Rigenerazione di microelettrodi oro allinearono attrezzata per un analizzatore in tempo reale delle cellule

Riepilogo

Questo protocollo descrive una strategia generale per rigenerare microelettrodi oro allinearono commerciali attrezzati per un analizzatore cellulare privo di etichetta finalizzato al risparmio sull'alta analisi di ofmicrochip-based di costi in esecuzione. Il processo di rigenerazione include digestione della tripsina, risciacquo con acqua ed etanolo e un passo di filatura, che consente l'utilizzo ripetuto di microchip.

Abstract

Il dosaggio di basati su cellule privo di etichetta è vantaggioso per lo studio biochimico a causa di esso non richiede l'uso di animali da esperimento. Grazie alla sua capacità di fornire informazioni più dinamici sulle celle in condizioni fisiologiche più classiche analisi biochimiche, questo saggio di cellulare privo di etichetta in tempo reale sulla base del principio di impedenza elettrica sta attirando l'attenzione di più nel corso degli ultimi decennio. Tuttavia, la sua utilizzazione pratica può essere limitata a causa del costo relativamente costoso di misura, in cui vengono utilizzati microchip oro monouso consumabile costosa per l'analizzatore di cella. In questo protocollo, abbiamo sviluppato una strategia generale per rigenerare allinearono microelettrodi oro attrezzati per un analizzatore cellulare privo di etichetta commerciale. Il processo di rigenerazione include digestione della tripsina, risciacquo con acqua ed etanolo e un passo di filatura. Il metodo proposto è stato testato e dimostrato di essere efficace per la rigenerazione e l'uso ripetuto di piastre elettroniche commerciali almeno tre volte, che aiuterà i ricercatori Risparmia sull'alto costo in esecuzione di analisi in tempo reale delle cellule.

Introduzione

Grazie alla sua efficiente e meno laborioso processo sperimentale, tecnologia privo di etichetta cell-based ha assistito a rapida crescita nell'ultimo decennio per scopi analitici, nonché lo screening come sotto l'aspetto della proteomica^1,2 , droga consegna³, ecc.^4,5 confronto con metodi biochimici tradizionali finalizzato all'analisi di cellule, analisi delle cellule privo di etichetta in tempo reale con il prototipo sviluppato da Giaever e colleghe precedentemente⁶ si basa sul principio della registrazione delle modifiche di segnale elettrico sulla superficie della cella associata microchip, che consentono una misurazione continua della crescita delle cellule o la migrazione in maniera quantitativa. Seguendo questa strategia, è stato lanciato un cellulare in tempo reale (RT-CES) sistema utilizzando il principio di rilevamento basati su impedenza elettrica è stato introdotto^7,8 e, più recentemente, un analizzatore di commerciale in tempo reale delle cellule (RTCA) di rilevamento elettronico per laboratorio ricerca⁹.

L'analizzatore di cellulare in tempo reale delle imprese principalmente legge segnali evocati delle cellule di impedenza elettrica, che derivano da cambiamenti fisiologici delle cellule incubate tra cui proliferazione, migrazione, vitalità, morfologia e aderenza sul superficie di microchip^10,11. Tali segnali elettrici sono ulteriormente convertiti dall'analizzatore in un parametro adimensionale chiamato l'indice di cella (IC) per valutare lo stato delle cellule. La variazione dell'impedenza di microchip riflette principalmente l'ambiente ionico locale delle cellule coperte all'interfaccia elettrodo/soluzione. Di conseguenza, le prestazioni analitiche dell'analizzatore delle cellule si basa principalmente sull'unità di rilevamento di nucleo, i microchip usa e getta (cioè, cosiddetti piastre elettroniche, ad esempio, 96/16/8 pozzetti), che sono fatti di microelettrodi oro disposti litograficamente stampato in fondo dei pozzetti di incubazione. L'oro microelettrodi assemblare in un cerchio-su-linea formato (Figura 1) e coprono la maggior parte della superficie dei pozzetti di incubazione, che consentire il rilevamento dinamico e sensibile di cellule allegate^{3,12,13 ,14}. CI sarà nel caso di copertura più superficiale delle cellule sul chip, quando aumentano e diminuiscono le cellule sono esposte a un tossico conseguente apoptosi. Anche se l'analizzatore in tempo reale delle cellule è stato spesso utilizzato per determinare la citotossicit๹ e neurotossicità¹⁵ e fornire più informazioni cinetiche di metodo classico endpoint, le piastre elettroniche usa e gettare sono il più costoso materiale di consumo.

