作製と評価 Griffithsin 変更繊維足場の防止のため性的感染

要約

この原稿を作製し、ひと免疫不全ウイルス 1 型感染に対して強力な接着剤や抗ウイルス活性を示す Griffithsin 変更ポリ (乳酸グリコール酸) 電極として繊維を特徴付けるプロシージャを記述します。生体外で。合成に使用するメソッド表面変更、共役, 結果として得られる形態の特徴し、繊維の表面改質から Griffithsin の脱離が記載されています。

要約

エレクトロスピニング繊維 (EFs) は、様々 な治療上のアプリケーションで広く使用されています。しかし、彼らが感染症 (性感染症) の予防と性的治療技術として適用ばかりされています。さらに、EF の多くの技術は、biofunctionality を付与する表面を基準にして、アクティブなエージェントをカプセル化に焦点を当てます。ここを作製し、表面 - poly(lactic-co-glycolic) 酸 (PLGA) エレクトロスピニング繊維、強力な抗ウイルス レクチン Griffithsin (GRFT) を変更する方法を記述します。PLGA は、その優れた化学と生体適合性の特性のための薬剤投与で広く使用されている FDA が承認したポリマーです。GRFT は、強力な自然とひと免疫不全ウイルス タイプ 1 (HIV-1) を含む多数のウィルスに対して広範な活動を所有している安全なレクチンです。組み合わせることで、繊維の GRFT 変更は体外の HIV-1 の強力な不活化を実証しています。この原稿は、製造するために、EFs の GRFT 変更を特徴付ける方法を説明します。まず、PLGA はエレクトロスピニング繊維足場を作成します。繊維は、その後表面改質 1 を使用して GRFT-エチル - 3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド (EDC) と N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) 化学。走査電子顕微鏡 (SEM) は、サイズと表面改質した製剤の形態を評価するために使用されました。また、gp120 やヘマグルチニン (HA)-ベース ELISA は、共役 GRFT として GRFT 脱繊維表面の量を定量化するされることがあります。このプロトコルは、異なった蛋白質の様々 な表面改質は、ファイバーを作製するより広く適用できます。

概要

局所配信プラットフォームとして EFs の使用には、性感染症を大幅に削減する可能性があります。現在、hiv 感染者の報告された 2015年だけ^1,2の以上 200 万の新しい症例以上 3600 万の人々 があります。さらに、単純ヘルペス ウイルス 2 (HSV-2) 感染影響何百もの世界中の人々 の何百万人を入力し、2-5 倍³によって HIV の買収を強化するのに示されています。HSV-2 感染症および HIV 取得の関係、ため複数性感染症に対する保護を同時新規の活性剤の開発に重要な関心があります。さらに、これらの抗ウイルス剤の配信を改善するために新しい車の開発は、予防・治療の効力を強化する可能性を提供しています。この目標に向かって HIV 1 と hsv-2 感染症の有病率を削減する新しい配信プラットフォームとして EFs を調べた。

過去 20 年間、EFs は薬剤配達および組織エンジニア リングの⁴分野で広く使用されています。多くの場合、簡単に治療への応用に翻訳する生体適合性ポリマーが選択されます。高分子 EFs を作製するには、有機溶剤、水性溶液、高分子の疎水性⁵の程度に応じてに選択したポリマーを溶解しています。関心の活性剤、静電紡糸プロセスの前に溶剤または水のソリューションに追加されます。高分子溶液は、注射器に吸引、電気電流を受ける一方ゆっくりと放出されます。このプロセスは通常ポリマー繊維シートまたは円筒状の破面観察 (図 1)、繊維径マイクロ ・ ナノスケール⁶に至るとの結果します。最も治療用活性剤は紡糸プロセス中に繊維内に組み込まれているし、拡散とその後繊維分解を介して繊維から解放されます。ポリマーの種類を使用しての劣化や解放の率を変更ことがありますまたはポリマーのユニークな化学的および物理的特性⁷を授受し、事実上すべてのカプセル化を推進、望ましいリリース プロファイルを確立するブレンド化合物。など、EFs は小分子薬および生物学的製剤のタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、成長因子^6,8,9などの配信に有益な証明しています。

