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Resumen

Este manuscrito describe el procedimiento para fabricar y caracterizar fibras de electrospun modificado Griffithsin poli (ácido láctico-co-glicólico) que muestran potente actividad adhesiva y antiviral contra la infección por virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 en vitro. Métodos utilizados para sintetizar, modificar superficie, caracterizar la morfología resultante, Conjugación, y se describen desorción de Griffithsin de fibras de superficie modificada.

Resumen

Electrospun fibras (EFs) han sido ampliamente utilizadas en una variedad de aplicaciones terapéuticas; sin embargo, sólo recientemente aplicados como una tecnología para prevenir y tratar sexualmente transmitidas (ETS). Además, muchas tecnologías EF se centran en encapsular al agente activo, en relación con la utilización de la superficie para impartir biofunctionality. Aquí se describe un método para fabricar y superficie-modificar poly(lactic-co-glycolic) ácido (PLGA) electrospun fibras, con las lectinas antiviral potente Griffithsin (GRFT). PLGA es un polímero aprobado por la FDA que ha sido ampliamente utilizado en la administración de fármacos debido a sus excelentes propiedades químicas y biocompatibles. GRFT es un natural, potente y seguro lectina que posee actividad amplia contra numerosos virus incluyendo el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). Cuando se combinan, las fibras modificadas GRFT han demostrado potente inactivación del VIH-1 en la vitro. Este manuscrito describe los métodos para fabricar y caracterizar EFs GRFT modificado. En primer lugar, PLGA es electrospun crear un andamio de fibra. Las fibras son posteriormente modificado de superficie con GRFT usando 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y la química de N-hydroxysuccinimide (NHS). Microscopía electrónica de barrido (SEM) se utilizó para evaluar el tamaño y la morfología de las formulaciones de superficie modificada. Además, un gp120 o hemaglutinina (HA)-ELISA de base puede utilizarse para cuantificar la cantidad de GRFT conjugada, así como desorción GRFT desde la superficie de la fibra. Este protocolo puede aplicarse más ampliamente para fabricar fibras que son modificados por la superficie con una variedad de proteínas diferentes.

Introducción

El uso de EFs como una plataforma de entrega tópica tiene el potencial para reducir significativamente las ITS. Actualmente, hay más 36 millones personas que viven con el VIH, con sobre 2 millones de nuevos casos reportados en 2015 solo1,2. Además, el virus herpes simple tipo 2 (HSV-2) la infección afecta cientos de millones de personas en todo el mundo y se ha demostrado para mejorar la adquisición del VIH por 2-5 veces3. Debido a esta relación entre infección por VHS-2 y la infección por el VIH, existe gran interés en el desarrollo de nuevos agentes activos que proporcionan la protección simultánea contra las ITS múltiples. Por otra parte, el desarrollo de nuevos vehículos para mejorar la entrega de estos agentes antivirales ofrece el potencial para aumentar la Potencia protectora y terapéutica. Hacia este objetivo EFs han sido investigados como una nueva plataforma para reducir la prevalencia de infecciones por el VIH-1 y HSV-2.

Durante las últimas dos décadas, EFs se han utilizado extensivamente en los campos de la administración de fármacos y tejidos ingeniería4. A menudo, polímeros biocompatibles se seleccionan traducir fácilmente a aplicaciones terapéuticas. Para fabricar el EFs poliméricos, el polímero seleccionado se disuelve en una solución acuosa o disolvente orgánica, dependiendo del grado de hidrofobicidad de polímero5. Agentes activos de interés entonces se agregan a la solución acuosa o disolvente antes del proceso de centrifugado eléctrico. La solución de polímero es entonces aspira en una jeringa y expulsada lentamente mientras sujeta a una corriente eléctrica. Este proceso típicamente resulta en fibras de polímero con hoja o macroestructuras cilíndrico (figura 1) y diámetros de fibra que van desde la micro a nano-escala6. Para aplicaciones más terapéuticas, agentes activos se incorporan dentro de las fibras durante el proceso de centrifugado eléctrico y son liberados de la fibra a través de la difusión y la degradación de fibra posterior. La tasa de degradación o de liberación puede ser alterada usando diferentes tipos de polímeros o mezclas de polímeros para establecer un perfil de liberación deseado, impartiendo propiedades químicas y físicas únicas7y la promoción de la encapsulación de prácticamente cualquier compuesto. Como tal, EFs han demostrado ser beneficiosos para la entrega de fármacos de molécula pequeña y agentes biológicos, como proteínas, péptidos, oligonucleótidos y factores de crecimiento6,8,9.

