Régénération des microélectrodes or rangés, équipé d’un analyseur de cellule en temps réel

Résumé

Ce protocole décrit une stratégie générale pour régénérer des microélectrodes or déployèrent commerciales équipés pour un analyseur de cellules libres étiquette visant à économiser sur les haute marche frais ofmicrochip analyses. Le processus de régénération comprend la digestion trypsique, lavage à l’éthanol et l’eau et une étape de filature, ce qui permet une utilisation répétée des micropuces.

Résumé

Le test de base de cellules exempt d’étiquette est avantageux pour étude biochimique à cause de cela ne nécessite pas l’utilisation des animaux d’expérimentation. En raison de sa capacité à fournir des informations plus dynamiques sur les cellules dans des conditions physiologiques que les tests biochimiques classiques, cette analyse de cellules exempt d’étiquette en temps réel basée sur le principe de l’impédance électrique est d’attirer plus d’attention au cours des dernières décennie. Toutefois, son utilisation pratique peut être limitée en raison du coût relativement coûteux de la mesure, où coûteux consommables jetables or micropuces sont utilisés pour l’analyseur de la cellule. Dans ce protocole, nous avons développé une stratégie générale pour régénérer déployèrent microélectrodes or équipés d’un analyseur de commercial cellule exempte d’étiquette. Le processus de régénération comprend la digestion trypsique, lavage à l’éthanol et l’eau et une étape de filature. La méthode proposée a été testée et démontrée son efficacité pour la régénération et l’utilisation répétée des plaques électroniques commerciaux au moins trois fois, qui aidera les chercheurs enregistrer sur la cherté en cours d’exécution des essais sur des cellules en temps réel.

Introduction

Grâce à son efficace et moins fastidieux processus d’expérimentation, technologie exempte d’étiquette sur les cellules a connu une croissance rapide ces dix dernières années à des fins analytiques ainsi que la projection comme dans l’aspect de la protéomique^1,2 , livraison³, etc.^4,5 comparé avec des méthodes biochimiques traditionnelles visant à l’analyse cellulaire, analyse de cellules libres étiquette en temps réel avec le prototype développé par Giaever et collaborateurs précédemment^{6 de drogue} est basé sur le principe de l’enregistrement des modifications du signal électrique sur la surface de la cellule-attachée puces électroniques, qui permettent une mesure continue de la croissance cellulaire ou de migration de manière quantitative. Suite à cette stratégie, une cellule en temps réel (RT-CES) système utilisant le principe de détection impédance électrique était introduite^7,8 et, plus récemment, un analyseur commercial cellule en temps réel (RTCA) de détection électronique a été lancée laboratoire de recherche⁹.

L’analyseur de la cellule en temps réel commercial principalement lit les signaux évoqués LiPo de l’impédance électrique, entraînant des changements physiologiques des cellules couvés, y compris la prolifération cellulaire, migration, viabilité, la morphologie et l’adhérence sur le surface de micropuces^10,11. Ces signaux électriques est également convertis par l’analyseur dans un paramètre sans dimension nommé la cellule Index (CI) pour évaluer l’état de la cellule. Le changement de l’impédance des micropuces reflète principalement l’environnement ionique des cellules couvertes à l’interface électrode/solution. Par conséquent, les performances analytiques de l’analyseur de cellules s’appuie fortement sur l’unité de détection de base, les micropuces jetables(p. ex., ce qu’on appelle plaques électroniques, par exemple, 96/16/8 puits), qui sont faites de microélectrodes or rangés lithographically imprimé au bas du puits de l’incubation. Des microélectrodes or assemblent sous forme de cercle en ligne (Figure 1) et couvrent la majeure partie de la surface des puits d’incubation, qui permettent une détection dynamique et sensible de cellules attachées^{3,12,13 ,},¹⁴. Le CI augmentera dans le cas de couverture plus de la surface des cellules sur la puce et diminue lorsque les cellules sont exposées à un substance toxique, aboutissant à l’apoptose. Bien que l’analyseur en temps réel cellulaire a été fréquemment utilisé pour déterminer la cytotoxicité¹¹ et neurotoxicité¹⁵ et fournir plus d’informations cinétiques que la méthode classique de points de terminaison, les plaques électroniques jetables sont les plus coûteuses consommable.

