Regeneration der angeordneten Gold Mikroelektroden ausgestattet für eine Echtzeit-Zelle-Analyzer

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine allgemeine Strategie zur kommerziellen angeordneten gold Mikroelektroden ausgestattet für ein Label-freie Zelle Analyzer zur Einsparung auf die hohen laufenden Kosten Ofmicrochip basierende Assays zu regenerieren. Der Regenerationsprozess enthält Trypsin-Verdauung, Spülen mit Wasser, Ethanol und eine Spinnerei Schritt, der wiederholte Verwendung von Mikrochips ermöglicht.

Zusammenfassung

Markierungsfreie zellbasierte Assays ist vorteilhaft, biochemische Untersuchung wegen der Verwendung von Versuchstieren nicht erforderlich ist. Aufgrund seiner Fähigkeit, dynamischer Auskunft über Zellen unter physiologischen Bedingungen als klassischen biochemischen Assays zieht dieser markierungsfreie Echtzeit-Zelle-Assay basiert auf dem Prinzip der elektrischen Impedanz mehr Aufmerksamkeit in den letzten zehn Jahre. Seine praktische Nutzung kann aufgrund der relativ teuren Kosten für Messung, begrenzt jedoch in denen teure Verbrauchsmaterialien Einweg gold Mikrochips für die Zelle-Analyzer verwendet werden. In diesem Protokoll entwickelten wir eine allgemeine Strategie zur angeordneten gold Mikroelektroden ausgestattet für einen kommerziellen markierungsfreie Zelle Analyzer zu regenerieren. Der Regenerationsprozess enthält Trypsin-Verdauung, Spülen mit Wasser, Ethanol und eine Spinnerei Schritt. Die vorgeschlagene Methode wurde getestet und gezeigt, dass effektiv für die Regeneration und die wiederholte Verwendung der kommerziellen elektronischen Platten mindestens drei Mal die Forscher speichern auf die hohen laufenden Kosten für Echtzeit-Zelle-Assays helfen.

Einleitung

Dank seiner effizienten und weniger arbeitsintensiv experimentellen Prozess erlebte markierungsfreie zellbasierte Technologie rasante Wachstum im letzten Jahrzehnt für analytische sowie Screening Zwecke wie z. B. unter dem Aspekt der Proteomik^1,2 , Drogen-Lieferung³, usw.^4,5 im Vergleich mit traditionellen biochemischen Methoden zur Zellanalyse, markierungsfreie Echtzeit-Zelle Assay mit zuvor von Giaever und Kollegen entwickelten Prototyp⁶ basiert auf dem Prinzip der Erfassung elektrisches Signal Veränderungen auf der Oberfläche der Zelle angebracht Mikrochips, die eine kontinuierliche Messung des Zellwachstum oder Migration in einer quantitativen Weise ermöglichen. Nach dieser Strategie wurde eine Echtzeit-Zelle elektronische Sensorik (RT-CES) System elektrische Impedanz-basierte Erkennung Prinzip eingeführt^7,8 und seit kurzem auch einen kommerziellen Echtzeit-Zelle-Analyzer (RTCA) wurde gestartet. für Labor Forschung⁹.