Fino ad ora, non ci sono stati nessun metodi disponibili per la rigenerazione della piastra elettronica, che è probabilmente dovuto al fatto che condizioni di rigenerazione dura, come soluzione piranha o acido acetico sono coinvolti^{16,17, 18}, che possono alterare lo stato elettrico di microchip oro. Di conseguenza, un metodo delicato ed efficace per rimuovere le celle aderenti e altre sostanze dalla superficie di gettoni d'oro sarà desiderabile per il processo di rigenerazione di piastra elettronica. Recentemente abbiamo sviluppato un protocollo volto alla rigenerazione delle piastre elettroniche monouso utilizzando reagenti non corrosivo e i chip rigenerati sono stati caratterizzati da metodi elettrochimici come pure ottico¹⁹. Utilizzando i reagenti di laboratorio prontamente disponibili e moderata tra cui tripsina ed etanolo, abbiamo stabilito un metodo generale per rigenerare la piastra elettronica commerciale senza effetti negativi, che è applicata con successo per rigenerare i due tipi principali della piastra elettronica (16 e L8) utilizzato per RTCA.

Protocollo

Nota: In generale, il processo di rigenerazione include digestione della tripsina e passaggio di risciacquo con acqua ed etanolo. Il tempo di digestione cambia in base al numero di celle utilizzate, e il tipo e il numero di celle utilizzate possono differire a seconda gli scopi sperimentali. Si consiglia di controllare i microchip rigenerati utilizzando metodi ottici ed elettrochimici per ottimizzare le condizioni di rigenerazione. Durante l'esperimento, sostanze chimiche solubili e insolubili possono essere coinvolti, e qui questi due casi tipici delle procedure di rigenerazione sono dettagliati.

1. preparazione delle soluzioni di rigenerazione

Nota: Preparare e gestire tutte le soluzioni in condizioni sterili.

1. Preparare la soluzione di tripsina fresca 0,25% (g/v). Tripsina possa essere acquistata o preparata come segue.
   1. Sciogliere 0,25 g di tripsina in 100 mL di soluzione tampone fosfato pH 7.4 (PBS).
   2. Mescolare la soluzione fino a quando la tripsina è completamente dissolto a 4 ^oC. mescolare la soluzione a bassa velocità avendo cura di evitare qualsiasi formazione di bolle.
   3. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 µm nella cappa di biosicurezza.
2. Preparare 75% etanolo usando etanolo assoluto. Versare 75 mL di etanolo assoluto in un matraccio tarato e aggiungere acqua deionizzata fino a quando il volume raggiunge 100 mL. Se necessario, eseguire ulteriore sterilizzazione.

2. incubazione e proliferazione delle cellule A549 in piastre elettroniche

Nota: Tipi di piastre elettroniche 16 e L8 sono entrambi realizzati di serie oro microelettrodi litograficamente stampati nella parte inferiore dei pozzetti di incubazione. Piastra elettronica 16 ha 16 pozzetti mentre piastra elettronica L8 ha 8 pozzetti. I pozzetti della piastra elettronica 16 sono rotondi mentre i pozzetti della piastra elettronica L8 sono rettangoli arrotondati. Il volume di ogni piastra elettronica 8 è ben µ l circa 830 e ciascuna piastra elettronica 16 è ben circa 270 µ l.

