JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu el yazması imal ve insan immün yetmezlik virüsü tip 1 bulaşmasına karşı güçlü yapıştırıcı ve antiviral faaliyet göstermek Griffithsin-modified Poli (laktik-co-glikolik asit) electrospun lifler karakterize için yordamı açıklar vitro. Sentez için kullanılan bir yöntem yüzey-değiştirmek ve elde edilen morfolojisi, konjugasyon, karakterize ve Griffithsin desorpsiyon yüzey-modified liflerinden açıklanmıştır.

Özet

Electrospun lifleri (EFs) çeşitli terapötik uygulamalarda yaygın olarak kullanmış; önlemek ve cinsel tedavi için bir teknoloji bulaşan enfeksiyonların (CYBE) gibi Ancak, onlar sadece son zamanlarda uygulanmış. Ayrıca, birçok EF teknolojileri kullanan biofunctionality vermek için yüzeye göre etkin aracı Kapsüllenen odak. Burada imal ve yüzey-poly(lactic-co-glycolic) asit (PLGA) electrospun lifleri, güçlü antiviral lektin Griffithsin (GRFT) ile değiştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. PLGA yaygın ilaç dağıtım onun üstün kimyasal ve Biyouyumlu özellikleri nedeniyle içinde kullanılan FDA onaylı bir polimerdir. GRFT, güçlü, doğal ve insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) dahil olmak üzere çok sayıda virüslere karşı geniş faaliyet sahip güvenli lektin var. Birleştirildiğinde, GRFT-modified lifleri HIV-1 vitrogüçlü inactivation gösterdi. Bu el yazması imal ve GRFT-modified EFs karakterize yöntemleri açıklar. PLGA electrospun fiber iskele oluşturmak için ilkidir. Lifleri GRFT 1'i kullanarak daha sonra yüzey modifiye-etil - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) ve N-hydroxysuccinimide (NHS) Kimya. Elektron mikroskobu (SEM) tarama boyutu ve yüzey-modified formülasyonları morfolojisi değerlendirmek için kullanıldı. Ayrıca, bir gp120 veya hemagglutinin (HA)-tabanlı ELISA için Birleşik GRFT yanı sıra GRFT desorpsiyon fiber yüzeyinden miktarını ölçmek için kullanılan. Bu iletişim kuralı yüzey-modified farklı proteinler çeşitli ile lifleri imal etmek daha yaygın olarak uygulanabilir.

Giriş

EFs kullanımı bir topikal teslim platformu olarak önemli ölçüde cinsel yolla bulaşan hastalıklar azaltmak potansiyeline sahiptir. Şu anda içinde bildirilen 2015 yalnız1,22 milyon yeni vaka ile HIV ile yaşayan 36 milyondan fazla kişi vardır. Ayrıca, herpes simpleks virüsü 2 (HSV-2) enfeksiyon etkiler yüz milyonlarca insanın dünya çapında yazın ve HIV edinme geliştirmek için 2-5 kat3tarafından gösterilmiştir. HSV-2 enfeksiyon ve HIV edinme arasındaki bu ilişki nedeniyle, birden çok cinsel yolla bulaşan hastalıklar karşı eş zamanlı koruma sağlamak yeni active aracıları gelişmekte olan faiz önemli vardır. Ayrıca, bu antiviral ajanlar teslimini geliştirmek için yeni araçların gelişimi daha fazla koruyucu ve tedavi edici etki gücü arttırmak için potansiyel sunmaktadır. Bu hedefe doğru EFs HIV-1 ve HSV-2 enfeksiyonları yaygınlığını azaltmak için yeni bir dağıtım platformu araştırdık.

