Regeneração da matriz microeletrodos ouro equipado para um analisador de celular em tempo real

Resumo

Este protocolo descreve uma estratégia geral para regenerar microeletrodos de ouro matriz comerciais equipados para um analisador de célula livre de rótulo visto economia sobre as alta execução custos ofmicrochip ensaios baseados. O processo de regeneração inclui digestão do trypsin, enxaguando com água, etanol e uma etapa de fiação, que permite o uso repetido de microchips.

Resumo

O ensaio de baseada em célula livre de rótulo é vantajoso para estudos bioquímicos por causa disso não requer o uso de animais experimentais. Devido à sua capacidade para fornecer informações mais dinâmicas sobre células sob condições fisiológicas do que ensaios bioquímicos clássicos, este ensaio de célula livre de rótulo em tempo real com base no princípio da impedância elétrica está atraindo mais atenção durante o passado década. No entanto, sua utilização prática pode ser limitada devido ao custo relativamente caro de medição, no qual caro consumível descartável ouro "microchips" é utilizados para o analisador de célula. Neste protocolo, temos desenvolvido uma estratégia geral para regenerar a matriz microeletrodos ouro equipados para um analisador de célula livre de etiqueta comercial. O processo de regeneração inclui digestão do trypsin, lavagem com etanol e água e uma etapa de fiação. O método proposto foi testado e demonstrou ser eficaz para a regeneração e o uso repetido de placas eletrônicas comerciais pelo menos três vezes, que ajudará pesquisadores salvar sobre o alto custo de execução dos ensaios de celular em tempo real.

Introdução

Devido ao seu eficiente e menos trabalhoso processo experimental, tecnologia livre de etiqueta baseada em célula tem testemunhado o rápido crescimento na última década para fins analíticos, bem como seleção, tais como no aspecto da proteômica^1,2 , drogas entrega³, etc.^4,5 comparado com métodos bioquímicos tradicionais destinadas a análise de células, ensaio de pilha rótulo livre em tempo real com o protótipo desenvolvido pela Giaever e colegas de trabalho anteriormente⁶ é baseado no princípio de gravar alterações de sinal elétrico na superfície da célula-anexado microchips, que permitem uma medição contínua de crescimento celular ou migração de forma quantitativa. Seguindo esta estratégia, foi lançado um celular em tempo real eletrônico de sensoriamento sistema (RT-CES) usando o princípio de detecção baseada em impedância elétrica foi introduzido^7,8 e, mais recentemente, um analisador de comercial celular em tempo real (RTCA) para o laboratório de pesquisa⁹.

O analisador de celular em tempo real comercial principalmente lê sinais evocados das células de impedância elétrica, que resultam as alterações fisiológicas das células incubadas incluindo proliferação celular, migração, morfologia, viabilidade e aderência sobre a superfície de "microchips"^10,11. Esses sinais elétricos são convertidos mais pelo analyzer em um parâmetro adimensional denominado índice célula (CI) para avaliar o estado da célula. A mudança da impedância de microchips reflete principalmente o ambiente local iônico das células cobertos na interface eletrodo/solução. Portanto, o desempenho analítico do analisador célula depende muito a unidade de sensoriamento de núcleo, os microchips descartáveis (i.e., chamadas placas eletrônicas, por exemplo, 96/16/8 poços), que são feitos de microeletrodos matriz de ouro Litograficamente, impresso no fundo dos poços de incubação. Os ouro microeletrodos montam em um formato de círculo-on-line (Figura 1) e cobrem a maior parte da superfície dos poços de incubação, que permitem a detecção dinâmica e sensível de células anexado^{3,12,13 ,14}. O CI aumentará no caso mais cobertura de superfície de células no chip e diminuir quando as células estão expostas a uma toxicidade resultando em apoptose. Embora o analisador em tempo real da célula tenha sido usado com frequência para determinar a citotoxicidade¹¹ e neurotoxicidade¹⁵ e fornecer mais informações cinéticas do método clássico de pontos de extremidade, as placas eletrônicas descartáveis são as mais caras consumíveis.