1. Coltura delle cellule A549
   1. Piatto di penicillina-streptomicina in coltura delle cellule cellule A549 cultura in Roswell Park Memorial Institute-1640 supplementato (RPMI-1640) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1%.
   2. Le cellule del passaggio quando la densità delle cellule raggiunge ~ 75% poi lavare lo strato delle cellule aderenti con 1 × PBS e tripsinizzano con soluzione di tripsina 0.25% per 1 min a 37 ^oC. Centrifugare le cellule a 179 × g per 5 min rimuovere tripsina. Risospendere le cellule in 10 mL di terreno per ulteriore cultura o altri esperimenti.
      Nota: La soluzione delle cellule risospese nel medium qui è designata come il buffer di sospensione cellulare.
   3. Prendere 10 µ l e contare il numero di cellulare utilizzando un emocitometro. Utilizzare il medium RPMI-1640 per diluire ulteriormente il buffer di sospensione cellulare per preparare 30.000-80.000 cellule/mL di tampone per sospensione cellulare per gli esperimenti.
2. Proliferazione/citotossicità esperimento e acquisizione dati
   1. Aggiungere 50 µ l (150 µ l per piastra elettronica L8) cella supporto allo ciascuna incubazione bene della piastra elettronica 16 e lasciare per 30 minuti per la biosicurezza cappa di equilibramento. Inserire manualmente la piastra elettronica 16 nell'analizzatore in tempo reale delle cellule nell'incubatore CO₂ a 37 ^oC.
   2. Lanciare il programma di funzionamento in tempo reale delle cellule analyzer sul computer. Il suo default sperimentare pagina di configurazione del modello, selezionare "Esperimento modello" e denominare il test in esecuzione.
   3. Sulla sua pagina di Layout, selezionare il corrispondenti pozzi che sono inclusi nell'esperimento e inserire le informazioni come i nomi delle celle di tipo, numero e droga nelle caselle di modifica. Sulla sua pagina di pianificazione, aggiungere la procedura sperimentale, quindi selezionare il tempo di esecuzione (ad es., 12, 24 o 48 ore) di ogni passaggio e intervallo di acquisizione dati in tempo reale.
      Nota: Qui, l'intervallo di step 1 e 2 sono 1 min e 15 min in seguito.
   4. Salvare il file e fare clic sul pulsante "Start" per misurare l'impedenza di sfondo dei media sulla sua pagina di indice della cella; i dati risultanti verranno automaticamente sottratti. Sulla sua pagina di ben grafico, tutte le curve bene possono essere visitate. Sulla sua pagina di trama, aggiungere pozzi e il grafico dell'indice di tempo-cella sarà mostrati.
   5. Per l'esperimento di proliferazione delle cellule, in primo luogo fare clic sul pulsante "Pausa" per interrompere il programma. Poi prendere la piastra elettronica e aggiungere 100 µ l tampone di sospensioni di cellule A549 per pozzetto a temperatura ambiente. Lasciare la piastra per 30 min nella cappa di biosicurezza per lasciare che le celle si depositano sul fondo dei pozzetti di incubazione.
   6. Inserire manualmente la piastra elettronica nella stazione di analizzatore di cellulare in tempo reale. Fare clic sul pulsante "Start" per continuare l'esperimento.
      Nota: Nella pagina trama, l'analizzatore registra continuamente i valori di indice della cella o curve in tutto l'esperimento.
   7. Quando l'esperimento è completa, accedere alla pagina di trama e aprire il file di esperimento. Quindi selezionare tutti i pozzetti di incubazione testati e le curve di indice della cella risultante che possono essere una media o normalizzate per l'ultima volta prima di aggiungere le droghe farmaceutiche o cambiare mezzo per ridurre le variazioni tra i test. Nella pagina analisi dei dati, può essere calcolata EC50 o IC50

3. rigenerazione di piastre elettroniche

Nota: Per ogni fase di risciacquo, la soluzione della piastra elettronica è stata mescolata accuratamente (5 - 10 volte) usando una pipetta.