En el campo de la prevención de ITS, EFs han utilizado recientemente para incorporar y ofrecer o inducible-liberación sostenida de agentes antivirales10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. En uno de los primeros estudios, se desarrollaron fibras sensible al pH para liberar a agentes activos en respuesta a cambios ambientales dentro de la zona reproductiva femenina (FRT), como un método en demanda de protección contra el VIH-111. Desde entonces, otros estudios han investigado mezclas de polímero compuestos de óxido de polietileno (PEO) y el ácido poli-l-láctico (PLLA), para evaluar la liberación ajustable de agentes antivirales y anticonceptivos para VIH-1 prevención y anticoncepción in vitro 12. estudios adicionales han demostrado la viabilidad de EFs para proporcionar lo siguiente: prolongada liberación de pequeñas moléculas antivirales14, fuerte y flexible propiedades mecánicas20, arquitecturas de entrega 3-21 , inhibición de esperma penetración12y la capacidad para combinar con otras tecnologías de entrega13. Finalmente, el trabajo previo ha evaluado fibras poliméricas para la entrega sostenida de los antivirales contra el virus de co-contagioso comunes, HSV-2 y VIH-114. En este estudio, las fibras de polímero proporcionan actividad complementaria a la entrega de antiviral por su estructura de retención hasta por 1 mes y proporcionar una barrera física a la entrada viral. De estos resultados, se observó que la EFs pueden utilizarse tanto física como químicamente impedir la infección del virus.

Mientras que propiedades sintonizables poliméricos EFs una plataforma atractiva para la entrega de microbicidas, EFs se han desarrollado en otras aplicaciones como andamios de superficie modificada7. EFs se han utilizado para imitar la morfología de la matriz extracelular (ECM), actuando a menudo como andamios para mejorar la regeneración celular22y su utilidad en tejidos ingeniería23,24. Las fibras de polímeros como el poli-ε-caprolactone (LCP) y PLLA han sido superficie modificada con factores de crecimiento y proteínas después de electrospinning impartir propiedades de ECM como incluyendo aumento celular adherencia y proliferación25 , 26. Además, EFs modificado superficie antimicrobianas han sido evaluadas para prevenir el crecimiento de bacterias patógenas específicas27,28. Debido a esta versatilidad y la capacidad de inducir efectos biológicos, tecnología EF continúa expandiéndose a través de una variedad de campos para proporcionar funcionalidad de múltiples mecanismos. Sin embargo, a pesar de su utilidad en una diversidad de aplicaciones, fibras de superficie modificada sólo recientemente se han explorado en el campo microbicida del29.

En paralelo con el desarrollo de las nuevas tecnologías de entrega para prevenir y tratar las ITS, se han desarrollado novedosas terapias biológica. Uno de los candidatos más prometedores del microbicida es el adhesivo lectinas antiviral, GRFT30. Derivado originalmente de una especie de algas rojas, GRFT ha demostrado actividad como un potente inhibidor de la HIV, HSV-2, SARS, así como de la Hepatitis C virus31,32,33,34, 35 , 36. de hecho, entre los inhibidores de base biológica, GRFT tiene la más potente actividad anti-VIH, inactivar el VIH-1 casi de inmediato en contacto30, manteniendo la estabilidad y la actividad en presencia de medios de cultivo de vaginal microbios por hasta 10 días37. Más recientemente, gel 0.1% GRFT fue demostrado proteger a ratones contra el desafío de HSV-2 intravaginal, convirtiéndolo en un candidato prometedor para la primera línea de protección contra HSV-2 y VIH-132, 38. para VIH GRFT inhibe específicamente, infección atando físicamente gp120 o terminal de residuos de glicanos N-ligados de manosa en las superficies de la envoltura vírica para prevenir la entrada de38,39,40,41 ,42. Esta inhibición es muy potente, con IC50s a 3 ng/mL43. Además de inhibir la infección por VIH, los estudios también han demostrado que GRFT protege contra la infección por HSV-2 inhibiendo la propagación de célula a célula del virus32. En todos los casos, GRFT ha demostrado ser adhesivo a partículas virales, demostrando alta resistencia a la desnaturalización. Por último, GRFT ha demostrado actividad sinérgica con combinaciones de Tenofovir (TFV) y otros antivirales44, lo que es factible y probable beneficioso administrar conjuntamente con EFs. Las potentes propiedades de GRFT hacen un excelente base biológica antiviral candidato, en el cual entrega puede mejorarse con la tecnología EF.