Até agora, não houve nenhum método disponível para a regeneração da placa eletrônica, que é provavelmente devido ao fato de que as condições de regeneração dura, tais como solução de piranha ou ácido acético são envolvidos^{16,17, 18}, que podem alterar o elétrico de microchips de ouro. Portanto, um método eficiente e suave para remover as células aderentes e outras substâncias da superfície dos chips de ouro será desejável para o processo de regeneração da placa eletrônica. Recentemente desenvolvemos um protocolo que visa a regeneração de descartáveis placas eletrônicas utilizando reagentes não-corrosivo e os chips regenerados foram caracterizados por métodos eletroquímicos, bem como óptico¹⁹. Ao utilizar reagentes de laboratório prontamente disponível e moderado, incluindo tripsina e etanol, temos estabelecido um método geral para regenerar a placa eletrônica comercial sem efeitos adversos, que é aplicada com sucesso para os dois tipos principais de regenerar da placa eletrônica (16 e L8) usaram para RTCA.

Protocolo

Nota: em geral, o processo de regeneração inclui digestão de tripsina e a etapa de lavagem com água e etanol. O tempo de digestão muda de acordo com o número de células utilizadas e o tipo e o número de células utilizadas podem variar dependendo os fins experimentais. É aconselhável verificar os microchips regenerados usando métodos ópticos e eletroquímicos para otimizar as condições de regeneração. Durante o experimento, solúveis e insolúveis químicos podem estar envolvidos, e aqui estes dois casos típicos dos processos de regeneração são detalhados.

1. preparação de soluções de regeneração

Nota: Preparar e lidar com todas as soluções em condições estéreis.

1. Prepare a solução fresca de tripsina 0,25% (g/v). Tripsina pode ser comprada ou preparada como segue.
   1. Dissolva a 0,25 g de tripsina em 100 mL de soro de tampão fosfato pH 7,4 (PBS).
   2. Mexa a solução até a tripsina é totalmente dissolvida em 4 ^óC. agitar a solução a baixa velocidade, tendo o cuidado de evitar qualquer formação de bolhas.
   3. Filtre a solução com um filtro de 0,22 µm do capuz de biossegurança.
2. Prepare-se 75% etanol usando etanol absoluto. Despeje num balão volumétrico de 75 mL de etanol absoluto e adicionar água desionizada até o volume atinge 100 mL. Realize a esterilização mais se necessário.

2. incubação e proliferação de células A549 em placas eletrônicas

Nota: Tipos de placa eletrônica 16 e L8 são ambos feitos de microeletrodos de ouro matriz impressos Litograficamente no fundo dos poços de incubação. Placa eletrônica 16 tem 16 poços enquanto placa eletrônica L8 tem 8 poços. Os poços da placa eletrônica 16 são redondos enquanto os poços da placa eletrônica L8 são retângulos arredondados. O volume de cada placa eletrônica 8 bem é cerca de 830 µ l e cada placa eletrônica 16 bem é aproximadamente 270 µ l.