Jusqu'à présent, il n’y a eu aucune méthodes disponibles pour la régénération de la plaque électronique, qui est probablement dû au fait que des conditions de régénération dure, comme solution de piranha ou acide acétique sont impliqués^{16,17, 18}, qui peuvent altérer l’État électrique de puces or. Par conséquent, une méthode douce et efficace pour enlever les cellules adhérentes et autres substances de la surface des puces or sera souhaitable pour le processus de régénération de la plaque électronique. Nous avons récemment mis au point un protocole visant à la régénération des plaques électroniques jetables, utilisant des réactifs non corrosifs et les puces régénérées sont caractérisés par des méthodes électrochimiques ainsi qu’optique¹⁹. En utilisant des réactifs de laboratoire facilement disponible et modérée comme la trypsine et éthanol, nous avons établi une méthode générale pour régénérer la plaquette commerciale électronique sans entraîner d’effets indésirables, qui est appliquée avec succès pour régénérer les deux principaux types de la plaque électronique (16 et L8) utilisé pour RTCA.

Protocole

Remarque : en général, le processus de régénération comprend la digestion trypsique et étape de rinçage à l’eau et l’éthanol. Le temps de digestion change selon le nombre de cellules utilisées et le type et le nombre de cellules utilisées peuvent différer selon les fins expérimentales. Il est conseillé de vérifier les micropuces régénérées à l’aide de méthodes optiques et électrochimiques afin d’optimiser les conditions de la régénération. Pendant l’expérience, produits chimiques solubles et insolubles peuvent être impliqués, et ici ces deux cas typiques des procédures de régénération sont détaillées.

1. préparation des Solutions de régénération

NOTE : Préparer et gérer toutes les solutions dans des conditions stériles.

1. Préparer la nouvelle solution de trypsine de 0,25 % (g/v). La trypsine peut être achetée ou fraîchement préparée comme suit.
   1. Dissoudre 0,25 g de trypsine dans 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,4.
   2. Agiter la solution jusqu'à ce que la trypsine est entièrement dissous à 4 ^oC. remuer la solution à basse vitesse, en prenant soin d’éviter toute formation de bulles.
   3. Filtrer la solution avec un filtre de 0,22 µm dans la hotte de la prévention des risques biotechnologiques.
2. Préparer 75 % d’éthanol à l’aide d’éthanol absolu. Verser 75 mL d’éthanol absolu dans une fiole jaugée et ajouter de l’eau désionisée jusqu'à ce que le volume s’élève à 100 mL. Effectuer une stérilisation supplémentaire si nécessaire.

2. l’incubation et la prolifération des cellules A549 en plaques électroniques

Remarque : La plaque électronique types 16 et L8 sont tous deux fabriqués de microélectrodes or rangés, lithographically imprimés au bas du puits de l’incubation. Plaque électronique 16 a 16 puits, tandis que la plaque électronique L8 a 8 puits. Les puits de la plaque électronique 16 sont rondes alors que les puits de la plaque électronique L8 sont rectangles arrondis. Le volume de chaque plaque électronique 8 est bien environ 830 µL et chaque plaque électronique 16 est bien environ 270 µL.