EFs は、STI 予防のフィールドに組み込む、または誘引可能な - の徐放性抗ウイルス剤^{10、11,12,13,14 を提供する最近使用されてしまった ,,1516,17,18,19}。初期の研究のひとつで、pH 応答性繊維は HIV 1¹¹に対する保護のオンデマンド方式として (FRT)、女性の生殖器官内で環境の変化に対応した活性剤を解放するために開発されました。以来、他の研究は、ポリエチレンオキシド (PEO) とポリ-L-乳酸 (PLLA)、抗ウイルス、避妊剤、HIV 1 予防や避妊体外^{用の可変のリリースを評価するから成るポリマー ブレンドを検討しました。12}. 追加の研究は、次を提供するために EFs の可能性を実証した: 低分子抗ウイルス剤¹⁴, 強力なリリースと柔軟な機械的性質²⁰、3 D 配信アーキテクチャ^{21 を延長}、精子侵入¹²と他配信技術¹³とをマージする機能の抑制。最後に、前作は、HIV-1¹⁴や HSV-2 一般的な co-infective ウイルスに対する抗ウイルス剤の持続的な配達のための高分子繊維を評価しています。本研究ではポリマー繊維は、1 ヶ月のために構造を維持し、ウイルス エントリへの物理的な障壁を提供することによって抗ウイルス配信を補完する活動を提供しました。これらの結果から両方の物理的および化学的にウイルス感染を妨げるに EFs を使用できるということがわかった。

可変リリース プロパティする高分子 EFs が殺菌剤の配達のための魅力的な配信プラットフォーム、EFs は表面改質した足場⁷として機能する他のアプリケーションで開発されています。EFs は、しばしば細胞再生²²を向上させ、組織工学^23,24でのユーティリティを足場として細胞外のマトリックス (ECM) の形態を模倣するために使用されています。ポリ-ε-カプロラクトン (PCL) 等の高分子から成る繊維とポリ乳酸をされている成長因子および蛋白質の表面修飾エレクトロスピニング後増加の細胞接着と増殖の²⁵を含む ECM のような性質を与える^,26します。 特定の病原細菌^27,28の成長を防ぐために抗菌表面改質した EFs が評価されたさらに。この汎用性と生物学的作用を誘導する能力のため EF 技術はさまざまな多機械論的機能を提供するフィールドを展開し続けます。そのユーティリティ アプリケーションの多様性にもかかわらずまだ、殺菌剤フィールド²⁹で繊維の表面改質が最近検討されています。

予防し、感染症を治療する新しい配信技術の開発と並行して、生物学的治療薬が開発されています。殺菌剤の最も有望な候補者は、接着剤の抗レクチン、GRFT³⁰があります。紅藻の種から派生した当初、GRFT は HIV、HSV-2、SARS の強力な阻害剤としての活性を示しているだけでなく、C 型肝炎ウイルス^{31,32,33,34,35,36}します実際には、生物学に基づいた阻害剤の間で GRFT は最も強力な抗 HIV 活性安定性と腟から文化メディアの存在下で活性を維持しながら接触³⁰、時にほとんどすぐに HIV 1 を不活性。最大 10 日間³⁷微生物。最近では、0.1 %grft ゲルは、HSV-2 や HIV-1 の³²の両方に対する保護の最初のラインのための有望な候補内の HSV-2 のチャレンジに対してマウスを保護するために示されていた^,38. の HIV GRFT が物理的にエントリ^{38,39,40,41 を防ぐためにウイルスの封筒表面の gp120 またはターミナル マンノースの N 型糖鎖の残基をバインドすることによって感染を阻害する具体的には、 ,42}。この阻害は、3 の ng/mL⁴³に近づいて IC₅₀s で非常に強力です。研究の HIV 感染を阻害する、に加えてウイルス³²細胞-細胞拡散を抑制することによって、GRFT が HSV-2 の感染症から保護することが示されています。すべてのケースで GRFT を変性高抵抗性を発揮しながら、ウイルス粒子を接着剤に示されています。最後に、GRFT は、実現可能であり可能性が有益なこと EFs で共同管理するテノホビル (TFV) とその他の抗ウイルス剤の⁴⁴の組み合わせで相乗的な活性を実証しています。GRFT の強力な特性では、優秀な生物学に基づく抗ウイルス候補で配信は、EF 技術と高められるかもしれない。