1. Cultura de pilha A549
   1. Células de cultura A549 em Roswell Park Memorial Institute-1640 medium (RPMI-1640), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina na cultura de pilha de prato.
   2. Passagem das células quando a densidade celular atinge ~ 75% em seguida, lave a camada de células aderentes com 1 × PBS e trypsinize com solução de tripsina 0,25% por 1 min em 37 ^oC. Centrifugar as células a 179 × g por 5 min remover a tripsina. Ressuspender as células em 10 mL de meio de cultura mais ou outras experiências.
      Nota: A solução de células resuspended no meio aqui é designada como o buffer de suspensão celular.
   3. Pegue 10 µ l e contar o número de células usando um hemocytometer. Utilize o meio RPMI 1640 para diluir ainda mais o buffer de suspensão de células para preparar 30.000-80.000 células/mL celular suspensão de tampão para os experimentos.
2. Proliferação/citotoxicidade experiência e aquisição de dados
   1. Adicione meio de celular 50 µ l (150 µ l para a placa eletrônica L8) para cada incubação bem da placa eletrônica 16 e deixe por 30 min em Biossegurança a capa para o equilibrio. Inserir manualmente a placa eletrônica 16 no analisador de celular em tempo real a incubadora de CO₂ em 37 ^oC.
   2. Lançamento do programa de operação do analisador de celular em tempo real no computador. Em seu padrão experimentar a página de configuração padrão, selecione "Modelo de experiência" e nomeie o execução do ensaio.
   3. Na sua página de Layout, selecione os poços correspondentes que estão incluídos no experimento e as informações, como nomes de drogas, o número e o tipo de célula nas caixas de edição de entrada. Na sua página de agenda, adicionar as etapas experimentais e, em seguida, selecione o tempo de execução (por exemplo, 12, 24 ou 48 h) de cada etapa e o intervalo de aquisição de dados em tempo real.
      Nota: Aqui, o intervalo do passo 1 e 2 são 1 min e 15 min depois.
   4. Salve o arquivo e clique no botão "Iniciar" para medir a impedância de fundo dos meios de comunicação na sua página de índice de célula; os dados resultantes serão ser subtraídos automaticamente. Na sua página bem gráfico, todas as curvas bem podem ser visitadas. Na sua página de enredo, adicionar poços e o gráfico de índice de tempo-célula serão mostrados.
   5. Para o experimento de proliferação celular, em primeiro lugar, clique no botão "Pause" para pausar o programa. Peguem a placa eletrônica e juntar 100 µ l de A549 celular suspensão tampão por bem à temperatura ambiente. Deixe o prato por 30 min do bairro de biossegurança para permitir que as células resolver o fundo dos poços de incubação.
   6. Inserir manualmente a placa eletrônica na estação de analisador de celular em tempo real. Clique no botão "Iniciar" para continuar o experimento.
      Nota: Na página da trama, o analisador continuamente registra valores de índice de célula ou curvas ao longo do experimento.
   7. Quando o experimento for concluído, entrar na página de enredo e abra o arquivo de experimento. Em seguida, selecione todos os poços de incubação testado e as curvas de índice de célula resultantes que podem ser média ou normalizadas pela última vez antes de adicionar produtos farmacêuticos ou mudando médio para reduzir variações entre ensaios. Na página de análise de dados, pode ser calculada CE50 ou IC50

3. regeneração de placas eletrônicas

Nota: Para cada etapa de lavagem, a solução na placa eletrônica foi misturada completamente (5 - 10 vezes) usando uma pipeta.