Utilizando este conocimiento de las propiedades antivirales de GRFT adhesivo e innatas, un andamio de fibra polimérica fue diseñado, que integra estas propiedades para proporcionar la primera capa de virus entrada inhibición29. Encontrando inspiración en el camino que moco cervicovaginal dificulta el transporte de virus principalmente a través de las interacciones de mucina mucoadherentes, presumimos con EFs como andamio y covalente modificando la superficie con GRFT, una alta densidad de conjugados con superficie GRFT debilitar e inactivar virus en su punto de entrada45,46,47. Aquí EFs se desarrollaron como un andamio fijo para proporcionar una viral, basada en la proteína adhesiva inactivar barrera plataforma. Intentamos combinar las potentes propiedades antivirales de GRFT con una plataforma de polímero biocompatible, modificable y durable, para crear un nuevo virus "trampa."

Para alcanzar estos objetivos, las fibras de PLGA eran electrospun y química NHS EDC utilizó posteriormente modificar la superficie EF con GRFT. PLGA sirvió como un polímero del modelo debido a su amplio uso en electrospinning48, combinado con su biocompatibilidad y su rentabilidad. Además, modificación superficial explota la gran superficie de EFs y ofrece una alternativa útil que puede combinarse con la encapsulación para maximizar la utilidad de la fibra49. A diferencia de los métodos de encapsulación tradicionales donde solamente una porción de GRFT está disponible (y sólo transitoriamente presentes en la FRT), modificación superficial puede permitir GRFT mantener bioactividad máxima durante toda la duración del tratamiento. Además, la incorporación de compuestos hidrofílicos como proteínas por métodos tradicionales de electrospinning, puede resultar en rendimientos más bajos de la encapsulación y la pérdida de proteína actividad50. Por lo tanto, las fibras de superficie modificada GRFT pueden ofrecer un método prometedor de entrega alternativos que puede utilizarse solos o en combinación con electrospinning para optimizar la protección contra la infección de ITS.

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Protocolo

1. preparación y fabricación de andamio de fibra Electrospun

PRECAUCIÓN: todo el trabajo con solventes o soluciones de polímeros debe realizarse en una campana de humos químicos . Consulte la hoja de datos material de seguridad de cada reactivo antes de iniciar el protocolo de.