Der kommerzielle Echtzeit-Zelle-Analyzer liest vor allem die Zellen evozierten Signale der elektrischen Impedanz, die sich aus der physiologischen Veränderungen der inkubierten Zellen einschließlich Zellproliferation, Migration, Rentabilität, Morphologie und Termintreue auf die Oberfläche des Mikrochips^10,11. Solche elektrischen Signale weiter vom Analyzer eine dimensionslose Parameter mit dem Namen der Zelle Index (CI) zur Beurteilung des Zustands der Zelle umgerechnet. Die Änderung der Impedanz von Mikrochips spiegelt vor allem die ionische Umgebung bedeckten Zellen an der Elektrode/Lösung-Schnittstelle. Daher stützt sich die analytische Leistung von der Zelle Analyzer auf Fernerkundung Kerneinheit Einweg-Mikrochips (d.h., sogenannten elektronischen Platten, z.B., 96/16/8-Brunnen), die aus angeordneten gold Mikroelektroden bestehen lithographically am Ende der Inkubationszeit Brunnen gedruckt. Die gold Mikroelektroden versammeln sich in einem Kreis-on-Line-Format (Abbildung 1) und decken den größten Teil der Fläche der Inkubation Brunnen, die eine dynamische und empfindliche Detektion von angeschlossenen Zellen^{3,12,13 ermöglichen ,14}. Die CI wird bei mehr Flächendeckung der Zellen auf dem Chip zu erhöhen und verringern, wenn Zellen eine Apoptose führt Schlüpfzeit ausgesetzt sind. Obwohl der Echtzeit-Zelle-Analyzer bestimmen Zytotoxizität¹¹ und Neurotoxizität¹⁵ und mehr kinetische Informationen als klassische Endpunkte Methode häufig verwendet worden ist, sind die elektronischen Einweggeschirr das teuerste Verbrauchsmaterial.

Bis jetzt gab es keine verfügbaren Methoden für die Regeneration der elektronischen Platte, was wahrscheinlich ist, da sind harte Regeneration Zustände, wie Piranha-Lösung oder Essigsäure mit^{16,17, 18}, die den elektrischen Status gold Mikrochips verändern kann. Daher wird eine leichte und effiziente Methode, adhärenten Zellen und andere Substanzen von der Oberfläche des gold-Chips zu entfernen für die elektronische Platte Regenerationsprozess wünschenswert. Vor kurzem haben wir ein Protokoll, die darauf abzielen, die Regeneration der elektronischen Einweggeschirr mit nichtrostenden Reagenzien und die regenerierten Chips zeichneten sich durch elektrochemische sowie optische Methoden¹⁹. Mithilfe von leicht verfügbaren und moderate Laborreagenzien einschließlich Trypsin und Ethanol haben wir eingerichtet, eine allgemeine Methode, um die kommerzielle elektronische Platte ohne Nebenwirkungen, regenerieren die erfolgreich angewendet wird, um die beiden wichtigsten Arten zu regenerieren der elektronische Platte (16 und L8) für RTCA verwendet.

Protokoll

Hinweis: In der Regel beinhaltet der Regenerationsprozess Trypsin-Verdauung und spülen Schritt mit Ethanol und Wasser. Die Dauer der Verdauung ändert sich entsprechend der Anzahl der verwendeten Zellen, und die Art und Anzahl der verwendeten Zellen können je nach den experimentellen Zwecken. Es wird empfohlen, die regenerierten Mikrochips mit optischen und elektrochemische Methoden zur Optimierung der Regeneration Bedingungen zu überprüfen. Während des Experiments lösliche und unlösliche Chemikalien beteiligt sein können, und hier sind diese zwei typische Fälle der Regeneration Verfahren detailliert.

1. Vorbereitung der Regeneration-Lösungen

Hinweis: Vorbereiten und alle Lösungen unter sterilen Bedingungen zu behandeln.

1. Bereiten Sie frische 0,25 % (g/V)-Trypsin-Lösung. Trypsin kann gekauft oder frisch zubereitet wie folgt.
   1. Lösen Sie 0,25 g von Trypsin in 100 mL pH 7.4 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
   2. Rühren Sie die Lösung, bis die Trypsin bei 4 ^oC. Rühren der Lösung bei niedriger Geschwindigkeit, dabei darauf achten, um Blasenbildung zu vermeiden vollständig aufgelöst ist.
   3. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 µm-Filter in der Biosicherheits-Haube.
2. Bereiten Sie 75 % Ethanol mit absoluten Ethanol. Gießen Sie 75 mL absolutes Ethanol in einem volumetrischen Kolben und fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, bis das Volumen 100 mL erreicht. Führen Sie ggf. weitere Sterilisation.