1. Culture de cellules A549
   1. Plat de pénicilline-streptomycine dans la culture de cellule cellules A549 en culture dans un milieu de Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 %.
   2. Les cellules de passage lorsque la densité cellulaire ~ 75 % puis laver la couche de cellules adhérentes avec 1 × PBS et trypsinize avec la solution de trypsine de 0,25 % pendant 1 min à 37 ^oC. centrifuger les cellules à 179 × g pendant 5 min enlever la trypsine. Remettre en suspension les cellules dans 10 mL de milieu pour mise en culture ou autres expériences.
      Remarque : La solution de cellules resuspendues dans le milieu est ici désignée comme le tampon de suspension cellulaire.
   3. Retirez 10 µL et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Utiliser le milieu RPMI-1640 à diluer davantage la mémoire tampon de suspension cellulaire pour préparer le tampon de suspension cellulaire 30 000-80 000 cellules/mL pour les expériences.
2. Prolifération/cytotoxicité experiment et acquisition de données
   1. Ajouter (50 µL 150 µL pour plaque électronique L8) cellule de milieu à chaque incubation puits de la plaque électronique 16 et laisser pendant 30 min dans la prévention des risques biotechnologiques hotte pour l’équilibration. Insérer manuellement la plaque électronique 16 dans l’analyseur en temps réel de cellules dans un incubateur à 37 ^oC. CO₂
   2. Lancez le programme d’opération analyseur portable en temps réel sur l’ordinateur. Sur sa valeur par défaut expérimenter page de configuration de modèle, sélectionnez « Expérience modèle » et nommez le test en cours d’exécution.
   3. Dans sa mise en page, sélectionnez les puits correspondants qui figurent dans l’expérience et de saisir l’information comme les noms de type et nombre de drogues de la cellule dans les zones d’édition. Sur sa page d’annexe, ajouter les étapes expérimentales, puis sélectionnez le temps d’exécution (p. ex., 12, 24 ou 48 heures) de chaque étape et l’intervalle d’acquisition des données en temps réel.
      Note : Ici, l’intervalle de l’étape 1 et 2 sont 1 min et 15 min après.
   4. Enregistrez le fichier et cliquez sur le bouton « Start » pour mesurer l’impédance de fond des médias sur sa page d’Index de la cellule ; les données obtenues seront automatiquement déduites. Sur sa page bien graphique, toutes les courbes bien peuvent être visités. Sur sa page d’intrigue, ajoute wells et le graphique de l’index de temps-cellule seront affichera.
   5. Pour l’expérience de la prolifération cellulaire, tout d’abord cliquez sur le bouton « Pause » pour interrompre le programme. Puis retirez la plaque électronique et ajouter 100 µL A549 cellule suspension de tampon / puits à température ambiante. Laisser la plaque pendant 30 min dans la hotte de la prévention des risques biotechnologiques pour laisser les cellules se déposent au fond du puits de l’incubation.
   6. Insérer manuellement la plaque électronique dans la station d’analyseur portable en temps réel. Cliquez sur le bouton « Démarrer » pour poursuivre l’expérience.
      Remarque : Sur la page de l’intrigue, l’analyseur en continu enregistre courbes tout au long de l’expérience ou les valeurs d’Index de la cellule.
   7. Lorsque l’expérience est terminée, accédez à la page de l’intrigue et ouvrez le fichier de l’expérience. Puis sélectionnez tous les puits testés d’incubation et les courbes de cellule Index résultantes peuvent être en moyenne ou normalisées pour la dernière fois avant d’ajouter des produits pharmaceutiques ou changer de milieu afin de réduire les variations entre les essais. Sur la page d’analyse des données, CE50 ou CI50 peut être calculée

3. régénération des plaques électroniques

Remarque : Pour chaque étape de rinçage, la solution de la plaque électronique était bien mélangée (5 à 10 fois) à l’aide d’une pipette.