GRFT の接着および生来抗ウイルス プロパティは、この知識を利用して、高分子繊維足場設計されました、ウイルス エントリ抑制²⁹の最初の層を提供するこれらのプロパティを統合します。腟粘液が主に mucoadhesive ムチン相互作用を介してウイルスの輸送を妨げる方法のインスピレーションを見つけること、私たちと仮定足場として EFs を使用し共有 GRFT の高密度と表面の変更表面共役 GRFT は消耗し、そのエントリ ポイント^45,46,47でウイルスを不活性化します。ここで EFs は、タンパク質ベース、バイラルマーケティング接着剤不活性バリア プラットフォームを提供する固定足場として開発されました。我々 は GRFT の強力な抗ウイルス特性「トラップ」新しいウイルスを作成には、生体適合性、変更可能で、耐久性のあるポリマー プラットフォームと組み合わせるしよう

これらの目標を達成するために PLGA から成る繊維エレクトロスピニングと EDC NHS 化学だった GRFT EF 表面を後で変更するために使用します。PLGA はエレクトロスピニング⁴⁸、生体適合性と費用対効果での広範な使用のためのモデル ポリマーとして提供しています。また、表面改質、EFs の大きな表面積を悪用、繊維ユーティリティ⁴⁹を最大限にカプセル化と組み合わせることができます便利な代替手段を提供します。異なり、伝統的なカプセル化方法 GRFT の部分のみ利用可能です (とのみ一過性、FRT で提示)、表面改質処理の全体の期間中最大の生物活性を維持するために GRFT を有効に。さらに、伝統的なエレクトロスピニング法によるタンパク質など親水性化合物の取り込み低カプセル化効率とタンパク質活性⁵⁰の損失可能性があります。したがって、GRFT、繊維表面改質した STI 感染に対する保護を強化する単独またはエレクトロスピニングとの組み合わせで使用できる有望な代替配信方法があります。

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プロトコル

1 準備とエレクトロスピニング繊維足場の作製

注意: 化学の発煙のフード 。 溶媒と高分子溶液のすべての作業を行わなければならない。プロトコルを開始する前に各試薬の化学物質等安全データシートを参照してください