2. Inkubation und Proliferation von A549 Zellen in elektronischen Platten

Hinweis: Elektronische Plattenarten 16 und L8 bestehen beide aus angeordneten gold Mikroelektroden lithographically am Ende der Inkubationszeit Brunnen gedruckt. Elektronische Platte 16 verfügt über 16 Brunnen während elektronische Platte L8 8 Brunnen. Die Brunnen der elektronischen Platte 16 sind Runde während der Brunnen der elektronischen Platte L8 abgerundete Rechtecke sind. Nun ist das Volumen der einzelnen elektronischen Platte 8 rund 830 µL und jede elektronische Platte 16 und ist ca. 270 µL.

1. A549 Zellkultur
   1. Kultur A549 Zellen in Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI-1640) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin in der Zellkultur dish.
   2. Durchgang der Zellen, wenn die Zelldichte ~ 75 % erreicht dann die anhaftende Zellschicht mit 1 × PBS waschen und trypsinize mit 0,25 % Trypsin-Lösung für 1 min bei 37 ^oC. Zentrifuge die Zellen bei 179 × g für 5 min, Trypsin zu entfernen. Die Zellen in 10 mL Medium für weitere Kultur oder andere Experimente aufzuwirbeln.
      Hinweis: Die Lösung von Zellen, die Nukleinsäuretablette im Medium wird hier als der Zelle Aussetzung Puffer bezeichnet.
   3. Nehmen Sie 10 µL und zählen Sie die Anzahl von Zellen mit einem Hemocytometer. Verwenden Sie das RPMI-1640 Medium weiter verdünnen den Zelle Aussetzung Puffer um 30.000-80.000 Zellen/mL Zelle Aussetzung Puffer für die Experimente vorzubereiten.
2. Verbreitung/Zytotoxizität Experiment und Datenerfassung
   1. Jede Inkubation gut des elektronischen Platte 16 und lassen es für 30 min in der Biosicherheit Haube für Gleichgewichtherstellung fügen Sie 50 µL (150 µL für elektronische Platte L8) Zelle Medium hinzu. Fügen Sie manuell die elektronische Platte 16 in der Echtzeit-Zelle-Analyzer im CO₂ Inkubator bei 37 ^oC.
   2. Starten Sie das Echtzeit-Zelle Analyzer Betrieb Programm auf dem Computer. Auf den Standardwert experimentieren Sie Muster-Setup-Seite, wählen Sie "Experiment Modell" und nennen Sie den laufende Test zu.
   3. Der Layout-Seite wählen Sie die entsprechende Vertiefungen, die in das Experiment enthalten sind und geben Sie die Daten wie Typ, Nummer und Droge Zellnamen in den Bearbeitungsfeldern. Fügen Sie auf der Seite Zeitplan der experimentellen Schritte hinzu, und wählen Sie dann die Laufzeit (z. B. 12, 24 oder 48 Stunden) der jeder Schritt und jedes Intervall von Echtzeit-Datenerfassung.
      Hinweis: Das Intervall von Schritt 1 und 2 sind hier 1 min und 15 min später.
   4. Speichern Sie die Datei und klicken Sie auf "Start"-Taste, um die Hintergrund-Impedanz der Medien auf seiner Zelle Indexseite zu messen; die daraus resultierenden Daten werden automatisch abgezogen. Auf seiner Seite auch Graph können alle Kurven gut besucht werden. Auf seiner Parzelle-Seite hinzufügen Brunnen und das Diagramm von Zeit-Zelle Index werden gezeigt.
   5. Klicken Sie für die Zelle Verbreitung Experiment zunächst die Schaltfläche "Pause" um das Programm zu pausieren. Dann nehmen Sie die elektronische Platte und fügen Sie 100 µL A549 Zellen Aussetzung Puffer pro Bohrloch bei Raumtemperatur hinzu. Lassen Sie die Platte für 30 min in der Biosicherheits-Haube, die Zellen auf der Unterseite der Inkubation Brunnen abrechnen zu lassen.
   6. Fügen Sie manuell die elektronische Platte in der Echtzeit-Zelle-Analysator-Station. Klicken Sie auf "Start", um das Experiment fortgesetzt werden.
      Hinweis: Auf der Seite "Plot" zeichnet der Analysator kontinuierlich Zelle Indexwerte oder Kurven in das Experiment.
   7. Wenn das Experiment abgeschlossen ist, geben Sie die Plot-Seite und öffnen Sie die Experiment-Datei. Wählen Sie dann alle getesteten Inkubation Brunnen und die resultierenden Zellenindex Kurven, die im Durchschnitt oder normalisiert zum letzten Mal vor Arzneimitteln hinzufügen oder ändern von Medium, um Schwankungen zwischen Assays zu reduzieren. Auf der Seite "Datenanalyse" werden EC50 oder IC50 berechnet