1. Caso 1: para avaliação da citotoxicidade de antidrogas do cancro
   1. Células de A549 semente na placa eletrônica, conforme descrito na secção 2.
   2. Dissolva o cloridrato de doxorrubicina drogas anti-câncer (DOX) no meio celular primeiro. Adicionar lentamente DOX para as células (concentração final de DOX é 30 µ g/mL) com uma pipeta. Grave o CI, conforme descrito na seção 2.
      Nota: A placa eletrônica utilizada foi regenerada imediatamente depois que o experimento estava completo. Neste caso, como DOX é uma substância química solúvel, a regeneração da placa eletrônica seguindo o protocolo é relativamente fácil de manusear e não há etapas adicionais são necessárias.
   3. Regeneração
      1. Tire a placa eletrônica contendo células da estação de analisador de celular em tempo real. Coloque a placa eletrônica usada em uma capa de biossegurança estéril à temperatura ambiente e misture cuidadosamente com uma pipeta de meio de cultura. Pipetar para fora todo o meio.
      2. Lave as placas electrónicas com 200 água µ l de água deionizada por 3 vezes à temperatura ambiente.
      3. Digerir as células remanescentes nas placas eletrônicas com tripsina 0,25% recentemente preparada para 1-2 h (200 µ l/poço) em uma incubadora a 37 ^oC. Quando a digestão é concluída, misture a solução de incubação, 5 - 10 vezes utilizando uma pipeta e pipeta para fora toda a solução de capuz biossegurança à temperatura ambiente.
      4. Lave as placas electrónicas com 200 µ l etanol e água 200 µ l, respectivamente, da seguinte maneira: água deionizada 2 vezes, 100% etanol 2 vezes; 75% de etanol 2 vezes; água desionizada 2 vezes. Inverta a placa eletrônica em uma gaze esterilizada ou lenços de papel para decantar a água restante à temperatura ambiente.
      5. Ultravioleta esterilizar a placa eletrônica regenerada para 1-2 h de capuz biossegurança à temperatura ambiente.
         Nota: O dobro do volume de todas as soluções para a regeneração da placa eletrônica L8.
2. Caso 2: entrega da droga utilizando material mesoporoso.
   1. Use materiais de mesoporos haste-como sílica com um tamanho médio dos poros de 5.6 nm como matrizes de entrega de drogas, como relatado anteriormente²⁰.
      Nota: Aqui, a placa eletrônica foi empregada para monitorar o efeito de liberação de drogas em células.
      1. Adicione material mesoporoso para a solução de incubação de cada poço das placas eletrônicas. Como materiais de silicone não são solúveis e precipitado na placa eletrônica, lave o prato da seguinte forma:
   2. Execute etapas 3.1.3.1-3.1.3.3 conforme descrito para o caso 1.
   3. Lave os microchips com 200 água µ l de água deionizada uma vez de capuz biossegurança à temperatura ambiente.
   4. Lave os microchips com etanol absoluto de 200 µ l 2 vezes à temperatura ambiente.
   5. Lave uma vez os microchips com 200 µ l 75% de etanol na temperatura de quarto.
   6. Adicionar 250 µ l de etanol a 75% em cada poço e selar a placa electrónica com o filme da selagem à temperatura ambiente.
   7. Girar a 114 x g por 2 min e esvaziar a placa eletrônica. Inverta a placa eletrônica em uma gaze esterilizada ou lenços de papel para decantar a água restante à temperatura ambiente.
   8. Repita a etapa 3.2.5-3.2.7 uma vez.
   9. Ultravioleta esterilizar a placa eletrônica regenerada para 1-2 h de capuz biossegurança à temperatura ambiente.
      Nota: Dobre o volume da solução de todos quando enxaguar L8 de placas eletrônicas.