。

1. Electrospin 3 mL 15%/w PLGA ポリマー溶液に 50: 50 ポリ (乳酸グリコール酸) の 720 mg の重量を量る (PLGA; 0.55 に 0.75 dL/g、31 57 kDa) シンチレーション、10 mL のバイアルに。溶液の量は、現在の研究で使用される典型的なバッチ サイズに基づいています
   。 注: 最初にポリマーを溶解する溶媒の密度を決定することにより溶媒を指定したボリュームに追加する高分子の質量を計算する必要があります。溶剤ヘキサフルオロ-2-プロパノール (HFIP) の密度は、1.59 g/mL です。したがって、溶媒、重量 4.8 g (3.0 mL x 1.59 g/mL) は 3.0 mL HFIP 必要の量に基づきます。HFIP に PLGA の 15%/w 分数 720 mg PLGA は 3.0 mL HFIP (0.15 × 4,800 mg = 720 mg) に追加されていなければなりません。W/v % ではなく、%/w、ポリマー溶液を使用しての利点は、最終的な解決の定義された重量は、これです。この定義された重量 1.3 のステップの間に溶媒の蒸発の場合より正確な溶媒交換が可能です
。
2. を加える (ステップ 1.1) から PLGA を含むバイアル シンチレーション 3.0 mL HFIP 血清学的ガラス ピペットを使用しています。プラスチック フィルムでカバーし、測定し、バイアルを記録マサチューセッツ州
3. では、ポリマーの分解を確保するための 37 ° C で一晩高分子懸濁液を孵化させなさい。溶剤が蒸発する場合は、バイアルのオリジナル ステップ 1.2 質量に達するまで HFIP を追加バイアル質量を減少します
。
4. インキュベーション後、準備エレクトロスピニング装置 ( 図 2 A)。任意のサイズのマンドレルを使用できますが、ここで回転 25 mm 外径ステンレス マンドレル コレクターとして使用された
   。 注: 大きいマンドレル径のエレクトロスピニング ソリューションの同じ量を考えると、繊維の太さが減少します
。
5. 高分子溶液を 3 mL 注射器に吸引します
。
6. 注射器に鈍 18 ゲージ、1/2 インチの針の先端を接続し、針の先端で空のヘッド スペースを削除する余分なソリューション (通常 0.25 mL) を分配します
。
7. シリンジ ポンプの注射器を配置し、2.0 mL/h 計測器の流量を設定
   注: この流量以前に最適化されたこの定式化の樹脂の粘度に基づいています
。
8. 注射針と electrospin する電源ソースに接続 +27 の電圧を用いた高分子溶液 kV。針とコレクター間の距離約 25 cm ( 図 2 B) に設定してください
   。 注意: 静電紡糸プロセスは、溶剤蒸気を作成します。密閉装置 ( 図 2) ヒューム フードを使用して有害な蒸気 . を削除して
9. ソリューション全体はエレクトロスピニング、一度電源をオフにし、溶媒を完全に蒸発させるためさらに 30 分間回転するマンドレルを許可します
。
10. ターン回転マンドレル コレクターとマンドレルから繊維をカットするかみそりの刃を使用しています。優しくマンドレルから繊維の皮をむく、ブレードを使用します
。
11. ラベル付きシャーレにエレクトロスピニング PLGA 繊維を収集し、残留溶媒を除去する desiccatorovernight を配置します
。

2。GRFT 繊維の表面改質

1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 2-(N morpholino) 準備ソリューション ethanesulfonic 酸 (MES バッファー)。8 g 塩化ナトリウム、KCl 0.2 g、1.44 g Na ₂ HPO ₄ と 0.24 g KH ₂ PO ₄ 純水 1 L に溶解して PBS を準備します。同様に、19.52 g MES (遊離酸、MW 195.2) を溶解し、29.22 g MES バッファーを準備、純水 1 L に塩化ナトリウム。各ソリューションの最終 pH が 7.2 7.5 と 5.0-6.0, pH メーターを使用することを確認します
。
2. EDC (2 mM) と NHS (5 mM) の個々 の作業ソリューションを準備します。
   1. 冷凍庫から EDC と NHS を取り外し、計量する前に室温に釣り合うようにします
   。
   2. 1.5 mL 遠心チューブに EDC の 4 mg の重量を量ます
   。
   3. 別の遠心管に NHS の 6 mg の重量を量ます
   。 各管に
   4. 追加 1 mL MES バッファー。試薬を確実に、積極的に両方のチューブは完全に解散した渦
   。
3. 50 mL の円錐形遠心チューブに 70 mg を秤量することによりヒドロキシルアミン溶液を準備します
。
4. ヒドロキシルアミンと溶解する渦に 20 mL の PBS を追加します
。
5. 15 mL の円錐形遠心管に PLGA 繊維の適切な量を質量。反応バッチごとに通常、繊維の 75 mg を使用します
。
6. 15 mL チューブに 8 mL の MES バッファーを追加します
。
7. 追加 1 mL チューブ覚悟以前 EDC と NHS のソリューションの。ソリューションの最終巻は 10 mL をする必要があります。EDC および NHS の最終濃度が 0.4 mg/mL と 0.6 mg/mL をそれぞれする必要があります
。
8. すぐとプラスチック フィルムと室温 ( 図 3 B) で 15 分間ゆっくり反転するソリューションを許可するように回転の場所 15 mL チューブをシールします。この手順を可能にする GRFT 蛋白質 ( 図 3 A) と共有結合修飾、高分子カルボキシルをアクティブにします
。
9. 、アクティブ化後慎重にチューブに β-メルカプトエタノールの 14 μ L を追加することによって反応を抑制します。完全な混合を確実にチューブを数回反転します
   。 注意: β-メルカプトエタノール、毒性と化学の発煙のフードでのみ使用する必要があります
。
10. 上澄みを廃棄し、10 mL の PBS は、任意の残りの β-メルカプトエタノールを削除すると PLGA 繊維を 2 回、リンスします
。
11. 洗浄した後、チューブに GRFT 原液の適切な量を追加します。たとえば、5 nmol GRFT/mg 繊維は繊維の mg あたり (10 mg/mL 在庫) から GRFT 原液の 6.35 μ L を必要があります。10 mg/mL GRFT 原液の 476.25 μ L 75 mg 繊維サンプル必要になりします
    。 注: 0.05、0.5、および 5 nmol GRFT mg ファイバーあたりの理論的荷重 GRFT 繊維を作製します
。
12. 8 mL に最終巻を持って十分な PBS を追加を閉じるし、徹底的な混合を確実にチューブを反転します
。
13. プラスチック フィルムでチューブを封印し、再び、このロータの場所のため 2 時間
14. の後の 2 時間インキュベーションは、ヒドロキシルアミン溶液 2 mL を 15 mL 遠心管に加えることによって反応を癒します。製造元の指示に従って急冷反応中にヒドロキシルアミンの最終濃度が 0.7 mg/mL をする必要があります
。
15. も溶液を混ぜて、上澄みを廃棄します。任意の非 GRFT を削除する 10 mL の純水で 2 回表面改質した PLGA 繊維をすすいでください
。
16. は、繊維が完全に乾燥するまで、デシケータ中ペトリ皿に繊維を転送します。ストレージのための 4 ° C にペトリ皿を転送します
。

