Rejenerasyon için gerçek zamanlı hücre Analyzer donatılmış dizilmiş altın Microelectrodes

Özet

Bu iletişim kuralı ticari dizilmiş altın microelectrodes ofmicrochip tabanlı yüksek çalışan maliyeti deneyleri tasarruf amaçlı bir hücre etiket ücretsiz analyzer için donatılmış yeniden oluşturmak için genel bir strateji açıklar. Rejenerasyon işlemi tripsin sindirim, etanol ve su ve mikroçip tekrarlanan kullanımı sağlar bir iplik adım ile durulama içerir.

Özet

Çünkü biyokimyasal çalışma deneysel hayvan kullanımını gerektirmez için etiket içermeyen hücre tabanlı tahlil avantajlıdır. Klasik biyokimyasal deneyleri daha hücreleri fizyolojik koşullar altında hakkında daha dinamik bilgi sağlamak yeteneği nedeniyle, elektrik empedans ilkesine dayanarak bu etiket ücretsiz gerçek zamanlı hücre tahlil geçmişte sırasında daha fazla ilgi topluyor on yıl. Ancak, onun pratik kullanımı nispeten pahalı maliyet pahalı sarf tek kullanımlık altın mikroçip hücre analyzer için kullanılan ölçü nedeniyle sınırlı olabilir. Bu protokol için bir ticari etiket içermeyen hücre analyzer için donatılmış dizilmiş altın microelectrodes yeniden oluşturmak için genel bir strateji geliştirdik. Rejenerasyon işlemi tripsin sindirim, etanol ve su ve bir iplik adım ile durulama içerir. Önerilen yöntem test edilmiş ve en az üç kez, yenilenme ve ticari elektronik plakaların tekrarlanan kullanımı için etkili olduğu gösterilmiştir hangi gerçek zamanlı hücre deneyleri yüksek çalışan maliyeti üzerinde Kaydet araştırmacılar yardımcı olacaktır.

Giriş

Sayesinde onun verimli ve daha az emek yoğun deneysel işlem, etiket içermeyen hücre tabanlı teknoloji proteomik^{1,2 açıdan gibi analitik hem de eleme amaçlı son on yılda hızlı büyüme tanıklık etmiş} , ilaç teslim³, vb^4,5 ile karşılaştırıldığında geleneksel biyokimyasal yöntemlerle hücre analizi, etiket ücretsiz gerçek zamanlı hücre tahlil Giaever ve arkadaşları tarafından daha önce geliştirilen prototip^{6 ile yönelik} elektrik sinyal değişiklikleri nicel bir şekilde sürekli ölçümü hücre büyümesini veya geçiş izni hücre bağlı mikroçip yüzeyinde kayıt prensibi temel alır. Bu stratejiyi, gerçek zamanlı hücre tanıttı^7,8 ve son zamanlarda bir ticari gerçek zamanlı hücre analyzer (RTCA) (RT-CES) sistem elektrik empedans tabanlı algılama ilkesini kullanarak oldu algılama elektronik başlatıldı Laboratuvar araştırma⁹için.

Ticari gerçek zamanlı hücre analyzer ağırlıklı olarak hangi inkübe hücre hücre çoğalması, geçiş, canlılığı, morfoloji ve bağlılık dahil fizyolojik değişiklikler sonucu hücre uyarılmış sinyalleri, elektrik empedans, okur. yüzey mikroçip^10,11. Böyle elektrik sinyalleri daha fazla hücre dizin (hücre durumu değerlendirmek için CI) adlı bir boyutsuz parametre Çözümleyicisi tarafından dönüştürülür. Empedans mikroçip değişikliği esas olarak kapalı hücre elektrot/çözüm arabirimi, yerel iyonik ortam yansıtır. Bu nedenle, hücre analyzer analitik performansını dayanır ağır çekirdek algılama birimi üzerinde dizilmiş altın microelectrodes kılan tek kullanımlık kristallerden mikroçipler (Yani, sözde elektronik plakaları, örneğin, 96/16/8-iyi), lithographically kuluçka kuyu dibinde basılmış. Altın microelectrodes daire-on-line biçiminde (şekil 1) birleştirin ve ekli hücreleri^{3,12,13 dinamik ve hassas tespiti için izin kuluçka Wells yüzey alanının en kapsayacak ,14}. CI çip hücrelerinin daha fazla yüzey kapsama alanı söz konusu olduğunda artırın ve hücre içinde apoptosis kaynaklanan bir toxicant maruz azaltın. Her ne kadar gerçek zamanlı hücre analyzer sitotoksisite¹¹ ve nörotoksisite¹⁵ belirlemek ve klasik bitiş noktaları yöntemi daha fazla Kinetik bilgi sağlamak için sık sık kullanılmıştır, tek kullanımlık elektronik costliest tabaklar tüketim maddesi.