1. Caso 1: per la valutazione di citotossicità della anti -droga di cancro
   1. Cellule A549 seme sulla piastra elettronica come descritto nella sezione 2.
   2. Sciogliere il farmaco anti-cancro di doxorubicina cloridrato (DOX) in medium delle cellule in primo luogo. Aggiungere lentamente DOX per le cellule (concentrazione finale di DOX è 30 µ g/mL) usando una pipetta. Registrare il CI come descritto nella sezione 2.
      Nota: La piastra elettronica utilizzata è stata rigenerata immediatamente dopo l'esperimento è stato completo. In questo caso, come DOX è una sostanza chimica solubile, la rigenerazione della piastra elettronica seguendo il protocollo è relativamente facile da gestire e passaggi aggiuntivi non sono necessari.
   3. Rigenerazione
      1. Prendere la piastra elettronica contenente cellule dalla stazione analizzatore in tempo reale delle cellule. Posizionare la piastra elettronica usata in una cappa di biosicurezza sterile a temperatura ambiente e mescolare accuratamente con una pipetta di coltura. Pipettare fuori tutti i media.
      2. Sciacquare le piastre elettroniche con acqua deionizzata µ l 200 per 3 volte a temperatura ambiente.
      3. Digerire le cellule restanti sulle piastre elettroniche con tripsina 0,25% preparata per 1-2 h (200 µ l/pozzetto) in un incubatore a 37 ^oC. Una volta ultimata la digestione, miscelare la soluzione di incubazione 5 - 10 volte utilizzando una pipetta e pipetta fuori tutta la soluzione nella cappa di biosicurezza a temperatura ambiente.
      4. Sciacquare le piastre elettroniche con 200 µ l etanolo e 200 µ l acqua, rispettivamente, come segue: acqua deionizzata 2 volte, 100% etanolo 2 volte; 75% etanolo 2 volte; acqua deionizzata 2 volte. Capovolgere la piastra elettronica su una garza sterile o carta velina per decantare l'acqua a temperatura ambiente.
      5. Raggi ultravioletti sterilizzare la piastra elettronica rigenerata per 1-2 h della cappa di sicurezza biologica a temperatura ambiente.
         Nota: Doppio del volume di tutte le soluzioni per la rigenerazione della piastra elettronica L8.
2. Caso 2: somministrazione di farmaci utilizzando materiali mesoporosi.
   1. Utilizzare materiali di silice mesoporosa asta-come con una dimensione media dei pori di 5,6 nm come matrici di consegna di droga, come precedentemente segnalato²⁰.
      Nota: Qui, la piastra elettronica è stata impiegata per monitorare l'effetto di rilascio di farmaci sulle cellule.
      1. Aggiungere materiali mesoporosi nella soluzione di incubazione dei pozzetti delle piastre elettroniche. Come materiali di silice non sono solubili e precipitato nella piastra elettronica, risciacquare la piastra come segue:
   2. Eseguire passaggi 3.1.3.1-3.1.3.3 come descritto per il caso 1.
   3. Sciacquare una volta il microchip con acqua deionizzata µ l 200 nella cappa di biosicurezza a temperatura ambiente.
   4. Sciacquare i microchip con etanolo assoluto di 200 µ l 2 volte a temperatura ambiente.
   5. Sciacquare una volta il microchip con etanolo di 75% 200 µ l a temperatura ambiente.
   6. Aggiungere 250 µ l di etanolo al 75% in ciascun pozzetto e sigillare la piastra elettronica con la pellicola sigillante a temperatura ambiente.
   7. Spin a 114 x g per 2 minuti e svuotare la piastra elettronica. Capovolgere la piastra elettronica su una garza sterile o carta velina per decantare l'acqua a temperatura ambiente.
   8. Ripetere il passaggio 3.2.5-3.2.7 una volta.
   9. Raggi ultravioletti sterilizzare la piastra elettronica rigenerata per 1-2 h della cappa di sicurezza biologica a temperatura ambiente.
      Nota: Doppio del volume di tutta la soluzione durante il risciacquo L8 piastre elettroniche.