3。SEM GRFT 表面特性改質繊維

1. 場所、SEM の炭素の両面テープのストリップ試料マウント。永久的なマーカーを使用してサンプルの識別情報と標本マウント下部のラベルします
。
2. 表面改質の 1 つの繊維からの 3 つのサンプルを切り取って別標本マウントの上に置きます。各サンプルの厚さは約 0.5 mm
。
3. スパッタ コート ゴールド プレートからの電子励起粒子沈着を使用したサンプルです。90 のためのコートをスパッタ s 2.4 kV
   。 注: スパッタ コート時間電圧およびアンペア数を含む機器のパラメーターに応じて異なる場合があります
。
4. 8 でサンプルのイメージ 1000 5 に至るまでの倍率で kV X. 000

4。繊維の表面改質から GRFT の抽出

1. 2 mg 1.5 mL 遠心チューブに 3 通で繊維のうち質量
。
2. 、渦管に 1 mL ジメチルスルホキシド (DMSO) を追加し、繊維を完全に溶解して室温で 1 分間インキュベートします
。
3. インキュベーション後、希釈の 10 μ 因数トリス-EDTA (TE) バッファーの 4.2、100 倍以上のステップから DMSO ファイバー ソリューション (pH 8.0 を =).
4. Elisa 法によるキャラクタリゼーションの読み込みまで-20 ° C でサンプルを格納します
。

5。GRFT 脱繊維を測定

1. リリース GRFT の量を評価、または繊維の表面改質と遠心管の場所の 5-10 mg の重さ、繊維から脱着します。各管に繊維の質量を記録します
。
2. 生理的環境を模倣した適切なソリューションの 1 つの mL を追加 (例えば PBS、TE バッファー、シミュレートされた膣分泌液 (SVF) 等) 各サンプルにします
。
3. 37 200 rpm で回転シェーカーで 1 h のサンプルをインキュベート ° C
4. インキュベーション、クラスターにバイアル、そして因数から脱着 GRFT を含む TE バッファーの削除約 1 mL 管後。プロテインの定量まで-20 ° C でストア
。
5. 新しい微量遠心チューブにサンプルを転送、遠心チューブ内のファイバーに新鮮な緩衝液の 1 mL を追加し、次の時点までインキュベートします
。
6. 典型的な時点でリリースを測定するために使用が含まれます: 1、2、4、6、8、24、48、72 h、および 1 wk. のごくわずかな脱着は 4 h 後これらの研究で観察された