Son iki yılda, EFs yoğun ilaç dağıtım ve doku Mühendisliği4alanlarında kullanılmaktadır. Çoğu zaman, Biyouyumlu polimerler kolayca tedavi edici uygulamalara çevirmek için seçilir. Seçili polimer polimer EFs imal etmek, organik bir çözücü veya sulu çözüm, polimer hydrophobicity5derecesine bağlı olarak feshedilmiştir. Etkin faiz ajanların sonra çözelti veya sulu çözüm electrospinning işlemi önce eklenir. Polimer çözüm bir şırınga emişli ve yavaş yavaş bir elektrik akımı iken tabi atılır. Bu işlem genellikle polimer lifleri levha veya silindirik macrostructures (şekil 1) ve mikro-nano ölçekli6arasında değişen elyaf çapları ile sonuçlanır. En terapötik uygulamalarda etkin ajanlar içinde lifleri electrospinning işlemi sırasında dahil edilmiştir ve fiber Difüzyon ve sonraki lif dejenerasyonu ile serbest bırakılır. Bozulma ya da yayın oranını polimerlerin farklı türleri kullanarak değişmiş olabilir veya benzersiz kimyasal ve fiziksel özellikleri7imparting ve teşvik encapsulation hemen hemen herhangi bir istenen yayın profili kurmak için polimer karışımları bileşik. Bu nedenle, EFs küçük molekül ilaç ve biyolojik ajanlar proteinler, peptidler, oligonucleotides ve büyüme faktörleri6,8,9dahil olmak üzere teslim için yararlı kanıtlanmış.

Şti önleme alanında, EFs son zamanlarda dahil ve sürekli - veya indüklenebilir-serbest bırakmak-in antiviral ajanlar10,11,12,13,14 sağlamak için kullanılmıştır ,15,16,17,18,19. Bir ilk çalışmalar, pH-duyarlı lifler içinde kadın üreme sistemi (FRT), çevresel değişiklikler active aracıları serbest bırakmak için bir isteğe bağlı yöntemi HIV-111karşı koruma olarak geliştirilmiştir. Beri diğer çalışmaları polimer karışımları polietilen oksit (PEO) ve poli-L-laktik asit (PLLA), antiviral ve doğum kontrol maddeleri, HIV-1 önleme ve doğum kontrolü içinde in vitro için ayarlanabilir sürümü değerlendirmek için oluşan araştırdık 12. ek çalışmalar aşağıdakileri sağlamak için EFs fizibilite göstermiştir: uzun süreli yayın küçük molekül antiviral14, güçlü ve esnek mekanik özellikleri20, 3-b teslim mimarileri21 , sperm penetrasyon12ve diğer dağıtım teknolojileri13ile birleştirebilme inhibisyonu. Son olarak, daha önceki çalışma sürekli teslimat ortak co-infective virüs, HSV-2 ve HIV-114karşı antiviral ajanlar için polimerik lifler değerlendirildi. Bu çalışmada, polimer lifleri ilâ 1 ay için onların yapısını koruyarak ve viral giriş fiziksel bir engel sağlayarak tamamlayıcı faaliyet antiviral teslimat için sağlanan. Bu sonuçlar, EFs hem fiziksel hem de kimyasal olarak virüs enfeksiyonu engellemek için kullanılan görülmüştür.

Akort yayın özellikleri microbicide teslimat için bir çekici teslim platform polimer EFs yaparken, EFs diğer uygulamalarda yüzey-modified iskele7olarak hizmet etmek için geliştirilmiştir. EFs kez hücresel yenilenme22artırmak ve doku Mühendisliği23,24onların programını geliştirmek için iskele görevi gören hücre dışı Matriks (ECM), Morfoloji taklit etmek için kullanılmaktadır. Poli-ε-caprolactone (PCL) gibi polimerler oluşur lifleri ve PLLA-si olmak be yüzey-büyüme faktörleri ve proteinler ile modifiye electrospinning sonra artan hücre adezyon ve nükleer silahların yayılmasına karşı25 dahil ECM benzeri özellikleri vermek için , 26. Ayrıca, antimikrobiyal yüzey-modified EFs özel Patojen bakteriler27,28gelişimini önlemek için değerlendirilir. Bu çok yönlülük ve biyolojik etkileri ikna yeteneği nedeniyle EF teknoloji alanları çok mekanik işlevsellik sağlamak için çeşitli genişletmeye devam ediyor. Henüz, rağmen onların yardımcı programında uygulamaları bir çeşitlilik, yüzey-modified lifleri yakın zamanda microbicide alan29araştırılmalıdır.