3. Regeneration von elektronischen Platten

Hinweis: Bei jedem Spülvorgang Schritt die Lösung in der elektronischen Platte war gut durchgemischt (5-10 Mal) mit einer Pipette.

1. Fall 1: für die Bewertung der Zytotoxizität von Anti -Krebs-Medikament
   1. Samen A549 Zellen auf die elektronische Platte wie beschrieben in Abschnitt 2.
   2. Löse zuerst die Anti-Krebs-Medikament Doxorubicin Hydrochlorid (DOX) in der Zelle-Medium. Fügen Sie langsam DOX zu den Zellen (Endkonzentration von DOX ist 30 µg/mL) mit einer Pipette. Notieren Sie die CI, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
      Hinweis: Die elektronische Platte verwendet wurde regeneriert, sofort nachdem das Experiment abgeschlossen war. In diesem Fall, wie DOX eine lösliche chemische ist, die Regeneration der elektronischen Platte nach dem Protokoll ist relativ einfach zu handhaben und sind keine zusätzlichen Schritte erforderlich.
   3. Regeneration
      1. Nehmen Sie die elektronische Platte mit Zellen aus der Echtzeit-Zelle-Analysator-Station. Die verwendeten elektronischen Platte in einem sterilen Biosafety-Abzug bei Raumtemperatur und mischen Sie Kulturmedium gründlich mit einer Pipette. Pipette, das Medium.
      2. 3 Mal bei Raumtemperatur spülen Sie die elektronische Platten mit 200 µL entionisiertem Wasser.
      3. Die verbleibenden Zellen auf den elektronischen Platten mit 0,25 % frisch zubereitete Trypsin für 1-2 h (200 µL/Well) in einem Inkubator bei 37 ^oC. zu verdauen Wenn die Verdauung abgeschlossen ist, mischen Sie die Inkubation Lösung 5-10 Mal mit einer Pipette und Pipette, die Lösung in der Biosicherheits-Haube bei Raumtemperatur.
      4. Die elektronische Platten mit 200 µL Ethanol und 200 µL Wasser spülen, bzw., wie folgt: deionisiertes Wasser 2 Mal, 100 % igem Ethanol 2 Mal; 75 % Ethanol 2 Mal; entionisiertem Wasser 2 Mal. Invertieren Sie die elektronische Platte auf eine sterile Gaze oder Seidenpapier, das restliche Wasser bei Raumtemperatur zu dekantieren.
      5. Ultraviolett sterilisieren die regenerierte elektronische Platte für 1-2 h in der Biosicherheits-Haube bei Raumtemperatur.
         Hinweis: Verdoppelt die Lautstärke aller Lösungen für die Regeneration von elektronischen Platte L8.
2. Fall 2: Drug-Delivery mesoporösen Materialien verwenden.
   1. Stabförmige mesoporösen Kieselsäure Materialien verwenden, mit einer durchschnittliche Porengröße von 5,6 nm als Medikament Lieferung Matrizen, wie bereits berichtet²⁰.
      Hinweis: Hier wurde die elektronische Platte eingesetzt, um die Wirkstofffreisetzung Wirkung auf Zellen überwachen.
      1. Mesoporösen Materialien in die Inkubation Lösung von jedem Bohrloch der elektronischen Platten hinzufügen. Da Kieselsäure Materialien nicht löslich und Niederschlag in der elektronischen Platte sind, spülen Sie die Platte wie folgt:
   2. Führen Sie Schritte 3.1.3.1-3.1.3.3, wie für Fall 1 beschrieben.
   3. Spülen Sie die Mikrochips mit 200 µL deionisiertes Wasser einmal in der Biosicherheits-Haube bei Raumtemperatur.
   4. Spülen Sie die Mikrochips mit 200 µL absoluten Ethanol 2 Mal bei Raumtemperatur.
   5. Spülen Sie die Mikrochips mit 200 µL 75 % Ethanol einmal bei Raumtemperatur.
   6. Fügen Sie 250 µL 75 % Ethanol in jede Vertiefung und die elektronische Dichtplatte mit der Siegelfolie bei Raumtemperatur.
   7. Mit 114 X g für 2 min drehen Sie, und leeren Sie die elektronische Platte. Invertieren Sie die elektronische Platte auf eine sterile Gaze oder Seidenpapier, das restliche Wasser bei Raumtemperatur zu dekantieren.
   8. Wiederholen Sie Schritt 3.2.5-3.2.7 einmal.
   9. Ultraviolett sterilisieren die regenerierte elektronische Platte für 1-2 h in der Biosicherheits-Haube bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Das Volumen der alle Lösung zu verdoppeln, wenn L8 elektronische Teller spülen.