6。GRFT の抽出と elisa 法による脱離の定量化

HA の 0.1 ml

1. コート 96 ウェル ELISA プレート (10 μ G/ml) ウェルあたり ⁵¹ 前述しました。プラスチック フィルムとプレートをシールし、4 ° C ( 図 4) で一晩インキュベートします
。
2. は、コーティング バッファーを削除し、0.3 mL の各ウェルにバッファー (2-3% ウシ血清アルブミン (BSA) PBS で 0.05% ポリソルベート 20 を持つ) をブロックを追加します。少なくとも 2 時間室温でプレートをインキュベートします
。
3. インキュベーション後、すすぎ 3 回で 0.1% ポリソルベート 20 (PBS-P) で 1 × PBS プレート。洗浄した後、それぞれの井戸にネガティブ コントロールとしてサンプル、標準、または PBS の 0.1 mL を分配します。室温で 1 時間を再びプレートをインキュベートします
。
4. リンス PBS P で 3 回再びプレート洗浄した後、一次抗体 (ヤギ抗 GRFT 抗血清) を各ウェルに 0.1 mL を追加し、少なくとも 1 時間室温でインキュベートします。通常、一次抗体のソリューションは、PBS で 1: 10,000 によって希釈される
。
5. インキュベート一次抗体リンス サンプル プレート 3 回再び PBS P で後二次抗体の 0.1 mL を追加 (西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)-共役ウサギの反やぎ IgG) それぞれにも、室温で 1 時間インキュベートします。PBS の 1: 10,000 によって二次抗体溶液を希釈します
。
6. 洗浄 3 回。各ウェルに 0.1 mL TMB 2 ペルオキシダーゼ基質を追加します。発色 (約 2 分) を監視し、追加し、0.1 mL H _{2 4} (1 N) 反応を抑制します。450 でプレートを読むプレート リーダーに nm
。
7. 背景 OD 値 (PBS の受信のみをウェルズ) を平均し、実験群からこれを引いています
。

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結果

繊維形態ウイルスに対する保護を提供するために表面改質した EFs の機能に大きな影響があります。エレクトロスピニングは便利で簡単なプロシージャが、最適化されていないポリマー配合の不規則な繊維形態 (図 5B C) 可能性があります。ビーズや非晶質のマットのような形態の形成で発生する静電紡糸条件の変更について多くの場...

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ディスカッション

それらの多孔質構造と大きな表面積のため EFs は医療、治療薬デリバリー車として、さまざまなアプリケーションを発見しました。一方、生物学的製剤と化学リガンドを細胞特異ターゲット⁵²またはバイオセンシング⁵³繊維表面に共役することができます、薬やその他のアクティブなエージェントを可変配信のため EFs 内組み込むことできます。ここで GRFT ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50	Lactel	B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Thermo Scientific	147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2	Brico Medical Supplies	BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip	VWR	309657
Parafilm (plastic film)	Sigma Aldrich	P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)	Sigma Aldrich	M3671
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S7653
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S7907
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662
Hydroxysuccinimide (NHS)	Thermo Scientific	24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)	Thermo Scientific	22980
2-Mercaptoethanol	Fisher	BP176
Griffithsin (GRFT)	Kentucky Bioprocessing	NA	custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide	Milipore	317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)	Sigma Aldrich	P9416
Tris EDTA Buffer	Sigma Aldrich	93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates	Thermo Scientific	3355
Influenza Hemagglutinin (HA)	Kentucky Bioprocessing	NA	custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)	Kentucky Bioprocessing	NA	custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)	Santa Cruz	2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate	KPL	52-00-00