Paralel olarak önlemek ve cinsel yolla bulaşan hastalıklar tedavi için yeni iletim teknolojileri geliştirilmesi, roman biyolojik tedavi geliştirilmiştir. En umut verici microbicide adaylar biridir yapışkanlı antiviral lektin, GRFT30. Aslında bir tür red algae türetilmiş, GRFT HIV, HSV-2, SARS, güçlü bir inhibitörü olarak faaliyet göstermiş olduğu hem de Hepatit C virüs31,32,33,34, 35 , 36. aslında, biyolojik tabanlı inhibitörleri arasında GRFT en güçlü Anti-HIV etkinlik, HIV-1 hemen ihracı kişi30, istikrar ve etkinlik vajinal kültür ortamından huzurunda koruyarak vardır En çok 10 gün37için mikroplar. Daha yakın zamanlarda, % 0,1 GRFT jel fareler intravaginal HSV-2 challenge, HSV-2 ve HIV-132 karşı koruma ilk satırı için umut verici bir aday yapmak karşı korumak için gösterildi, 38. HIV için özel olarak, fiziksel olarak giriş38,39,40,41 önlemek için viral zarf yüzeylerde gp120 veya terminal mannoz N bağlı glycan artıkları bağlayarak GRFT enfeksiyon engeller ,42. Bu inhibisyon 3 ng/mL43yaklaşan IC50s ile son derece güçlü. HIV enfeksiyonu inhibe yanı sıra, çalışmalar da GRFT virüs32hücre hücre yayılmasını engelleyerek HSV-2 enfeksiyona karşı korur göstermiştir. Her durumda, denatürasyon karşı yüksek direnç gösteren sırasında viral parçacıkların, yapıştırıcı olmak GRFT gösterilmiştir. Son, GRFT uygun ve büyük olasılıkla EFs ile birlikte yönetmek yararlı hale Tenofovir (TFV) ve diğer antiviral44, kombinasyonları ile sinerjik faaliyet göstermiştir. GRFT güçlü özelliklerini içinde teslim EF teknoloji ile geliştirilmiş bir mükemmel biyolojik tabanlı antiviral aday olun.

Bu bilgi GRFT ya da doğuştan gelen antiviral özellikleri kullanmak, bir polimer fiber iskele, virüs giriş inhibisyon29ilk katmanı sağlamak için bu özellikleri entegre dizayn edilmiştir. Bulgu Inspiration cervicovaginal mukus mucoadhesive müsin etkileşimler yoluyla öncelikle virüs ulaşım engel şekilde, biz bu EFs bir iskele kullanarak ve kovalent GRFT, yüksek yoğunluğu ile yüzey değiştirme onaylanmadığına karar yüzey Birleşik GRFT debilitate ve onun giriş noktası45,46,47virüs devre dışı bırakabilirsiniz. Burada EFs bir protein bazlı, viral yapıştırıcı ihracı bariyer platformu sağlamak için sabit bir iskele geliştirilmiştir. Biz GRFT güçlü antiviral özellikleri "tuzak" roman bir virüs oluşturmak için Biyouyumlu, değiştirilebilir ve dayanıklı polimer platform ile birleştirmek aranan

Bu hedeflere ulaşmak için electrospun PLGA oluşan lifler vardı ve EDC NHS kimya GRFT EF yüzeyle daha sonra değiştirmek için kullanılmıştır. PLGA electrospinning48Biyouyumluluk ve maliyet-etkililik ile birlikte, geniş kullanımı nedeniyle bir modeli polimer olarak görev yaptı. Ayrıca, yüzey modifikasyonu EFs büyük yüzey alanı kullanan ve lif yardımcı programı49en üst düzeye çıkarmak için kapsülleme ile kombine edilebilir yararlı bir alternatif sağlar. Nerede GRFT yalnızca bir bölümünü mevcuttur (ve yalnızca geçici FRT mevcut) geleneksel saklama yöntemlerinden farklı olarak, yüzey modifikasyonu GRFT maksimum bioactivity tedavi süresi sırasında korumak izin verebilir. Ayrıca, geleneksel electrospinning yöntemlerle proteinler gibi hidrofilik bileşikler birleşmesiyle daha düşük kapsülleme verimliliği ve protein etkinlik50kaybı neden olabilir. Bu nedenle, GRFT yüzey-modified lifleri Şti bulaşmasına karşı koruma geliştirmek için tek başına veya electrospinning birlikte kullanılabilir umut verici bir alternatif Teslimat yöntemi sunabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. hazırlanması ve Electrospun Fiber iskele imalatı

dikkat: çözücüler ya da polimer çözümleri ile tüm iş-meli var olmak kılınmak kimyasal duman mahallede . Protokol başlamadan önce her reaktif malzeme güvenlik veri sayfasına bakın.