  1. Para electrospin una solución de polímero del EGLP 3 mL de 15% w/w, peso 720 mg de 50: 50 poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA; 0.55 a 0.75 dL/g, 31-57 kDa) en un vial de centelleo de 10 mL. El volumen de la solución se basa en el tamaño de lote típico utilizado en los estudios actuales.
    Nota: Debe calcularse la masa de polímero para agregar a un volumen dado de solvente en la primera determinación de la densidad del solvente utilizado para disolver el polímero. La densidad del solvente Hexafluoro-2-propanol (HFIP) es de 1,59 g/mL. Así, el peso del solvente, basado en un volumen de 3.0 mL HFIP necesitada, es 4,8 g (3,0 mL x 1,59 g / mL). Para una fracción 15% w/w de PLGA a HFIP 720 mg EGLP debe agregarse a 3.0 mL HFIP (0.15 x 4.800 mg = 720 mg). La ventaja de usar un % w/w/solución de polímero, en lugar de % w/v, es que proporciona un peso definido de la solución final. Este peso definido permite reemplazo de solvente más precisa, en el caso de evaporación de solvente durante el paso 1.3.
  2. Agregar 3.0 mL HFIP al vial de centelleo de vidrio que contiene PLGA (del paso 1.1) con una pipeta serológica de vidrio. Cubrir el frasco con la película plástica, a continuación, mida y registre el frasco Massachusetts
  3. Incubar la suspensión del polímero durante la noche a 37 ° C para asegurar la completa disolución del polímero. Si ningún tipo de disolvente se evapora, disminuyendo la masa de la cubeta, añadir HFIP hasta que el frasco alcanza su masa original en el paso 1.2.
  4. Después de la incubación, preparar el aparato de electrospinning ( figura 2 A). Aunque puede utilizar un mandril de cualquier tamaño, aquí un mandril giratorio de acero inoxidable de diámetro exterior 25 mm fue utilizado como el colector de.
    Nota: Un diámetro de mandril disminuirá el grosor de la fibra, dado el mismo volumen de solución de electrospinning.
  5. Aspirar la solución de polímero en una jeringa de 3 mL.
  6. Conectar una punta de aguja Roma de calibre 18, 1/2 pulgada a la jeringuilla y dispense el exceso (típicamente de 0.25 mL) de solución para eliminar el espacio vacío en la punta de la aguja.
  7. Coloque la jeringa en una bomba de jeringa y fijar el caudal de instrumento a 2,0 mL/h.
    Nota: Este flujo se optimizó anteriormente basado en la viscosidad del polímero para la formulación de esta.
  8. Conectar la fuente de alimentación a la aguja de la jeringuilla y electrospin la solución de polímero con una tensión de + 27 kV. La distancia entre la aguja y el colector debe ser establecida en aproximadamente 25 cm ( figura 2 B).
    PRECAUCIÓN: El proceso de centrifugado eléctrico crea un vapor de solvente. Utilice una campana de humos o un aparato cerrado ( figura 2) para eliminar el vapor perjudicial .
  9. Una vez que la solución entera electrospun, apague la fuente de energía y permitir que el mandril gire un adicional 30 minutos evaporar totalmente el disolvente.
  10. Vuelta apagado el colector rotativo de mandril y utilice una cuchilla para cortar la fibra del mandril. Utilice la cuchilla para pelar suavemente la fibra de la mandril.
  11. Recoger la fibra PLGA electrospun en una placa Petri marcada y en un desiccatorovernight para quitar el solvente residual.

2. Modificación de la superficie de las fibras con GRFT

  1. Prepare soluciones de tampón fosfato salino (PBS) y 2-(N-morfolino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido (tampón de MES). Preparar PBS disolviendo 8 g NaCl 0,2 g KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4 y 0.24 g KH 2 PO 4 en 1 L de agua ultrapura. De manera similar, disolver 19,52 g MES (libre de ácido, 195.2 MW) y 29,22 g NaCl en 1 L de agua ultrapura, para preparar el buffer MES. Asegurar que el pH final de cada solución es entre 7.2-7.5 y 5.0-6.0, respectivamente, usando un medidor de pH.
  2. Preparar soluciones de trabajo individuales de EDC (2 mM) y NHS (5 mM).
    1. Quite la EDC y NHS del congelador y permitirles que alcancen la temperatura ambiente antes de pesar.
    2. Pesar de 4 mg de EDC en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL.
    3. Pesar de 6 mg de NHS en otro tubo de microcentrífuga.
    4. ML agregue 1 MES buffer a cada tubo. Vórtex los tubos vigorosamente para los reactivos se disuelven completamente.
  3. Preparar una solución de hidroxilamina pesando 70 mg en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL.
  4. Añadir a la hidroxilamina y vortex para disolver 20 mL PBS.
  5. Masa hacia fuera una cantidad apropiada de fibra EGLP en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL. Normalmente, 75 mg de fibra se utiliza para cada lote de reacción.
  6. Añada 8 mL de tampón MES al tubo de 15 mL.
  7. Agregue 1 mL de cada una de las soluciones EDC y NHS preparado anteriormente para el tubo. El volumen final de la solución debe ser 10 mL. Las concentraciones finales de EDC y NHS deben ser 0,4 mg/mL y 0.6 mg/mL, respectivamente.
  8. Cierre y selle el tubo de 15 mL con película de plástico y colóquelo en un rotor para permitir que la solución de invertirse suavemente durante 15 min a temperatura ambiente ( figura 3 B). Este paso activa los grupos carboxyl en el polímero para permitir la modificación covalente con la proteína GRFT ( figura 3 A).
  9. Después de la activación, cuidadosamente calmar la reacción mediante la adición de 14 μl de β-mercaptoetanol al tubo. Invertir el tubo varias veces para asegurar una mezcla completa.
    PRECAUCIÓN: β-mercaptoetanol es altamente tóxico y debe ser utilizado en una campana de humos químicos.
  10. Eliminar el sobrenadante y lavar dos veces, la fibra PLGA con 10 mL de PBS para quitar cualquier resto de β-mercaptoetanol.
  11. Después de enjuagar, agregar una cantidad apropiada de solución madre GRFT al tubo. Por ejemplo, un 5 nmol fibra GRFT/mg requeriría 6,35 μl de solución stock GRFT (de un stock de 10 mg/mL) por mg de fibra. Así una muestra de fibra 75 mg requeriría 476.25 μl de solución stock de 10 mg/mL GRFT.
    Nota: Se fabrican fibras GRFT con cargas teóricas de 0.05, 0.5 y 5 nmol GRFT por fibra mg.
  12. Añadir suficiente PBS para llevar el volumen final a 8 mL, cerrar e invertir el tubo para asegurar una mezcla completa.
  13. Sellar el tubo con película de plástico y colóquelo en un rotor nuevo, tiempo de 2 h.
  14. Después de las 2 h incubación, calmar la reacción mediante la adición de 2 mL de solución de hidroxilamina en el tubo de centrífuga de 15 mL. Siguiendo las instrucciones del fabricante, la concentración final de hidroxilamina durante la reacción de enfriamiento debe ser 0,7 mg/mL.
  15. La solución se mezcla bien y desechar el sobrenadante. Enjuague la fibra PLGA de superficie modificada dos veces con 10 mL de agua ultrapura para quitar cualquier GRFT.
  16. Transferencia de la fibra a un plato de Petri y lugar dentro de un desecador hasta que la fibra quede completamente seca. Transferencia de la caja Petri a 4 ° C para almacenamiento de información.