4. Bewertung der Regenerationseffekt

1. Optischen Eigenschaften des regenerierten elektronische Plattenoberfläche
   1. Verwendung ein Stahls Löffel um sorgfältig zerlegen Sie das Unterteil der Inkubation auch von frischen und regeneriert elektronische Platte, die enthält aufgereiht gold Mikroelektroden. Tragen einen Kunststoff-Handschuh, sorgfältig Auswischen des Mikrochip-haltigen Teils von der elektronischen Platte mit Stahl Löffel.
   2. Legen Sie beide Teile in der Mitte des Glas-Objektträger und sammeln Sie die resultierenden Raman-Spektren von Raman-Mikroskop mit einem CCD-Detektor-²¹ausgestattet.
      Hinweis: Das Spektrometer war ausgestattet mit einem 633 nm-Laser und Spektren in einem Intervall von 30 s Laserbelichtung bei einer Wellenlänge im Bereich von 500-3500 cm^-1aufgenommen wurde. Die optische Bilder wurden mit einem 10-fach-Eye-Objektiv und 50 X Objektiv durch ein Raman-Mikroskop. Abbildung 1A und Abbildung 1 wurden auch erhalten mit der installierten Raman-Mikroskop-Apparat.
   3. Um die Lebensfähigkeit der angeschlossenen Zellen nach Anti-Krebs-Medikament Aufnahme auf die frische und regenerierten bewerten laser elektronische Platten, mit einem konfokalen Rastermikroskop um die spontane Fluoreszenz DOX Moleküle absorbiert A549 zu überwachen.
      1. Um die spontane Fluoreszenz absorbiert DOX durch die Zellen (frisch und regenerierten elektronische Platten mit A549 Zellen), Verwendung aufzuzeichnen Öl ein 63 X Objektiv und 485 nm als Anregung Wellenlänge.
2. Elektrochemische Verhalten von regenerierten Elektroden
   Hinweis: Manuelle Verstellung der kommerziellen elektronischen Platte schwierig und nicht ideal für die Beurteilung der Oberfläche elektrische Status als aktiviert ist, wurde die Regeneration Effizienz des Protokolls bewertet mit normalen Gold/glasig Kohlenstoffelektrode (GCE) als test Plattform für die elektrochemische Impedanz Spektroskopie (EIS) ausgeführt wurde. Der Durchmesser der Au Elektrode und GCE sind 3 mm. elektrochemische Daten wurden durch einen elektrochemischen Analyzer mit einem drei-Elektroden-System erhalten und die Impedanz-Messungen erfolgten mit Hilfe eines Wechselstrom (AC)-Signals von 10 mV Amplitude bei einer weiten Frequenzbereich von 100 kHz bis 0,01 Hz.
   1. Vor der Messung Polnisch Au Elektrode und GCE auf eine spiegelglatte Oberfläche mit einer Aluminiumoxid-Gülle auf ein Poliertuch, gefolgt von Beschallung im Wasser, keinerlei Partikel zu entfernen.
   2. Aktivieren Sie die Au-Elektrode in 0,5 M H₂SO₄. Erhalten Sie EIS-Daten der bloßen Au Elektrode und GCE in 10 mM KCl-Elektrolyt-Lösung mit 1mM K₃[Fe(CN)₆] beschriebenen²².