  1. 50: 50 Poli (laktik-co-glikolik asit) 720 mg 3 mL % 15 w/w PLGA polimer çözüm electrospin için tartmak (PLGA; 0,55-0,75 dL/g, 31-57 kDa) bir 10 mL mercek şişe içine. Çözüm hacmi geçerli çalışmalarda kullanılan tipik toplu iş boyutu dayanır.
    Not: polimer çözülmeye kullanılan çözücü yoğunluğunu belirleyerek solvent belirli bir birime eklemek için polimer kitle hesaplanmalıdır. 1.59 g/mL çözelti Hexafluoro-2-propanol (HFIP) yoğunluğudur. Böylece, solvent, ağırlığı 3,0 mL HFIP gerekli bir birimde, 4.8 g (3,0 mL x 1.59 g / mL) uyarlanmıştır. Bir % 15 w/w kısmını HFIP için PLGA için 720 mg PLGA 3,0 mL HFIP (0.15 x 4800 mg = 720 mg) eklenmesi gerekir. Bir % w/w polimer/çözüm yerine % w/v, kullanmanın avantajı, bu nihai çözüm tanımlanmış ağırlığını sağlamasıdır. Tanımlanan bu ağırlık çözücü buharlaşma sırasında adım 1.3 durumunda daha doğru solvent değiştirme etkinleştirir.
  2. PLGA (adımından 1.1) içeren cam mercek şişe 3,0 mL HFIP eklemek serolojik cam pipet kullanarak. Plastik film ile şişe kapağı sonra ölçmek ve şişe kayıt Mass
  3. Gecede 37 ° C'de polimer tam çözünme sağlamak için polimer süspansiyon kuluçkaya. Herhangi bir çözücü buharlaşarak, şişe kitle, azalan ekleyerek HFIP şişe özgün kütlesiyle adım 1.2 ulaşıncaya kadar.
  4. Kuluçka sonra electrospinning aparatı ( Şekil 2 A) hazırlamak. Her boyuttaki bir mandrel kullanılabilir olmasına rağmen burada dönen bir 25 mm dış çap paslanmaz çelik mandrel toplayıcı kullanıldılar.
    Not: Electrospinning çözüm aynı hacmi verilen fiber kalınlığı daha büyük bir mandrel çapı azalır.
  5. Polimer çözüm 3 mL şırınga Aspire edin.
  6. Bir künt 18'lik, ½ inç iğne ucu şırıngaya bağlanmak ve boş headspace iğne ucunu kaldırmak için aşırı çözüm (genellikle 0.25 mL) dağıtmak.
  7. Şırınga şırınga pompa yerleştirin ve araç akış hızı 2.0 mL/h. için ayarla
    Not: Bu akış hızı daha önce bu formülasyon için polimer viskozite göre optimize edildi.
    8. Şırınga iğne ve electrospin
  8. bağlanmak güç kaynağı bir gerilim + 27 kullanarak polimer çözüm kV. İğne ve toplayıcı arasındaki mesafe yaklaşık 25 cm ( Şekil 2 B) ayarlamanız gerekir.
    Dikkat: Bir çözücü buharı electrospinning işlemi oluşturur. Zararlı buharı . kaldırmak için bir duman başlık veya kapalı bir aparat ( Şekil 2) kullanın
  9. Tüm çözüm electrospun olduğunda, güç kaynağı açmak ve bir ek 30 tam solvent buharlaşır min için dönmeye mandrel izin.
  10. Dönüş dönen mandrel toplayıcı kapalı ve jilet mandrel elyaf kesmek için kullanın. Yavaşça mandrel elyaf soymak için bıçak kullanın.
  11. Electrospun PLGA fiber etiketli bir Petri kabına toplamak ve yer kalan solvent kaldırmak için bir desiccatorovernight.