3. SEM fibras caracterización de GRFT superficie modificada

montaje del espécimen de
  1. lugar una tira de cinta de carbón de doble cara en un SEM. La parte inferior del montaje del espécimen de la etiqueta con los datos identificativos de la muestra utilizando un marcador permanente.
  2. Cortar tres muestras de una fibra de superficie modificada y en montajes de muestras separadas. El grueso de cada muestra es aproximadamente de 0,5 mm.
  3. Farfulle la capa las muestras mediante la deposición de partículas inducida por electrones de una placa de oro. Sputter coat por 90 s, en 2.4 kV.
    Nota: El tiempo de capa catódica puede variar dependiendo de los parámetros del equipo, incluyendo el voltaje y amperaje.
  4. Las muestras de la imagen a 8 kV con aumentos que van desde 1.000 a 5, 000 x.

4. Extracción de GRFT de fibras de superficie modificada

  1. total a 2 mg de fibra por triplicado en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Agregar dimetilsulfóxido 1 mL (DMSO) en el tubo, entonces vortex e incubar durante 1 min a temperatura ambiente para disolver completamente la fibra.
  3. Después de la incubación, diluir una alícuota de 10 μl de la solución de DMSO-fibra en el paso 4.2, por lo menos 100-fold en tampón Tris-EDTA (TE) (pH = 8.0).
  4. Almacenar las muestras a-20 ° C hasta carga caracterización con ELISA de.

5. Medición GRFT desorción de fibras

  1. para evaluar la cantidad de GRFT lanzado o desorbida de la fibra, peso 5-10 mg de fibra de superficie modificada y colocarla en un tubo de microcentrífuga. Registrar la masa de fibra en cada tubo.
  2. Añada 1 mL de una solución apropiada que imita el entorno fisiológico (e.g., PBS, buffer TE, fluido vaginal simulado (SVF), etc.) para cada muestra.
  3. Incubar las muestras durante 1 hora en un agitador rotatorio a 200 rpm, 37 ° C.
  4. Después de incubación, retirar aproximadamente 1 mL de tampón de TE que contiene el GRFT deabsorbido del frasco y alícuota a cluster tubos. Almacenar a-20 ° C hasta la cuantificación de proteína.
  5. Transferir la muestra a un tubo nuevo de microcentrífuga, añadir 1 mL de solución amortiguadora fresca a la fibra dentro del tubo de microcentrífuga e incubar hasta el siguiente momento.
  6. Puntos de tiempo típico utilizado para medir la versión: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 wk. h y 1 insignificante desorción se observó en estos estudios después de 4 h.