Şimdiye kadar muhtemelen gerçeğini dahil^16,17, piranha çözüm veya Asetik asit gibi sert rejenerasyon koşulların olması nedeniyle olan elektronik plaka rejenerasyon için kullanılabilir hiçbir yöntem olmuştur. Hangi altın mikroçip elektrik durumunu değiştirebilir ¹⁸. Bu nedenle, hafif ve etkili bir yöntem yapışık hücreleri ve diğer maddeler altın chips yüzeyinden kaldırmak için elektronik plaka rejenerasyon işlemi için arzu olacak. Biz son zamanlarda aşındırıcı reaktifler kullanarak tek kullanımlık elektronik plakaları yenilenme amaçlı bir protokol geliştirdik ve rejenere cips elektrokimyasal yanı sıra optik yöntemleri¹⁹tarafından karakterize. Tripsin ve etanol gibi laboratuar kolayca kullanılabilir ve ılımlı reaktifler kullanarak, biz iki ana türü yeniden oluşturmak için başarıyla uygulanan ticari elektronik plaka olmadan yan etkiler, yeniden oluşturmak için genel bir yöntem kurduk Elektronik plaka (16 ve L8) kullanılan RTCA için.

Protokol

Not: genel olarak, tripsin sindirim ve etanol ve su ile durulama adım yenilenme süreci içerir. Sindirim zaman kullanılan hücre sayısına göre değişen ve türüne ve kullanılan hücre sayısına bağlı olarak deneysel amaçlar farklı olabilir. Rejenerasyon koşulları optimize etmek için optik ve elektrokimyasal yöntemleri kullanarak rejenere mikroçip kontrol etmelerini rica ederiz. Deney sırasında çözünür ve çözünmez kimyasallar tutulabilir ve burada bu iki tipik durumda bir yenilenme prosedürü ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

1. yenileme çözümleri hazırlanması

Not: Hazırlamak ve steril koşullarda tüm çözümleri ele.

1. Taze %0.25 (g/v) tripsin çözeltisi hazırlamak. Tripsin satın alınan ya da aşağıdaki gibi taze hazırlanmış.
   1. Tripsin pH 7.4 fosfat tamponlu tuz (PBS) 100 ml 0, 25 g geçiyoruz.
   2. Çözüm tripsin tam çözüm düşük hızda herhangi bir kabarcık oluşumunu önlemek için dikkat çekici 4 ^oC. heyecan eriyene kadar karıştırın.
   3. Çözüm Biyogüvenlik başlıklı 0,22 µm filtre ile filtre.
2. % 75 etanol mutlak etanol kullanarak hazırlayın. 75 mL mutlak etanol volumetric flask dökün ve birimin 100 mL ulaşıncaya kadar deiyonize su ekleyin. Daha fazla sterilizasyon gerçekleştirin.

2. kuluçka ve elektronik plakaları A549 hücrelerin çoğalması

Not: Elektronik plaka türleri 16 ve L8 her ikisi de lithographically kuluçka kuyu dibinde baskılı dizilmiş altın microelectrodes yapılır. Elektronik plaka L8 8 wells varken elektronik plaka 16 16 kuyu vardır. Elektronik plaka 16 kuyu yuvarlak yuvarlak köşeli dikdörtgenler olmakla birlikte elektronik plaka L8 kuyu. Her elektronik plaka 8 hacmi de yaklaşık 830 µL ve her elektronik plaka 16 de yaklaşık 270 µL.

