Griffithsin 修饰纤维支架预防性传播感染的制备与表征

Hung R. Vuong; Kevin M. Tyo; Jill M. Steinbach-Rankins

doi:10.3791/56492

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摘要

这份手稿描述了制造和表征 Griffithsin 修饰聚 (乳酸-羟基酸) 纺纤维的程序, 证明有效的粘合剂和抗病毒活性对抗人体免疫缺陷病毒1型感染体外。本文介绍了用于合成、表面修饰和表征表面改性纤维 Griffithsin 的形态、共轭和解吸的方法。

摘要

纺纤维 (EFs) 已广泛应用于各种治疗应用中;然而, 它们只是最近才被用作预防和治疗性传播感染 (sti) 的技术。此外, 许多 EF 技术的重点是封装活性剂, 相对于利用表面传授 biofunctionality。在这里, 我们描述了一种方法制造和表面修饰聚 (乳酸-羟基) 酸 (PLGA) 纺纤维, 具有强大的抗病毒凝集素 Griffithsin (GRFT)。PLGA 是一种经 FDA 批准的聚合物, 由于其优异的化学和生物相容性, 已被广泛应用于药物的传递。GRFT 是一种天然的、有效的、安全的凝集素, 对包括人体免疫缺陷病毒1型 (HIV-1) 在内的多种病毒具有广泛的活性。当结合, GRFT 改性纤维已经证明了强力灭活的 HIV-1在体外。这份手稿描述的方法来制造和表征 GRFT 修改的 EFs。首先, PLGA 是纺制造纤维支架。纤维随后表面修饰与 GRFT 使用 1-乙基 3-(3-dimethylaminopropyl) 二 (和 n-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 化学。扫描电子显微镜 (SEM) 用于评估表面修饰的配方的大小和形貌。此外, 基于 gp120 或血 (HA) 的 ELISA 可以用来量化 GRFT 共轭的数量, 以及 GRFT 解吸从纤维表面。该协议可以更广泛地应用于制造表面修饰的各种不同蛋白质的纤维。

引言

使用 EFs 作为一个专题传送平台有可能大大减少性传播感染。目前, 有超过3600万人感染艾滋病毒, 仅在2015年就有超过200万新病例报告为¹^,²。此外, 单纯疱疹病毒2型 (HSV-2) 感染影响到全世界数亿人, 并已证明, 以提高艾滋病毒的获得 2-5 倍³。由于 HSV-2 感染和艾滋病毒的获取之间的这种关系, 有很大的兴趣开发新的活性药物, 同时提供预防多种性传播疾病的保护。此外, 开发新的车辆, 以改善这些抗病毒药物的运送提供了进一步加强保护和治疗功效的潜力。为了达到这个目标, EFs 被作为一个新的交付平台来进行研究, 以减少 HIV-1 和 HSV-2 感染的流行。

在过去的二十年中, EFs 在药物传递和组织工程领域中得到了广泛的应用⁴。通常, 生物相容性聚合物被选择容易转化为治疗性应用。为了制造聚合物 EFs, 所选的聚合物在有机溶剂或水溶液中溶解, 这取决于聚合物疏水性的程度⁵。在静电纺丝过程之前, 有兴趣的活性剂被添加到溶剂或水溶液中。然后, 聚合物溶液被吸入到注射器中, 并在受到电流的同时慢慢喷射出来。这个过程通常会导致聚合物纤维与板料或圆柱形宏观 (图 1) 和光纤直径不等, 从微米到纳米级的⁶。对于大多数的治疗性应用, 活性剂在纤维纺丝过程中被整合在一起, 通过扩散和随后的纤维降解从纤维中释放出来。通过使用不同类型的聚合物或聚合物共混物来改变降解或释放的速率, 以建立一个理想的释放剖面, 传授独特的化学和物理性质⁷, 并促进几乎所有的封装复合.因此, EFs 已证明有利于小分子药物和生物制剂的交付, 包括蛋白质、肽、寡核苷酸和生长因子⁶^,⁸^,⁹。

在 STI 预防领域, 最近使用 EFs 来合并和提供抗病毒药物的持续或诱导释放¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴ ^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹。在最早的一项研究中, pH 反应纤维的开发, 以释放活性剂, 以响应环境变化的女性生殖道 (首次登记税), 作为一种按需保护的方法, 反对 HIV-1¹¹。因为, 其他研究已经调查了由聚乙烯氧化物和聚 l-乳酸 (PLLA) 组成的聚合物共混物, 以评估抗病毒药物和避孕剂在 HIV-1 预防和避孕方面的可调谐释放,体外¹². 其他研究显示了 EFs 提供以下内容的可行性: 小分子抗病毒药物的长时间释放¹⁴, 强大和灵活的机械性能²⁰, 3 维交付体系结构²¹, 抑制精子穿透性¹², 以及与其他交付技术合并的能力¹³。最后, 以前的工作已经评估了聚合物纤维的持续交付抗病毒剂抗常见 co-infective 病毒, HSV-2 和 HIV-1¹⁴。在这项研究中, 高分子纤维通过保持其结构长达1月, 并为病毒进入提供了物理屏障, 从而为抗病毒药物的传递提供了补充活性。从这些结果中可以看出, EFs 可能被用于物理和化学上阻碍病毒感染。