1. Cas 1 : pour l’évaluation de la cytotoxicité des anti -médicament contre le cancer
   1. Cellules A549 de semences sur la plaque électronique tel que décrit à l’article 2.
   2. Dissoudre d’abord le chlorhydrate de doxorubicine anticancéreux (DOX) dans le milieu cellulaire. Ajouter lentement DOX aux cellules (concentration finale de DOX est 30 µg/mL) à l’aide d’une pipette. Enregistrer le CI tel que décrit à l’article 2.
      Remarque : La plaque électronique utilisée est régénérée immédiatement après que cette expérience soit complète. Dans ce cas, comme DOX est un produit chimique soluble, la régénération de la plaque électronique suivant le protocole est relativement facile à manipuler, et aucune des étapes supplémentaires ne sont nécessaires.
   3. Régénération
      1. Sortez la plaque électronique contenant des cellules de la gare d’analyseur portable en temps réel. Placer la plaque électronique utilisée dans une hotte de biosécurité stérile à la température ambiante et mélanger soigneusement à l’aide d’une pipette de milieu de culture. Pipetter tous le moyen.
      2. Rincer les plaques électroniques avec de l’eau 200 µL d’eau désionisée pendant 3 fois à température ambiante.
      3. Digérer les cellules restantes sur les plaques électroniques avec la trypsine 0,25 % fraîchement préparé pendant 1-2 h (200 µL/puits) dans un incubateur à 37 ^oC. Une fois la digestion terminée, mélanger la solution d’incubation 5 - 10 fois en utilisant une pipette et la pipette sur toute la solution dans la hotte de la prévention des risques biotechnologiques à la température ambiante.
      4. Rincer les plaques électroniques avec 200 µL éthanol et 200 µL d’eau, respectivement, comme suit : eau désionisée 2 fois, 100 % éthanol 2 fois ; 75 % éthanol 2 fois ; eau désionisée 2 fois. Il faut inverser la plaque électronique sur une gaze stérile ou un papier de soie de décanter l’eau à température ambiante.
      5. Rayons ultraviolets stérilisent la plaque électronique régénérée pendant 1-2 h dans la hotte de la prévention des risques biotechnologiques à la température ambiante.
         NOTE : Doubler le volume de toutes les solutions pour la régénération de la plaque électronique L8.
2. Cas 2 : administration de médicaments à l’aide de matériaux mésoporeux.
   1. Utiliser des matériaux de silice mésoporeuse bâtonnet avec une porosité moyenne de 5,6 nm comme matrices de livraison de médicaments, comme indiqué précédemment²⁰.
      NOTE : Ici, la plaque électronique a été utilisée pour contrôler l’effet de médicaments à libération sur les cellules.
      1. Ajouter des matériaux mésoporeux dans la solution d’incubation de chaque puits des plaques électroniques. Comme matériaux de silice ne sont pas solubles et précipité dans la plaque électronique, rincez la plaque comme suit :
   2. Effectuez les étapes 3.1.3.1-3.1.3.3 comme pour le cas 1.
   3. Rincer les micropuces avec 200 µL désionisée eau une fois dans la hotte de la prévention des risques biotechnologiques à la température ambiante.
   4. Rincer les puces électroniques à l’éthanol absolu de 200 µL 2 fois à température ambiante.
   5. Rincer les micropuces avec 200 µL 75 % d’éthanol une fois à température ambiante.
   6. Ajouter 250 µL d’éthanol 75 % dans chaque puits et sceller la plaque électronique avec le film à température ambiante.
   7. Tourner à 114 x g pendant 2 min et vider la plaque électronique. Il faut inverser la plaque électronique sur une gaze stérile ou un papier de soie de décanter l’eau à température ambiante.
   8. Répétez l’étape 3.2.5-3.2.7 une fois.
   9. Rayons ultraviolets stérilisent la plaque électronique régénérée pendant 1-2 h dans la hotte de la prévention des risques biotechnologiques à la température ambiante.
      NOTE : Doubler le volume de solution tous lorsque rinçage L8 plaques électroniques.