1. A549 hücre kültürü
   1. Kültür A549 hücrelerin % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Enstitüsü-1640 orta (RPMI-1640) penisilin-streptomisin hücre kültüründe çanağı.
   2. Hücre yoğunluğu % ~ 75 ulaştığında hücreleri geçiş sonra yapisan hücre katmanı 1 × PBS ile yıkama ve % 0.25 tripsin çözüm için 1 dk 37 ^oC. santrifüj az ile hücreleri 179 × g tripsin kaldırmak 5 min için de trypsinize. 10 mL orta daha fazla kültür için hücrelerde veya diğer deneyler resuspend.
      Not: Orta resuspended hücre çözüm burada hücre süspansiyon arabellek belirlenmiştir.
   3. 10 µL almak ve bir hemasitometre kullanarak hücre saymak. RPMI-1640 orta daha fazla 30.000-80,000 hücre/mL hücre süspansiyon arabellek deneyler için hazırlamak için hücre süspansiyon arabellek sulandırmak için kullanın.
2. Nükleer silahların yayılmasına karşı/sitotoksisite deney ve veri alma
   1. 50 µL (elektronik plaka L8 için 150 µL) hücre orta her kuluçka de, bunun için 30 dk içinde Biyogüvenlik hood için denge elektronik plaka 16 ve bırakın ekleyin. El ile eklemek elektronik plaka 16 CO₂ kuluçka 37 ^oC., gerçek zamanlı hücre Çözümleyicisindeki
   2. Gerçek zamanlı hücre analyzer işlem programı bilgisayarda başlatın. Desen kurulum sayfası varsayılan deneme, "deney modeli" seçin ve çalışan tahlil adlandırın.
   3. Onun düzen sayfasında denemeye dahil edilen ve düzenleme kutularına hücre türü, sayısı ve uyuşturucu adları gibi bilgileri Giriş karşılık gelen kuyuları seçin. Program sayfasında, deneysel adımlar ekleyin, sonra (örneğin, 12, 24 veya 48 s) çalışma süresi, her adım ve gerçek zamanlı veri toplama aralığını seçin.
      Not: Adım 1 ve 2 Aralık burada 1 dk ve 15 dk sonra.
   4. Dosyayı kaydedin ve medya onun hücre dizin sayfasında arka plan empedans ölçmek için "Başlat" düğmesini tıklatın; Sonuçta elde edilen veriler otomatik olarak düşülen. Onun iyi grafik sayfasında, tüm iyi eğrileri ziyaret edilebilir. Wells ve zaman-hücre dizin grafik gösterdi onun arsa sayfasında ekleyin.
   5. Hücre çoğalması deneme için öncelikle programı duraklatmak için "Ara" düğmesini tıklatın. O zaman elektronik tabak alıp iyi başına 100 µL A549 hücre süspansiyon arabellek oda sıcaklığında ekleyin. 30 dk plaka Biyogüvenlik hood kuluçka kuyu dibine yerleşmek hücreleri izin için bırakın.
   6. El ile eklemek elektronik plaka gerçek zamanlı hücre analyzer qurğu. Deney devam etmek için "Başlat" düğmesini tıklatın.
      Not: çizim sayfasında Çözümleyicisi sürekli hücre dizin değerlerini veya eğrileri boyunca deneme kaydeder.
   7. Deneme tamamlandığında, çizim sayfasına girin ve deneme dosyasını açın. Sonra test kuluçka wells ve ortalama veya ilaç ilaçlar ekleme veya değiştirme deneyleri arasında farklılıklar azaltmak için orta önce en son ne zaman için normalleştirilmiş elde edilen hücre dizin eğrileri seçin. Veri analiz sayfasında EC50 veya IC50 hesaplanabilir

3. elektronik plakaların rejenerasyon

Not: durulama her adım için elektronik plaka çözümde iyice karışık oldu (5 - 10 kez) kullanarak bir pipet.