6. Cuantificación de GRFT extracción y desorción mediante ELISA

  1. capa un ELISA de 96 pocillos placa con 0,1 mL de HA (10 μg/mL) por pozo como se describió anteriormente 51. Selle la placa con la película plástica e incubar durante una noche a 4 ° C ( figura 4).
  2. Quitar el tampón con revestimiento y añadir 0,3 mL tampón (2-3% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS con 0.05% polisorbato 20) a cada pozo de bloqueo. Incube la placa durante al menos 2 h a temperatura ambiente.
  3. Después de la incubación, lavar la placa 3 veces con PBS 1 x con 0.1% polisorbato 20 (PBS-P). Después de enjuagar, dispensar 0.1 mL de muestra, estándar o PBS como control negativo en los pocillos respectivos. Incube la placa otra vez por 1 h a temperatura ambiente.
  4. Lavar la placa otra vez 3 veces con PBS-P. Después de enjuagar, agregar 0,1 mL de anticuerpo primario (antisuero de cabra anti-GRFT) en cada pocillo e incubar durante al menos 1 h a temperatura ambiente. Por lo general, se diluye la solución de anticuerpo primario de 1: 10,000 en PBS.
  5. Después de incubar las muestras con enjuague de anticuerpo primario las placas otra vez 3 veces con PBS-P. Añadir 0,1 mL de anticuerpo secundario (peroxidasa de rábano (HRP)-cabra anti conejo Conjugado IgG) a cada uno bien e incubar 1 h a temperatura ambiente. Se diluye la solución de anticuerpo secundario de 1: 10,000 en PBS.
  6. Lavar la placa 3 veces. Agregar sustrato de peroxidasa 2 TMB 0.1 mL en cada pocillo. Supervisar el desarrollo de color (aproximadamente 2 minutos), a continuación, Añadir 0,1 mL de H 2 hasta 4 (1 N) para calmar la reacción. Leer la placa a 450 nm en un lector de placas.
  7. Promedio de los valores de OD de fondo (pozos que sólo reciben la PBS) y restar esto de los grupos experimentales.

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Resultados

Morfología de la fibra tiene un efecto significativo en la capacidad de la EFs de superficie modificada para proporcionar protección contra virus. Aunque electrospinning es un procedimiento conveniente y sencillo, formulaciones de polímeros no optimizado pueden resultar en la morfología de la fibra irregular (figura 5B-C). Alteraciones en la condiciones de electrospinning que resultan en la formación de morfologías de estera-como cuenta...

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Discusión

Debido a sus estructuras porosas y superficies grandes, EFs han encontrado una variedad de aplicaciones en la salud, uno de los cuales incluye servir como vectores terapéuticos. Drogas y otros agentes activos pueden ser incorporados dentro de EFs para entrega regulable, mientras que los productos biológicos y químicos ligandos pueden ser conjugados con la superficie de la fibra para celular específica dirigida a52 o biosensores53. Aquí la fabricación de GRFT superfici...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al fondo de la judíos patrimonio por excelencia para la financiación de esta investigación. Agradecemos al Dr. Stuart Williams II para ofrecer generosamente el uso del sistema de centrifugado eléctrico. También agradecemos el Dr. Kenneth Palmer nos proporciona Griffithsin. Además agradecemos a Dr. Nobuyuki Matoba y su laboratorio para el entrenamiento en el ELISA GRFT trabajar.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50LactelB6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)Thermo Scientific 147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2Brico Medical SuppliesBN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tipVWR309657
Parafilm (plastic film)Sigma AldrichP7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)Sigma AldrichM3671 
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653
Potassium ChlorideSigma AldrichP9333
Sodium phosphate dibasicSigma AldrichS7907
Potassium phosphate monobasicSigma AldrichP0662
Hydroxysuccinimide (NHS)Thermo Scientific 24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)Thermo Scientific 22980
2-MercaptoethanolFisherBP176
Griffithsin (GRFT)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Dimethyl SulfoxideMilipore317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)Sigma AldrichP9416 
Tris EDTA BufferSigma Aldrich93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well PlatesThermo Scientific 3355
Influenza Hemagglutinin (HA)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)Santa Cruz2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase SubstrateKPL52-00-00

Referencias

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