虽然可调谐释放特性使聚合 efs 成为一个诱人的杀菌剂交付平台, 在其他应用中开发了 efs 作为表面修饰的支架⁷。EFs 已被用来模仿细胞外基质 (ECM) 的形态学, 通常充当支架以改善细胞再生²², 并增强其在组织工程中的效用²³^,²⁴。由聚ε-内 (PCL) 和 PLLA 等聚合物组成的纤维经过表面修饰后, 在静电纺丝作用下, 通过生长因子和蛋白质来传授类似于 ECM 的特性, 包括增加细胞黏附和增殖²⁵^,²⁶. 此外, 还对抗菌表面改性的 EFs 进行了评估, 以防止特定致病细菌的生长,²⁷^,²⁸。由于这种多功能性和诱导生物效应的能力, EF 技术继续在各种领域扩展, 以提供 multi-mechanistic 的功能。然而, 尽管它们在多种应用中都有效用, 但表面改性纤维最近才在杀菌剂领域²⁹中进行了探索。

在开发新的预防和治疗性传播疾病的新技术的同时, 还开发了新型的生物疗法。最有前途的杀菌剂候选者之一是粘合剂抗病毒凝集素, GRFT³⁰。最初来源于一种红藻, GRFT 已证明活动作为一个强有力的抑制剂的艾滋病毒, HSV-2, SARS, 以及丙肝病毒³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶. 事实上, 在 biologically-based 抑制剂中, GRFT 具有最有力的抗 HIV 活性, 几乎在接触³⁰时就立即灭活 HIV-1, 同时在培养基中维持稳定和活动, 从阴道微生物最多10天³⁷。最近, 0.1% GRFT 凝胶被证明保护小鼠免受阴道 HSV-2 的挑战, 使它成为对 HSV-2 和 HIV-1 的第一行保护的有希望的候选者³²^,³⁸. 对于 HIV 病毒, GRFT 抑制感染的物理结合 gp120 或终端甘露糖 n-链接的糖残留病毒的信封表面, 以防止进入³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹ ^,⁴²。这种抑制是非常强大的, 与 IC₅₀的接近 3 ng/mL⁴³。除了抑制艾滋病毒感染, 研究还表明, GRFT 通过抑制病毒的细胞传播来防止 HSV-2 感染 (³²。在所有情况下, GRFT 已经证明是对病毒颗粒的粘合剂, 同时显示出高抗变性。最后, GRFT 已经证明了协同活动与诺福韦 (TFV) 和其他抗病毒药物的组合⁴⁴, 使它可行, 并可能有利于 co-administer 与 EFs。GRFT 的强大特性使它成为一种极好的 biologically-based 抗病毒候选物, 通过 EF 技术可以提高分娩的效率。

利用这一知识的粘合剂和固有的抗病毒性能的 GRFT, 一个高分子纤维脚手架设计, 整合这些属性, 提供第一层病毒进入抑制²⁹。找到灵感的方式, 宫颈粘液阻碍病毒传输主要通过粘粘蛋白相互作用, 我们假设, 通过使用 EFs 作为脚手架和共价修改表面与 GRFT, 高密度表面共轭 GRFT 会在其入口⁴⁵^,⁴⁶⁴⁷中削弱和禁用病毒。在这里, EFs 被开发为一个固定的脚手架, 提供一个蛋白质, 病毒性的粘合剂钝化屏障平台。我们试图结合的强大的抗病毒性能的 GRFT 与一个生物相容, 可修改, 耐用的高分子平台, 创造一个新的病毒 "陷阱"。

为了实现这些目标, 由 PLGA 组成的纤维是纺, 并使用琥珀酰亚胺化学, 以随后修改 EF 表面与 GRFT。PLGA 作为一个模型聚合物, 由于其广泛使用的静电纺丝⁴⁸, 结合其生物相容性和 cost-effectiveness。此外, 表面修改利用了 EFs 的大面积, 并提供了一个有用的替代方案, 可与封装结合, 以最大程度地提高光纤实用程序⁴⁹。与传统的封装方法不同的是, 只有部分 GRFT 是可用的 (而且只有在首次登记时才会出现), 表面修饰可以使 GRFT 在整个治疗期间保持最大的生物活性。此外, 采用传统的静电纺丝方法, 如蛋白质等亲水性化合物的加入, 可能会导致较低的封装效率和蛋白质活性的丧失⁵⁰。因此, GRFT 表面改性纤维可以提供一种有前途的替代交付方法, 可以单独使用或与静电纺丝结合, 以加强预防性病感染。