   3. A549 Zellen Stammlösung entsprechend 2.1.2 und 2.1.3 vorzubereiten. Fallen Sie 10 µL Zellsuspension auf der Oberfläche des Au-Elektrode und GCE. Inkubieren Sie Au Elektrode und GCE modifiziert mit Zellen in einem 37 ^oC Inkubator für 3 h EIS erhalten Daten der Au-Elektrode und GCE mit Zellen in 10 mM KCl-Elektrolyt-Lösung mit 1 mM K₃[Fe(CN)₆] geändert.
   4. Regenerieren Sie die Elektroden mit dem Protokoll und Maßnahme EIS.
      1. Tauchen Sie die Au-Elektrode und GCE modifiziert mit Zellen in 0,25 % Trypsin für 0,5-2 h. Au Elektrode und GCE sanft mit Wasser abspülen 4 Mal. Spülen Sie die Elektroden sanft mit absoluten Ethanol 4 Mal. Tauchen Sie Au Elektrode und GCE in 75 % Ethanol für ~ 5 min. Spülen die Chips sanft mit 75 % igem Ethanol 4 Mal.
      2. EIS-Daten des regenerierten Au Elektrode und GCE in 10 mM KCl-Elektrolyt-Lösung mit 1mM K₃[Fe(CN)₆] zu erhalten.

Ergebnisse

Oberflächeneigenschaften von gold Mikrochips: die Regeneration Verfahren in diesem Protokoll verwendeten waren in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 zeigt die mikroskopische Bilder von frischen Oberfläche und elektronische Platten, indem das optische Mikroskop regeneriert. Wie in Abbildung 2A und Abbildung 2, mikroskopische Beobacht...

Diskussion

Wir für Sie mehrere Methoden^{17,23,24,25,26} zum Regenerieren von Mikrochips in Tabelle 1zusammengefasst. Diese Methoden beteiligt grundsätzlich relativ harte Versuchsbedingungen, die vollständige Regeneration der Chips wegen der Anwesenheit von starken Molekül-Molekül Interaktionen wie derjenigen der immun Komplex verwendet für SPR-Chips ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Stock reagents	reconstitution	Concentration used	Storage
Apo-transferrin	10 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
N-acetyl cysteine	5 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Sodium selenite	2.5 mg/mL in H2O	1:25,000	-20°C
Collagen IV	200 μg/mL in PBS	1:100	-80°C
TGF-b2	20 μg/mL in PBS	1:10,000	-20°C
IL-34	100 μg/mL in PBS	1:1,000	-80°C
Ovine wool cholesterol	1.5 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparan sulfate	1 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Oleic acid/Gondoic acid	Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparin	50 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
Solutions	Recipe		Comments
Perfusion Buffer	50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)		Use when ice-cold
Douncing Buffer	200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++		Use when ice-cold
Panning Buffer	2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)	DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite		Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating	MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2		Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)	MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid		Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.