4. Evaluation de l’effet de régénération

1. Caractéristiques optiques de la surface de la plaque électronique régénérée
   1. Utiliser un acier cuiller pour démonter soigneusement la partie inférieure de l’incubation bien des produits frais et régénéré la plaque électronique qui contient des rangées microélectrodes or. Porter un gant en plastique, essuyez soigneusement la partie micropuce contenant de la plaque électronique à l’aide de la cuillère en acier.
   2. Placez les deux pièces au centre des lames de verre et collecter les spectres Raman résultants de Microscope Raman équipé d’un détecteur de CCD²¹.
      Remarque : Le spectromètre était équipé d’un laser à 633 nm et les spectres a été enregistré à un intervalle de 30 s laser l’exposition à une longueur d’onde de l’ordre de 500-3500 cm^-1. Les images optiques ont été obtenues par un Microscope Raman à l’aide d’un objectif d’oculaires 10 x et 50 x objectif. Figure 1 a et 1 de la Figure sont aussi obtenues à l’aide de l’appareil de Microscope Raman installé.
   3. Afin d’évaluer la viabilité de cellules attachées après absorption de médicament anticancéreux sur la fraîche et régénérée plaques électroniques, utilisez un confocal laser microscope à balayage pour surveiller la fluorescence spontanée de DOX molécules absorbées par A549.
      1. Pour enregistrer la fluorescence spontanée de DOX absorbé par les cellules (fraîche et régénérée électronique plaques avec cellules A549), utilisation un 63 X d'huile objective et 485 nm comme la longueur d’onde d’excitation.
2. Comportement électrochimique d’électrodes régénérées
   Remarque : Comme manuel de dissimulation d’une plaquette commerciale électronique est difficile et n’est pas idéal pour l’évaluation de l’État électrique surface que vérifié, l’efficacité de la régénération du protocole a été évaluée en utilisant l’électrode de carbone vitreux/or normal (GCE) comme test plateforme, sur laquelle la spectroscopie d’impédance électrochimique (SIE) a été réalisée. Le diamètre de l’électrode de l’UA et la CME est 3 mm. électrochimique ces données ont été obtenues par un analyseur électrochimique avec un système de trois électrodes et les mesures d’impédance ont été réalisées à l’aide d’un signal de courant alternatif (AC) d’une amplitude 10 mV à une large bande passante de 100 kHz à 0,01 Hz.
   1. Avant la mesure, polir l’électrode Au et la CME à une surface réfléchissante, avec un coulis d’alumine sur un chiffon à lustrer, suivie par sonication dans l’eau pour enlever toutes les particules.
   2. Activer l’électrode Au 0,5 M H₂SO₄. Obtenir des données d’étude d’impact environnemental de l’électrode Au nu et la CME dans 10 mM solution d’électrolyte KCl contenant 1mM K₃[Fe(CN)₆] comme décrit²².
   3. Préparer la solution mère de cellules A549 selon 2.1.2 et 2.1.3. Déposer 10 µL de la suspension cellulaire à la surface de l’électrode de l’UA et de la CME. Incuber les électrodes Au et GCE modifiés avec des cellules dans un incubateur à C ^o37 pendant 3 h données EIS obtenir de l’électrode Au et GCE modifiée avec les cellules 10 mM solution d’électrolyte KCl contenant 1 mM K₃[Fe(CN)₆].
   4. Régénérer les électrodes à l’aide du protocole et la mesure EIS.
      1. Plonger l’électrode Au et GCE modifié avec cellules à 0,25 % de trypsine pour 0,5 à 2 h. Rincer l’électrode Au et la CME doucement avec de l’eau 4 fois. Rincer les électrodes doucement avec de l’éthanol absolu 4 fois. Plonger l’électrode Au et GCE dans 75 % éthanol pendant environ 5 min. Rincer les puces doucement avec de l’éthanol 75 % 4 fois.
      2. Obtenir des données EIS d’électrode Au régénérée et la CME dans la solution d’électrolyte KCl 10 mM contenant 1mM K₃[Fe(CN)₆].

Résultats

Propriétés de surface des puces or: les procédures de régénération utilisées dans le présent protocole ont été décrits dans la Figure 1. La figure 2 montre le microscopique surface des images des produits frais et régénéré plaques électroniques par le microscope optique. Comme illustré à la Figure 2 a et 2 de la Figure

Discussion

Nous avons résumé plusieurs méthodes disponibles^{17,23,24,25,26} pour régénérer les micropuces dans le tableau 1. Fondamentalement, ces méthodes impliqués relativement rudes conditions expérimentales pour atteindre la régénération complète de puces à cause de la présence d’interactions molécules molécule forte telle que celle ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Stock reagents	reconstitution	Concentration used	Storage
Apo-transferrin	10 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
N-acetyl cysteine	5 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Sodium selenite	2.5 mg/mL in H2O	1:25,000	-20°C
Collagen IV	200 μg/mL in PBS	1:100	-80°C
TGF-b2	20 μg/mL in PBS	1:10,000	-20°C
IL-34	100 μg/mL in PBS	1:1,000	-80°C
Ovine wool cholesterol	1.5 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparan sulfate	1 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Oleic acid/Gondoic acid	Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparin	50 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
Solutions	Recipe		Comments
Perfusion Buffer	50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)		Use when ice-cold
Douncing Buffer	200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++		Use when ice-cold
Panning Buffer	2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)	DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite		Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating	MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2		Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)	MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid		Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.