1. Durum 1: anti sitotoksisite değerlendirilmesi için-kanser ilacı
   1. Tohum A549 hücreler 2 bölümünde açıklandığı gibi elektronik tabakta.
   2. Hücre orta anti-kanser ilacı doksorubisin hidroklorür (DOX) ilk geçiyoruz. Yavaş yavaş DOX (son DOX bölgedir 30 µg/mL) hücrelere ekleme bir pipet kullanarak. CI 2 bölümünde açıklandığı gibi kaydedin.
      Not: kullanılan elektronik plaka hemen deneme tam oldu sonra yeniden. Bu durumda, DOX çözünür bir kimyasal olduğu gibi elektronik plaka protokol sonrası rejenerasyon nispeten kolay ve hiçbir ek işlem gereklidir.
   3. Yeniden oluşturma işlemi
      1. Gerçek zamanlı hücre analyzer istasyonundan hücreleri içeren elektronik plaka çıkarmak. Oda sıcaklığında bir steril Biyogüvenlik hood kullanılan elektronik tabak yerleştirin ve kültür iyice bir pipet kullanarak orta karıştırın. Tüm Orta pipet.
      2. İçin oda sıcaklığında 3 kere elektronik plakaları 200 µL deiyonize suyla durulayın.
      3. 1-2 h (200 µL/de) 37 ^oC. adlı bir kuluçka için taze hazırlanan % 0.25 tripsin ile elektronik Tabaklarda kalan hücreleri sindirmek Sindirim tamamlandığında, Biyogüvenlik başlıklı oda sıcaklığında 5 - 10 kat bir pipet ve pipet tüm çözüm kullanarak kuluçka çözüm mix.
      4. Elektronik plakaları 200 µL etanol ve 200 µL su ile durulama sırasıyla, aşağıdaki gibi: deiyonize su 2 kez, % 100 etanol 2 kez; % 75 etanol 2 kez; su 2 kez deiyonize. Steril gazlı bez veya kağıt mendil kalan su oda sıcaklığında dikkatle boşaltmak için elektronik tabağa ters çevir.
      5. Ultraviyole sterilize etmek için 1-2 h Biyogüvenlik başlıklı oda sıcaklığında rejenere elektronik levha.
         Not: elektronik plaka L8 rejenerasyon için tüm çözümler hacmi iki katına.
2. Durum 2: ilaç dağıtım mesoporous malzeme kullanarak.
   1. 5.6 bir ortalama gözenek büyüklüğü ile çubuk benzeri mesoporous silis malzeme kullanımı olarak ilaç teslim matrisler, daha önce bildirilen²⁰nm.
      Not: Burada, hücreleri uyuşturucu-yayın etkisi izlemek için elektronik plaka istihdam edildi.
      1. Mesoporous malzemeleri her şey elektronik plakaların kuluçka çözüm içine ekleyin. Silis malzeme çözünür ve elektronik plaka acele değildir olarak plaka aşağıdaki gibi durulama:
   2. Adımları 3.1.3.1-3.1.3.3 durum 1 için açıklandığı gibi gerçekleştirin.
   3. Kristallerden mikroçipler 200 µL deiyonize su ile bir kez Biyogüvenlik başlıklı oda sıcaklığında durulayın.
   4. Kristallerden mikroçipler 200 µL mutlak etanol ile oda sıcaklığında 2 kere yıkayın.
   5. Kristallerden mikroçipler 200 µL % 75 etanol ile bir kez oda sıcaklığında durulayın.
   6. 250 µL % 75 etanol her kuyuya ekleyin ve oda sıcaklığında mühürleme film ile elektronik plaka mühür.
   7. 114 x g 2 min için de spin ve elektronik plaka boş. Steril gazlı bez veya kağıt mendil kalan su oda sıcaklığında dikkatle boşaltmak için elektronik tabağa ters çevir.
   8. Adım 3.2.5-3.2.7 bir kez yinelenir.
   9. Ultraviyole sterilize etmek için 1-2 h Biyogüvenlik başlıklı oda sıcaklığında rejenere elektronik levha.
      Not: elektronik L8 tabak durulama zaman tüm çözüm hacmi iki katına.