2. Yüzey-değişiklik lifleri ile GRFT

  1. hazırla çözümleri fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ve 2-(N-morpholino), ethanesulfonic asit (MES arabellek). PBS 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na 2 HPO 4 ve 0,24 g KH 2 PO 4 ' te ultrasaf su 1 litre çözülerek hazırlayın. Benzer şekilde, 19.52 g MES (serbest asit, MW 195.2) dağıtılması ve 29.22 g NaCl MES arabellek hazırlamak için 1 L ultrasaf su, içinde. Her çözüm son pH 7.2-7.5 ve 5.0-6.0, arasında sırasıyla, pH metre kullanarak sağlamak.
  2. NHS (5 mM) ve EDC (2 mM) bireysel çalışma çözümleri hazırlayın.
    1. EDC ve NHS dondurucudan kaldırmak ve tartma önce oda sıcaklığına equilibrate etmelerine izin.
    2. EDC 4 mg 1.5 mL microcentrifuge tüp içine tartmak.
    3. NHS 6 mg başka bir microcentrifuge tüp içine tartmak.
      4. Her tüpün arabelleğe
    4. ekleyin 1 mL MES. Girdap şiddetle reaktifleri emin olmak için her iki tüpler tam çözünmüş.
  3. 70 mg 50 mL konik santrifüj tüpüne ağırlığında tarafından hydroxylamine çözeltisi hazırlamak.
  4. 20 mL PBS hydroxylamine ve çözülmeye girdap ekleyin.
  5. PLGA fiber uygun bir miktar dışarı kitle içine 15 mL konik santrifüj tüpü. Genellikle, fiber 75 mg her reaksiyon toplu işlem için kullanılır.
  6. 15 mL tüp MES arabellek 8 mL ekleyin.
  7. Ekleyin 1 mL her tüp daha önceden hazırlanmış EDC ve NHS çözümleri. Çözüm son hacmi 10 mL olmalıdır. EDC ve NHS son konsantrasyonları 0.4 mg/mL ve 0.6 mg/mL, sırasıyla olmalıdır.
  8. Yakın ve plastik film ve çözüm 15 dakika oda sıcaklığında ( şekil 3 B) yavaşça ters için izin vermek için bir rotator üzerinde yer ile 15 mL tüp mühür. Bu adımı GRFT protein ( şekil 3 A) ile kovalent değişiklik için izin vermek için polimer karboksil grupları etkinleştirir.
  9. Harekete geçirmek sonra dikkatli bir şekilde gidermek tepki tüp β-mercaptoethanol 14 µL ekleyerek. Tüp birkaç kez tam karıştırma sağlamak için ters çevir'i.
    Dikkat: β-mercaptoethanol çok zehirli ve yalnızca bir kimyasal duman mahallede kullanılmalıdır.
  10. Süpernatant atmak ve PLGA fiber iki kez, 10 mL ile kalan herhangi bir β-mercaptoethanol kaldırmak için PBS, durulama.
  11. Sonra durulama, GRFT hisse senedi çözüm uygun bir miktarda tüp ekleyin. Örneğin, 5 nmol GRFT/mg fiber GRFT mg fiber başına (Stoktan 10 mg/mL) hisse senedi çözüm 6,35 µL gerektirecektir. Böylece bir 75 mg lif örneği 10 mg/mL GRFT hisse senedi çözüm 476.25 µL gerektirecektir.
    Not: GRFT lifleri 0,05, 0.5 ve 5 nmol GRFT mg fiber başına teorik yükleri ile fabrikasyon.
  12. Son hacim 8 mL için getirmek için yeterli PBS eklemek kapatın ve ayrıntılı karıştırma sağlamak için tüp ters.
  13. Plastik film ile tüp mühür ve bir rotor üzerinde tekrar, burası 2 h. süre
  14. Sonra 2 s kuluçka, 2 mL hydroxylamine çözeltisi 15 mL santrifüj tüpüne ekleyerek tepki gidermek. Üreticinin yönergelerini hydroxylamine son konsantrasyonu su verme reaksiyon sırasında 0.7 mg/mL olmalıdır.
  15. Çözüm karıştırın ve süpernatant atın. Yüzey-modified PLGA fiber herhangi bir çekimsiz GRFT kaldırmak için iki kez 10 mL ultrasaf su ile durulama.
    16. Lif tamamen kuru olana
  16. fiber bir Petri kabına ve yer bir desiccator içine aktarın. Depolama için 4 ° C Petri kabına aktarın.

