את קרינה פלואורסצנטית ספונטנית של DOX נספג על ידי השימוש (regenerated ורענן אלקטרונית צלחות עם תאים A549), תאים 63 X שמן nm אובייקטיבית, 485 כמו הגל עירור.
2. התנהגויות אלקטרוכימי של אלקטרודות מחדש
   הערה: כמו הסוואת ידנית של צלחת אלקטרוני מסחרי הוא לא אידיאלי להערכה של מצב חשמלי השטח כפי בדקתי וקשה, היעילות התחדשות של הפרוטוקול הוערך באמצעות אלקטרודה פחמן זהב/מזוגגות נורמלי (GCE) כמו מבחן פלטפורמה, שבו בוצעה עכבה אלקטרוכימי ספקטרוסקופיה (EIS). הקוטר של האלקטרודה Au וגם GCE הם 3 מ מ. אלקטרוכימי הנתונים התקבלו על ידי מנתח אלקטרוכימי מערכת 3-אלקטרודה מדידות עכבה בוצעו באמצעות אות חילופין (AC) של משרעת 10 mV ב תדר רחב טווח של 100 קילו-הרץ עד 0.01 הרץ.
   1. לפני המדידה, פולנית Au אלקטרודה של GCE על משטח דמוי מראה עם slurry אלומינה על בד ליטוש, ואחריו sonication במים כדי להסיר את כל החלקיקים.
   2. להפעיל את האלקטרודה Au 0.5 M H₂אז₄. להשיג נתונים EIS של חשופות אלקטרודה Au ו- GCE 10 מ מ אשלגן כלורי אלקטרוליט פתרון המכיל 1 מ מ K₃[Fe(CN)₆] כפי שמתואר²².
   3. להכין פתרון תא A549 מניות לפי 2.1.2 ו 2.1.3. ירידה 10 µL תא השעיה על-פני האלקטרודה Au ו- GCE. דגירה אלקטרודה Au ו GCE שופרת בתאים חממה 37 C ^oעבור 3 ה EIS להשיג נתונים של האלקטרודה Au GCE ששינה עם תאים ב- 10 מ מ אשלגן כלורי אלקטרוליט פתרון המכיל 1 מ מ K₃[Fe(CN)₆].
   4. להתחדש האלקטרודות באמצעות פרוטוקול מידה EIS.
      1. לטבול האלקטרודה Au ושינית GCE עם תאים ב- 0.25% טריפסין 0.5-2 ח' לשטוף את האלקטרודה Au ואת GCE בעדינות עם מים 4 פעמים. לשטוף את אלקטרודות ברכות עם אתנול מוחלטת 4 פעמים. Immerge Au אלקטרודה ולשטוף GCE 75% אתנול עבור ~ 5 דק את האסימונים ברכות עם 75% אתנול 4 פעמים.
      2. להשיג נתונים EIS regenerated אלקטרודה Au ו GCE בפתרון 10 מ מ אשלגן כלורי אלקטרוליט המכיל 1 מ מ K₃[Fe(CN)₆].

תוצאות

מאפייני משטח של סחר חופשי זהב: ההליכים התחדשות בשימוש פרוטוקול זה היו המתוארים באיור1. איור 2 מציג מיקרוסקופיים תמונות של טרי על פני השטח ואת מחדש לוחות אלקטרוניים באמצעות המיקרוסקופ האופטי. כפי שמוצג באיור 2...

Discussion

אנחנו סיכם כמה משיטות^{17,23,24,25,26} ולשם רגנרציה בשבבים בטבלה1. בעיקרון, שיטות אלה מעורב בתנאים קשים יחסית ניסיוני כדי להשיג את התחדשות מוחלטת של שבבי עקב הנוכחות של מולקולה חזקה-מולקולה אינטראקצ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Stock reagents	reconstitution	Concentration used	Storage
Apo-transferrin	10 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
N-acetyl cysteine	5 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Sodium selenite	2.5 mg/mL in H2O	1:25,000	-20°C
Collagen IV	200 μg/mL in PBS	1:100	-80°C
TGF-b2	20 μg/mL in PBS	1:10,000	-20°C
IL-34	100 μg/mL in PBS	1:1,000	-80°C
Ovine wool cholesterol	1.5 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparan sulfate	1 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Oleic acid/Gondoic acid	Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparin	50 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
Solutions	Recipe		Comments
Perfusion Buffer	50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)		Use when ice-cold
Douncing Buffer	200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++		Use when ice-cold
Panning Buffer	2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)	DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite		Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating	MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2		Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)	MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid		Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.