4. avaliação do efeito de regeneração

1. Características ópticas da superfície da placa eletrônica regenerada
   1. Uso um aço colher para desmontar cuidadosamente a parte inferior de incubação bem de novo e regenerado placa eletrônica que contém ouro microeletrodos se vestiu. Usando uma luva de plástico, limpe cuidadosamente a parte contendo microchip da placa eletrônica usando a colher de aço.
   2. Coloque as duas partes no centro das lâminas de microscópio e coletar os espectros Raman resultantes por Raman microscópio equipado com um detector de CCD²¹.
      Nota: O espectrômetro foi equipado com um laser de 633 nm e os espectros foi gravado em um intervalo de 30 exposição de laser s no comprimento de onda na faixa de 500-3500 cm^-1. As imagens ópticas foram obtidas por um microscópio Raman usando uma lente olho de 10x e objectivo de x 50. Figura 1A e Figura 1 também foram obtidas utilizando o aparelho microscópio Raman instalado.
   3. Para avaliar a viabilidade das células anexadas após a absorção de drogas anti-câncer no fresco e regenerada de placas eletrônicas, use um confocal laser microscópio de varredura para monitorar a fluorescência espontânea de moléculas DOX absorvidas pelo A549.
      1. Para gravar a fluorescência espontânea da DOX absorvida por células (fresco e regenerada eletrônica placas com células A549), uso um 63 X óleo objetiva e 485 nm como o comprimento de onda de excitação.
2. Comportamentos eletroquímicos dos eléctrodos regenerados
   Nota: Como dissimulação manual de uma placa eletrônica comercial é difícil e não é o ideal para a avaliação do estado elétrico superfície como verificado, a eficiência de regeneração do protocolo foi avaliada usando eletrodo de carbono vítreo/ouro normal (GCE) como um teste plataforma, na qual foi realizada a espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS). Os diâmetros de eletrodo o Au e o GCE são 3 mm. eletroquímica dados foram obtidos por um analisador eletroquímico com um sistema do três-elétrodo e as medições de impedância foram realizadas utilizando um sinal de corrente alternada (CA) de amplitude de mV 10 em um escala de frequência larga de 0,01 Hz a 100 kHz.
   1. Antes da medição, o eletrodo Au e polonesa GCE a uma superfície de espelho-como com uma suspensão de alumina em um pano de polimento, seguido por sonication em água para remover quaisquer partículas.
   2. Ativar o eletrodo Au em 0,5 M H₂então₄. Obter dados de sie do nu Au eléctrodo e GCE em 10 mM solução eletrolítica de KCl contendo 1mM K₃[Fe(CN)₆] como descrito²².
   3. Prepare a solução-célula mãe A549 segundo 2.1.2 e 2.1.3. Gota de suspensão de células 10 µ l na superfície do eletrodo Au e GCE. Incube o eletrodo Au e GCE modificado com células numa incubadora 37 ^oC por 3 h. dados obter sie do eletrodo Au e GCE modificado com células em solução de KCl eletrolítica contendo 1 mM K₃[Fe(CN)₆] de 10 mM.
   4. Regenere os eletrodos, usando o protocolo e medida EIS.
      1. Mergulhe o eletrodo Au e GCE modificado com células em tripsina 0,25% para 0,5-2 h. enxaguar o eletrodo Au e GCE suavemente com água 4 vezes. Lave os eletrodos suavemente com etanol absoluto 4 vezes. Emergir o eletrodo Au e GCE em 75% etanol de ~ 5 min. enxágue os chips suavemente com 75% de etanol 4 vezes.
      2. Obter dados de sie do regenerada Au eléctrodo e GCE em solução de eletrólito de KCl 10 mM contendo 1mM K₃[Fe(CN)₆].

Resultados

Propriedades de superfície de microchips de ouro: os procedimentos de regeneração utilizados neste protocolo foram descritos na Figura 1. A Figura 2 mostra o microscópico fotos do fresco de superfície e regenerado placas eletrônicas por microscópio óptico. Como mostrado na Figura 2A e Figura 2, microscópicos observações indi...

Discussão

Estamos resumidos diversos métodos disponíveis^{17,23,24,25,26} para regenerar microchips no quadro 1. Basicamente, esses métodos envolveram relativamente duras condições experimentais para alcançar a regeneração completa de chips por causa da presença de interações de molécula-molécula forte como a do complexo imune usado para chips...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Stock reagents	reconstitution	Concentration used	Storage
Apo-transferrin	10 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
N-acetyl cysteine	5 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Sodium selenite	2.5 mg/mL in H2O	1:25,000	-20°C
Collagen IV	200 μg/mL in PBS	1:100	-80°C
TGF-b2	20 μg/mL in PBS	1:10,000	-20°C
IL-34	100 μg/mL in PBS	1:1,000	-80°C
Ovine wool cholesterol	1.5 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparan sulfate	1 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Oleic acid/Gondoic acid	Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparin	50 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
Solutions	Recipe		Comments
Perfusion Buffer	50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)		Use when ice-cold
Douncing Buffer	200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++		Use when ice-cold
Panning Buffer	2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)	DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite		Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating	MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2		Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)	MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid		Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.