3. SEM GRFT yüzey karakterizasyonu-modified lifleri

  1. yer bir SEM üzerinde çift taraflı karbon bandın bir şerit numune Dağı. Numune mount dibinde kalıcı bir kalem kullanarak örnek tanıtıcı bilgiler ile etiketleyin.
  2. Üç örnek bir yüzey-modified fiber keser ve onları ayrı örnek bağlar yerleştirir. Her örnek kalınlığı yaklaşık 0.5 mm olan.
  3. Sputter bir altın plaka elektron kaynaklı partikül ifade kullanarak örnekleri kat. Kat 90 için şaplatın s, 2.4 kV.
    Not: Sputter kat zaman gerilim ve amperaj dahil olmak üzere donanım parametreleri bağlı olarak değişebilir.
  4. Örnekleri resim 8 kV 1000 5'e kadar bir büyütme ile 000 X.

4. GRFT ayıklama yüzey-modified liflerinden

  1. kitle dışarı nüsha 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine lif 2 mg.
  2. Tüp, sonra girdap 1 mL Dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve lif tamamen erimesi için oda sıcaklığında 1 dk. için kuluçkaya.
  3. Kuluçka sonra 10 µL aliquot, seyreltik Tris-EDTA (TE) arabellek 4.2, en az 100-fold adımda DMSO lifli çözümden (pH = 8.0).
  4. Karakterizasyonu ELISA ile yükleme kadar örnekleri-20 ° C'de depolayın.

5. GRFT desorpsiyon liflerinden ölçme

  1. GRFT serbest miktarını değerlendirmek veya fiber desorbed 5-10 mg lif yüzeyi değiştirilme tarihi ve yeri bir microcentrifuge tüp tartmak için. Fiber kitle her tüpte kaydetmek.
  2. 1 mL fizyolojik ortamı taklit eden uygun bir çözüm ekleyin (örneğin, PBS, TE arabellek, benzetimli vajinal sıvı (SVF), vb) her bir örneği için.
  3. Örnekleri üzerinde dönen bir shaker 200 devirde, 37 1 h için kuluçkaya ° C.
    4. Kuluçka, küme için şişe ve aliquot GRFT desorbed içeren TE arabellek Kaldır yaklaşık 1 mL tüpler sonra
  4. . -20 ° c protein miktar kadar mağaza.
  5. , Örnek için yeni bir microcentrifuge tüp transfer fiber microcentrifuge tüp içinde 1 mL taze tampon çözeltisi ekleyin ve sonraki zaman noktasına kadar kuluçkaya.
  6. Yayın ölçmek için kullanılan tipik süresi noktalar şunlardır: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, ihmal edilebilir desorpsiyon sonra 4 h bu çalışmalarda gözlenen 72 s ve 1 wk.