4. valutazione dell'effetto di rigenerazione

1. Caratteristiche ottiche della superficie della piastra elettronica rigenerata
   1. Uso un acciaio cucchiaio per smontare accuratamente la parte inferiore dell'incubazione bene di fresca e rigenerata piastra elettronica contenente schierati oro microelettrodi. Indossando un guanto di plastica, accuratamente spazzare il microchip contenente parte dalla piastra elettronica utilizzando il cucchiaio d'acciaio.
   2. Posizionare entrambe le parti al centro dei vetrini di microscopio e raccogliere gli spettri Raman risultanti da microscopio Raman, dotata di un CCD rivelatore²¹.
      Nota: Lo spettrometro è stato dotato di un laser a 633 nm e gli spettri è stata registrata ad intervalli di 30 s esposizione laser alla lunghezza d'onda nel range di 500-3500 cm^-1. Immagini ottiche sono state ottenute da un microscopio Raman utilizzando una lente di occhio di 10x e obiettivo x 50. Figura 1A e Figura 1 sono stati ottenuti anche utilizzando l'apparato di microscopio Raman installato.
   3. Per valutare la vitalità delle cellule allegate dopo l'assorbimento del farmaco anti-cancro sulla fresca e rigenerata piastre elettroniche, usare un confocale laser microscopio a scansione per monitorare la fluorescenza spontanea delle molecole DOX assorbite dalle cellule A549.
      1. Per registrare la fluorescenza spontanea di DOX assorbita mediante l'uso di cellule (fresca e rigenerata piastre elettroniche con cellule A549), un 63 X olio oggettivo e 485 nm di lunghezza d'onda di eccitazione.
2. Comportamenti elettrochimici di elettrodi rigenerati
   Nota: Come dissimulante manuale di una piastra commerciale elettronica è difficile e non è l'ideale per la valutazione dello stato elettrico superficiale come controllato, l'efficienza di rigenerazione del protocollo è stata valutata mediante elettrodo a carbone vetroso/oro normale (GCE) come test piattaforma, su cui è stata eseguita la spettroscopia di impedenza elettrochimica (EIS). I diametri dell'elettrodo Au e GCE entrambi sono 3mm. elettrochimica dei dati sono stati ottenuti da un analizzatore elettrochimico con un sistema a tre elettrodi e le misure di impedenza sono state effettuate utilizzando un segnale di corrente alternata (AC) di ampiezza di mV 10 a un gamma di frequenza larga di 100 kHz a 0,01 Hz.
   1. Prima della misurazione, lucidare l'Au elettrodo e GCE a una superficie a specchio con un impasto di allumina su un panno di lucidatura, seguita da sonicazione in acqua per rimuovere eventuali particelle.
   2. Attivare l'elettrodo Au in 0,5 M H₂così₄. Ottenere dati EIS dell'elettrodo di Au e GCE nuda in 10 mM di soluzione elettrolitica di KCl contenente 1mm K₃[Fe(CN)₆] come descritto²².
   3. Preparare soluzione stock di cellule A549 secondo 2.1.2 e 2.1.3. Goccia sospensione di cellule 10 µ l sulla superficie dell'elettrodo di Au e GCE. Incubare Au elettrodo e GCE modificati con le cellule in un'incubatrice di C ^o37 per 3 h. dati EIS ottenere dell'elettrodo Au e GCE modificati con cellule in 10mm soluzione elettrolitica di KCl contenente 1mm K₃[Fe(CN)₆].
   4. Rigenerare gli elettrodi utilizzando il protocollo e la misura EIS.
      1. Immergere l'elettrodo di Au e GCE modificati con cellule in tripsina 0,25% per 0,5-2 h. Risciacquare l'elettrodo di Au e GCE dolcemente con acqua 4 volte. Sciacquare gli elettrodi dolcemente con etanolo assoluto 4 volte. Immergere l'elettrodo di Au e GCE in etanolo di 75% per un minimo di ~ 5 risciacquare i chip dolcemente con etanolo 75% 4 volte.
      2. Ottenere dati EIS rigenerata Au elettrodo e GCE in 10mm KCl elettrolita soluzione contenente 1mm K₃[Fe(CN)₆].

Risultati

Proprietà della superficie di oro microchip: le procedure di rigenerazione utilizzate nel presente protocollo sono state delineate nella Figura 1. La figura 2 Mostra il microscopico immagini di fresco in superficie e rigenerata piastre elettroniche dal microscopio ottico. Come mostrato in Figura 2A e Figura 2, al microscopio le osserv...

Discussione

Abbiamo riassunto diversi metodi disponibili^{17,23,24,25,26} per la rigenerazione di microchip nella tabella 1. Fondamentalmente, questi metodi coinvolti relativamente dure condizioni sperimentali per ottenere la completa rigenerazione dei chip a causa della presenza di interazioni molecola-molecola forte come quello del complesso immune per SPR...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Stock reagents	reconstitution	Concentration used	Storage
Apo-transferrin	10 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
N-acetyl cysteine	5 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Sodium selenite	2.5 mg/mL in H2O	1:25,000	-20°C
Collagen IV	200 μg/mL in PBS	1:100	-80°C
TGF-b2	20 μg/mL in PBS	1:10,000	-20°C
IL-34	100 μg/mL in PBS	1:1,000	-80°C
Ovine wool cholesterol	1.5 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparan sulfate	1 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Oleic acid/Gondoic acid	Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparin	50 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
Solutions	Recipe		Comments
Perfusion Buffer	50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)		Use when ice-cold
Douncing Buffer	200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++		Use when ice-cold
Panning Buffer	2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)	DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite		Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating	MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2		Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)	MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid		Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.