4. rejenerasyon etkisi değerlendirilmesi

1. Rejenere elektronik plaka yüzey optik özellikleri
   1. Bir çelik de taze, kuluçka alt kısmı dikkatlice sökmeye kaşık ve içeren elektronik plaka yeniden kullanım altın microelectrodes gelemiyor. Plastik eldiven giyiyor, dikkatle çelik kaşık kullanarak elektronik plaka mikroçip içeren bölümünü silin.
   2. Her iki parça cam mikroskop slaytlar merkezinde yer ve Raman mikroskobu ile CCD dedektörü²¹donatılmış tarafından elde edilen Raman spectra toplamak.
      Not: Spektrometre 633 nm lazer ile donatılmıştı ve spectra 500-3500 cm^-1aralığında bir dalga boyu, 30 s lazer maruz kalma bir aralıkta kaydedildi. Optik görüntüleri 10 x gözü lens ve 50 x amacı istimal Raman mikroskobu tarafından elde edilmiştir. Şekil 1A ve şekil 1 c de yüklü Raman mikroskobu cihazları kullanarak elde edilmiştir.
   3. Anti-kanser ilacı alımını taze ve rejenere sonra ekli hücre canlılığı değerlendirmek için elektronik Kaplamalar, kullan bir confocal DOX molekülleri A549 tarafından absorbe spontan Floresans izlemek için tarama mikroskop lazer.
      1. Absorbe DOX spontan floresan hücreleri (taze ve rejenere elektronik pilakalar ve A549 hücreleri), kullanarak kaydetmek için bir 63 X objektif ve 485 nm uyarma dalga boyu petrol.
2. Rejenere elektrot elektrokimyasal davranışları
   Not: el ile bir ticari elektronik tabak dissembling zor ve ideal yüzey elektrik durum değerlendirilmesi için kontrol gibi olduğundan, protokolünün yenilenme etkinliği bir test olarak normal altın/cam gibi karbon elektrot (GCE) kullanılarak değerlendirilmiştir platform, elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EIS) gerçekleştirildiği. Au elektrot ve GCE çapları 3 mm. elektrokimyasal veri üç elektrot sistemi ile bir elektrokimyasal analyzer tarafından elde edilen ve 10 mV genlik alternatif akım (AC) sinyalinin kullanarak empedans ölçümleri yapılmıştır olan bir 0.01 Hz için 100 kHz frekans aralığı.
   1. Ölçüm önce Lehçe Au elektrot ve GCE sonication su herhangi bir parçacıkları kaldırmak için ardından bir polisaj bez bir ayna gibi yüzeye bir Alümina Bulamaç ile için.
   2. ÖYLESİNE Au elektrot 0,5 M H₂harekete geçirmek₄. Çıplak Au elektrot ve GCE EIS verilerde 10 mM 1 mM K₃[Fe(CN)₆] içeren KCl elektrolit çözüm açıklanan²²edinin.
   3. Hisse senedi A549 hücre çözümü 2.1.2 ve 2.1.3 göre hazırlayın. 10 µL hücre süspansiyon GCE ve Au elektrot yüzeyinde bırak. Au elektrot ve hücreleri bir 37 ^oC kuluçka 3 h. EIS elde veri Au elektrot için modifiye GCE ve 10 mM KCl elektrolit çözüm 1 mM K₃[Fe(CN)₆] içeren hücrelerde modifiye GCE kuluçkaya.
   4. Elektrotlar Protokolü ve ölçü EIS kullanılarak yeniden.
      1. Au elektrot bırakın ve GCE değiştirilmiş hücreler ile 0,5-%2 0.25 tripsin içinde h. durulama Au elektrot ve GCE yumuşak su ile 4 kez. Elektrotlar usulca mutlak etanol ile 4 kez yıkayın. Au elektrot buğulanırsa ve % 75 etanol ~ 5 dakika süreyle GCE 4 kez % 75 etanol usulca çiplerle durulayın.
      2. Rejenere Au elektrot ve GCE EIS verilerde 1 mM K₃[Fe(CN)₆] içeren 10 mM KCl elektrolit çözüm edinin.

Sonuçlar

Altın mikroçip yüzey özellikleri: Bu protokol için kullanılan rejenerasyon yordamlar şekil 1' de özetlenen. Şekil 2 mikroskobik yüzey taze resimlerini ve elektronik plakaları optik mikroskop tarafından yeniden gösterir. Şekil 2A ve şekil 2C, mikroskobik gözlemler olduğunu hemen hemen ima etti gösterildiği gibi mikro?...

Tartışmalar

Biz mikroçip Tablo 1' deki yeniden oluşturulması için çeşitli kullanılabilir yöntemleri^{17,23,24,25,26} özetlenebilir. Temel olarak, bu yöntemleri cips komple yenilenme güçlü molekül molekül immün kompleks SPR yongaları için kullanılan bu gibi etkileşimleri varlığı nedeniyle elde etmek için nispeten sert deneysel koşulla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Stock reagents	reconstitution	Concentration used	Storage
Apo-transferrin	10 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
N-acetyl cysteine	5 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Sodium selenite	2.5 mg/mL in H2O	1:25,000	-20°C
Collagen IV	200 μg/mL in PBS	1:100	-80°C
TGF-b2	20 μg/mL in PBS	1:10,000	-20°C
IL-34	100 μg/mL in PBS	1:1,000	-80°C
Ovine wool cholesterol	1.5 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparan sulfate	1 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Oleic acid/Gondoic acid	Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparin	50 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
Solutions	Recipe		Comments
Perfusion Buffer	50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)		Use when ice-cold
Douncing Buffer	200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++		Use when ice-cold
Panning Buffer	2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)	DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite		Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating	MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2		Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)	MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid		Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.