6. Miktar GRFT ayıklama ve desorpsiyon ELISA ile

  1. kat bir 96-Peki ELISA plaka ile ha 0.1 mL (10 µg/mL) iyi daha önce 51 açıklandığı gibi. Plastik film ile plaka mühür ve bir gecede kuluçkaya 4 ° C'de ( şekil 4).
  2. Kaplama arabellek kaldırın ve 0.3 mL arabelleğe her şey (% 2-3 sığır serum albumin (BSA) PBS içinde % 0.05 polysorbate 20 ile) engelleme ekleyin. Oda sıcaklığında en az 2 h plaka kuluçkaya.
  3. 3 kez ile 1 x PBS % 0,1 polysorbate 20 (PBS-P) ile plaka kuluçka sonra durulayın. Durulama sonra örnek, standart veya PBS 0.1 mL negatif kontrol ilgili kuyu dağıtmak. Oda sıcaklığında 1 h için tekrar plaka kuluçkaya.
  4. Plaka PBS-s. 3 kez tekrar durulama Durulama sonra birincil antikor (keçi anti-GRFT anti-serum) her kuyuya 0.1 mL ekleyin ve oda sıcaklığında en az 1 h için kuluçkaya. Tipik olarak, birincil antikor çözüm tarafından PBS 1:10,000 sulandırılmış.
    5. Sonra birincil antikor durulama örnekleriyle plakalar tekrar 3 kez PBS-s. ile kuluçka
  5. İkincil antikor 0.1 mL ekleyin (horseradish peroksidaz (HRP)-konjüge tavşan Anti-keçi IgG) her şey ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. İkincil antikor çözüm tarafından PBS 1:10,000 sulandırılmış.
  6. Plaka 3 kez yıkayın. 0.1 mL TMB 2-peroksidaz substrat her şey için ekleyin. Monitör renk geliştirme (yaklaşık 2 dk), sonra 0.1 mL H 2 Yani ekleyin tepki gidermek için 4 (1 N). 450 plaka okumak plaka okuyucu üzerinde nm.
  7. Arka plan OD değerleri (kuyu) sadece PBS almak ortalama ve bu deneysel gruptan çıkarın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Lif morfolojisi EFs yüzeyi değiştirilen virüslere karşı koruma sağlama yeteneği üzerinde önemli bir etkisi vardır. Her ne kadar electrospinning uygun ve kolay anlaşılan bir işlemdir, polimer olmayan optimize formülasyonları düzensiz lif morfolojisi (şekil 5B-C) neden olabilir. Boncuklu veya amorf mat gibi türleri Morfoloji oluşumuna neden electrospinning koşullarında değişiklikler genellikle solvent-polimer uyumsuzluk,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Onların gözenekli yapıları ve geniş yüzey alanları nedeniyle, EFs sağlık, hangi birini tedavi teslim araç olarak hizmet içeren çeşitli uygulamalar bulduk. Destekte ve kimyasal ligandlar lif yüzeyine hücre özel hedefleme52 veya biosensing53için Birleşik iken EFs içinde uyuşturucu ve diğer active aracıları tunable teslimat için dahil edilebilir. Burada GRFT imalatı yüzey-PLGA EFs, HIV enfeksiyonu önlemek için bir teslimat iskele anlatılan biçimde...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu araştırma fonu için mükemmellik için Yahudi miras Fonu için minnettarız. Dr. Stuart Williams II cömertçe electrospinning sisteminin kullanımı sağlamak için teşekkür ederiz. Biz de Dr. Kenneth Palmer bize Griffithsin ile verdiğiniz için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr Nobuyuki Matoba ve laboratuarını GRFT ELISA içimizde iş eğitim için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50LactelB6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)Thermo Scientific 147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2Brico Medical SuppliesBN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tipVWR309657
Parafilm (plastic film)Sigma AldrichP7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)Sigma AldrichM3671 
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653
Potassium ChlorideSigma AldrichP9333
Sodium phosphate dibasicSigma AldrichS7907
Potassium phosphate monobasicSigma AldrichP0662
Hydroxysuccinimide (NHS)Thermo Scientific 24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)Thermo Scientific 22980
2-MercaptoethanolFisherBP176
Griffithsin (GRFT)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Dimethyl SulfoxideMilipore317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)Sigma AldrichP9416 
Tris EDTA BufferSigma Aldrich93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well PlatesThermo Scientific 3355
Influenza Hemagglutinin (HA)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)Santa Cruz2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase SubstrateKPL52-00-00

Referanslar

  1. Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
  2. Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
  4. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  5. Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
  6. Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
  7. Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  8. Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
  9. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  10. Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
  11. Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
  12. Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792(2012).
  13. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  14. Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
  15. Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
  16. Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
  17. Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
  18. Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
  19. Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
  20. Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  21. Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
  22. Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
  23. Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108(2010).
  24. Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
  25. Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
  26. Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
  27. Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
  28. Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
  29. Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
  30. Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
  31. Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
  32. Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
  33. O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
  34. Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
  35. Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
  36. Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
  37. Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635(2011).
  38. Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
  39. Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
  40. Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
  41. Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
  42. Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
  43. O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
  44. Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
  45. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
  46. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
  47. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
  48. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
  49. Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
  50. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
  51. Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
  52. Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
  53. Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
  54. Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
  55. Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
  56. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
  57. Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
  58. Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
  59. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
  60. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
  61. Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
  62. Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
  63. Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
  64. Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
  65. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  66. Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksorunu 128Electrospun liflericinsel bula an enfeksiyonlarinsan imm n yetmezlik vir sy zey de i tirmemicrobicideGriffithsinPoli laktik co glikolik asit

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır