JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта рукопись описывает порядок изготовления и характеризуют Griffithsin модифицированные поли (молочно co гликолевая кислота) electrospun волокон, которые демонстрируют мощный клей и противовирусной активностью против инфекции вируса иммунодефицита человека типа 1 в пробирке. Методы, используемые для синтеза, поверхность изменить и характеризуют результате морфологии, сопряжения, и описаны десорбции Griffithsin от поверхности модифицированные волокна.

Аннотация

Electrospun волокна (EFs) широко используются в различных лечебных приложений; Однако они только недавно были применены как технология для профилактики и лечения сексуально половым путем (ИППП). Кроме того многие технологии EF сосредоточиться на инкапсулирования активного агента, относительно использования поверхности для придания biofunctionality. Здесь мы опишем способ изготовления и поверхности изменить poly(lactic-co-glycolic) кислоты (PLGA) electrospun волокон, с мощным противовирусным лектина Griffithsin (GRFT). PLGA является FDA утвержденных полимер, который широко используется в доставки лекарств из-за его выдающиеся свойства химические и биосовместимых. GRFT — естественный, мощным и безопасной Лектин, которая обладает широкой деятельности против многочисленных вирусов, включая тип вируса иммунодефицита человека 1 (HIV-1). При сочетании, GRFT-модифицированные волокна продемонстрировали мощным инактивации ВИЧ-1 в пробирке. Эта рукопись описывает методы изготовления и характеризуют изменение GRFT EFs. Во-первых PLGA является electrospun для создания волокна леску. Волокна, впоследствии изменения поверхности с GRFT с помощью 1-этил - 3-(3-dimethylaminopropyl) Карбодиимиды (EDC) и N-оксисукцинимидного (NHS) химии. Растровая электронная микроскопия (SEM) был использован для оценки размера и морфологии поверхности модифицированные составы. Кроме того gp120 или гемагглютинина (HA)-на основе ELISA может использоваться для количественной оценки суммы GRFT, конъюгированных с, а также GRFT десорбции с поверхности волокна. Этот протокол может быть более широко применяется для изготовления волокон, которые изменения поверхности с целым рядом различных белков.

Введение

Использование EFs в качестве актуальные доставки платформы имеет возможность значительно сократить ИППП. В настоящее время есть более 36 миллионов человек, живущих с ВИЧ, с более чем двух миллионов новых случаев сообщалось в 2015 году только1,2. Кроме того вирус простого герпеса типа 2 (ВПГ-2) инфекции затрагивает сотни миллионов людей во всем мире и показало активизировать приобретения ВИЧ 2-5 раза3. Из-за этого отношения между инфекции HSV-2 и инфицирование ВИЧ существует значительный интерес к разработке новых активных агентов, которые обеспечивают одновременно защиту от нескольких ИППП. Кроме того развитие новых транспортных средств для улучшения доставки этих противовирусных агентов предлагает потенциал для дальнейшего повышения защитных и терапевтические потенции. Достижение этой цели как новая платформа доставки для уменьшения распространенности инфекции ВИЧ-1 и HSV-2 были расследованы EFs.

В течение последних двух десятилетий EFs широко используются в области доставки лекарств и ткани инженерных4. Часто Биосовместимых полимеров выбраны легко перевести для терапевтического применения. Для изготовления полимерных EFs, выбранного полимера растворяется в органических растворителей или водный раствор, в зависимости от степени полимера гидрофобность5. Активные агенты интерес затем добавляются растворителей или водный раствор до процесса electrospinning. Раствор полимера затем наддува в шприц и медленно выбрасывается при условии электрического тока. Этот процесс обычно приводит к полимерных волокон с листа или цилиндрических макростроение (рис. 1) и волокно диаметров от микро нано-6. Для приложений, наиболее терапевтических активные агенты включены в пределах волокна во время процесса electrospinning и выпускаются из волокна через диффузии и последующих волокна деградации. Скорость деградации или освобождения могут быть изменены с использованием различных типов полимеров или полимерные смеси создать профиль нужного выпуска, передаче уникальные химические и физические свойства7, а также содействие инкапсуляции практически любого соединения. Таким образом EFs оказались полезными для доставки лекарств малые молекулы и биологических агентов, включая белков, пептидов, олигонуклеотиды и факторы роста6,8,9.

В области профилактики ИППП EFs недавно использовались для включения и обеспечить устойчивый - или индуцибельной релиз противовирусных агентов10,11,12,13,14 ,,1516,,1718,19. В одном из ранних исследований рН отзывчивым волокна были разработаны для выпуска активных агентов в ответ на экологические изменения в рамках женского репродуктивного тракта (ФРТ), как метод по требованию защиты от ВИЧ-111. Поскольку другие исследования изучили полимерных смесей состоит из полиэтилена оксид (ПЭО) и поли L-молочная кислота (PLLA), оценить перестраиваемый выпуска агентов противовирусное и контрацептивов для контрацепции и профилактики ВИЧ-1 в в пробирке 12. Дополнительные исследования продемонстрировали целесообразность EFs предоставлять следующее: длительное освобождение малых молекул противовирусные препараты14, сильный и гибкие механических свойств20, 3-D доставки архитектуры21 , ингибирование спермы проникновения12и возможность слияния с другими технологии доставки13. Наконец Предыдущая работа оценивала полимерных волокон для устойчивой доставки противовирусных агентов против co-infective вирусам, HSV-2 и14ВИЧ-1. В этом исследовании Полимерные волокна предоставляемых дополняет деятельность к противовирусным доставки, сохраняя их структуру до 1 месяца и предоставляя физический барьер для вирусный вход. Из этих результатов было отмечено, что EFs может использоваться для физически и химически препятствовать вирусной инфекции.

В то время как перестраиваемый релиз свойства делают полимерных EFs платформу привлекательным доставки для доставки микробицидов, EFs были разработаны в других приложениях в качестве поверхности модифицированные подмостей7. Файловая система eFs были использованы для имитации морфология внеклеточного матрикса (ECM), часто действуя в качестве подмости для улучшения клеточной регенерации22и повышения их полезности в ткани, инженерных23,24. Белки состоят из полимеров, таких как поли ε-капролактана (PCL) и PLLA были изменения поверхности с факторами роста и белков после electrospinning для придания ECM-как свойств, включая повышение клеточной адгезии и распространение25 , 26. Кроме того, были оценены антимикробной поверхности модифицированные EFs для предотвращения роста конкретных патогенных бактерий27,28. Благодаря этой гибкости и способности побудить биологические эффекты EF технология продолжает расширяться в различных областях предоставлять несколько механистических функциональность. Тем не менее несмотря на их полезность в разнообразие приложений, поверхность модифицированные волокна только недавно были изучены в поле микробицидов29.

Параллельно с развитием новой технологии доставки для профилактики и лечения ИППП были разработаны новые биологической терапии. Одним из наиболее перспективных кандидатов микробицида является клей противовирусное Лектин, GRFT30. Первоначально производным от видов красных водорослей, GRFT продемонстрировал активность как мощным ингибитором ВИЧ, HSV-2, ОРВИ, а также гепатит C вирус31,,3233,34, 35 , 36. В самом деле, среди биологически на основе ингибиторов, GRFT имеет наиболее мощным анти-ВИЧ активность, инактивации ВИЧ-1 почти сразу же после контакта30, при сохранении стабильности и активности в присутствии СМИ культуры из влагалища микробы на срок до 10 дней-37. Совсем недавно 0,1% гель GRFT было показано для защиты мышей против интравагинального вызов ВПГ-2, что делает его перспективным кандидатом на первой линии защиты от ВПГ-2 и ВИЧ-1-32, 38. для ВИЧ специально, GRFT подавляет инфекцию, физически привязки gp120 или терминал маннозы N-связаны glycan остатков на поверхности вирусный конверт для предотвращения вступления38,,3940,41 ,42. Это торможение является сильнодействующим, с IC50s приближается 3 нг/мл43. В дополнение к ингибирования ВИЧ-инфекции, исследования также показали, что GRFT защищает от инфекции HSV-2 путем ингибирования к ячейке распространения вируса32. Во всех случаях GRFT было показано, чтобы быть клей для вирусных частиц, демонстрируя высокое сопротивление денатурации. Наконец GRFT продемонстрировал синергизма деятельности с комбинациями тенофовир (TFV) и другие противовирусные препараты44, что делает его возможным и, вероятно, целесообразно совместно администрировать с помощью EFs. Мощные свойства GRFT делают его отличным биологически на основе противовирусное кандидата, в котором доставки может быть повышена с EF технологии.

Используя это знание клей и врожденный противовирусными свойствами GRFT, полимерное волокно леску был разработан, что объединяет эти свойства, чтобы предоставить первый слой вирус вход ингибирование29. Найти вдохновение в том, что цервиковагинальных слизь мешает вирус транспорта главным образом через mucoadhesive муцина взаимодействия, мы предположили, что с помощью EFs как леску и ковалентно модификации поверхности с GRFT, высокая плотность поверхность конъюгированных GRFT бы истощают и инактивирует вирус на46,его entrypoint в45,47. Здесь EFs были разработаны в качестве стационарных эшафот чтобы обеспечить на основе белков, вирусной инактивации клей барьер платформу. Мы стремились объединить мощные противовирусные свойства GRFT с биосовместимыми, изменяемые и прочный полимер платформой, чтобы создать роман вирус «ловушку».

Для достижения этих целей, волокон состоит из PLGA были electrospun, и EDC-NHS химии была использована впоследствии изменять поверхность EF с GRFT. PLGA служил в качестве модели полимера из-за его широкого использования в electrospinning48, в сочетании с его биосовместимость и эффективности затрат. Кроме того модификация поверхности использует большой площади поверхности EFs и обеспечивает полезной альтернативой, которые могут быть объединены с инкапсуляцией увеличить волокна Утилита49. В отличие от традиционных инкапсуляции методов, где только часть GRFT доступен (и только временно присутствует в ФРТ) модификация поверхности может позволить GRFT поддерживать максимальную биологическую в течение всего срока лечения. Кроме того включение гидрофильные соединения, такие как белки, методами традиционной electrospinning, может привести к нижней инкапсуляции эффективность и потери белка деятельности50. Таким образом GRFT поверхность модифицированные волокна могут предложить перспективные альтернативные поставки метод, который может использоваться отдельно или в сочетании с electrospinning для усиления защиты от ИППП-инфекции.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка и изготовление эшафот волокна Electrospun

ОСТОРОЖНОСТЬЮ: вся работа с растворителями или полимерные растворы должны выполняться в Химический вытяжной шкаф . Обратитесь к безопасности материала таблицы каждого реагента перед началом протокол.

  1. Для electrospin раствор полимера PLGA 3 мл 15% w/w, весят 720 мг 50: 50 поли (молочно co гликолевая кислота) (PLGA; 0,55-0.75 дл/г, 31-57 кДа) в 10 мл флаконе сцинтилляционные. Объем раствора на основе размера типичного пакета, используемые в текущих исследованиях.
    Примечание: Полимерной массы для добавления данного объема растворителя должна рассчитываться сначала продумывается плотность растворителя используется для растворения полимеров. Плотность растворителя Hexafluoro-2-пропанол (HFIP) – 1,59 г/мл. Таким образом, вес растворителя, основываясь на объем 3,0 мл HFIP необходимо, – 4,8 г (3,0 мл x 1,59 г / мл). На долю 15% w/w PLGA к HFIP 720 мг PLGA необходимо добавить 3,0 мл HFIP (0,15 x 4800 = 720 мг). Преимущество использования % w/w/раствор полимера, вместо % w/v, является, что это обеспечивает определенный вес окончательного решения. Этот определенный вес позволяет более точные замена растворителей, в случае испарения растворителя в шаге 1.3.
  2. Добавить 3,0 мл HFIP стекла сцинтилляционные флакон, содержащий PLGA (от шага 1.1) с помощью Пипетки серологические стекла. Покрыть флакон с пластиковой пленкой, а затем измерьте и запишите флакона Массачусетс
  3. Инкубировать полимер подвеска на ночь при 37 ° C для обеспечения полного растворения полимеров. Если любой растворитель испаряется, уменьшение массы во флаконе, добавить HFIP до тех пор, пока флакона достигает своей первоначальной массы на шаге 1.2.
  4. После инкубации, подготовить electrospinning аппарат ( рис A). Хотя оправки любого размера могут быть использованы, здесь вращающейся 25 мм Наружный диаметр нержавеющей стали оправки был использован как коллекционер.
    Примечание: Большего диаметра оправки уменьшается толщина волокна, учитывая же объем раствора electrospinning.
  5. Аспирационная раствор полимера в шприц 3 мл.
  6. Подключить тупым кончик иглы ½ дюйма 18-го калибра, шприц и отказаться от избыточного решения (обычно 0,25 мл) для удаления пустых headspace в кончик иглы.
  7. Место шприц на шприцевый насос и установите скорость потока документа до 2,0 мл/ч.
    Примечание: Этот поток был ранее оптимизирован основанные на вязкость полимера для этой разработки.
  8. Подключите источник питания к иглу шприца и electrospin раствор полимера с использованием напряжения + 27 кв. Расстояние между иглой и коллектор должен быть равен примерно 25 см ( рис. 2 B).
    Предупреждение: Процесс electrospinning создает паров растворителя. Использование вытяжного шкафа или закрытых аппарат ( рис. 2) для удаления вредных паров .
  9. После всего решения electrospun, выключите источник питания и позволяют оправки для спина на дополнительные 30 минут для полного испарения растворителя.
  10. Поворот от вращения оправки коллектор и используйте лезвия для резки волокна из оправки. Используйте нож аккуратно чистить волокна из оправки.
  11. Сбора electrospun PLGA волокна в обозначенные Петри и место в desiccatorovernight для удаления остаточного растворителя.

2. Поверхность модификация волокон с GRFT

  1. подготовить решения фосфат амортизированное saline (PBS) и 2-(N-Морфолино) ethanesulfonic кислота (MES буфера). Подготовьте PBS, растворяя 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na 2 HPO 4 и 0,24 г х 2 PO 4 в 1 Л ультрачистая вода. Аналогичным образом, распустить 19.52 g MES (свободной кислоты, 195.2 МВт) и 29.22 г NaCl в 1 Л ультрачистая вода, подготовить MES буфера. Обеспечивает окончательное pH каждого решения между 7.2-7,5 и 5.0-6.0, соответственно, с помощью рН метр.
  2. Подготовить индивидуальные рабочие решения EDC (2 мм) и стоматология (5 мм).
    1. Удалить EDC и ГСЗ из морозильника и позволяют им сбалансировать до комнатной температуры перед весом.
    2. Весят 4 мг EDC в 1,5 мл трубку microcentrifuge.
    3. Весят 6 мг ГСЗ в другую трубу microcentrifuge.
    4. Добавить 1 мл MES буфер для каждой трубы. Вихревой обеих трубок энергично обеспечивать реагентов полностью растворены.
  3. Приготовления раствора гидроксиламина, весом 70 мг в 50 мл конические пластиковых пробирок.
  4. Добавить 20 мл PBS гидроксиламина и вихревой распустить.
  5. Масса, соответствующее количество PLGA волокна в 15 мл конические пластиковых пробирок. Как правило, 75 мг волокно используется для каждой партии реакции.
  6. Добавить 8 мл буфера МЧС в 15 мл тюбик.
  7. Добавить 1 мл EDC и NHS решений, подготовленных ранее к трубе. Окончательный объем раствора должно быть 10 мл. Окончательный концентрации EDC и NHS должны быть 0,4 мг/мл 0,6 мг/мл, соответственно и.
  8. Закрыть и опечатать 15 мл тюбик с пластиковой пленкой и поместить на вращателе разрешить решение быть аккуратно перевернутой 15 мин при комнатной температуре ( рис. 3 B). Этот шаг активирует карбоксильных групп на полимер для ковалентная модификация с GRFT белками ( рис A).
  9. После активации, тщательно утолить реакции путем добавления 14 мкл β-меркаптоэтанол трубки. Инвертировать трубке несколько раз для обеспечения полного смешивания.
    Предупреждение: β-меркаптоэтанол высоко токсичен и должен использоваться только в химической зонта.
  10. Удалить супернатант и дважды, промыть PLGA волокна 10 мл PBS, чтобы удалить любые оставшиеся β-меркаптоэтанол.
  11. После промывки, добавить соответствующее количество Стоковый раствор GRFT в трубку. К примеру 5 нмоль волокна GRFT/mg потребует 6.35 мкл Стоковый раствор GRFT (от 10 мг/мл бульона) на мг волокна. Таким образом образец волоконно 75 мг потребует 476.25 мкл 10 мг/мл GRFT Стоковый раствор.
    Примечание: GRFT волокон с теоретической нагрузках 0,05, 0.5 и 5 нмоль GRFT за мг волокна были сфабрикованы.
  12. Добавить достаточно PBS довести окончательный объем до 8 мл, закройте и перевернуть трубку для обеспечения тщательного перемешивания.
  13. Прокладка трубки с пластиковой пленкой и место на ротор снова, это время для 2 х.
  14. После 2 ч инкубации, утолить реакции, добавив 2 мл раствора гидроксиламина в пластиковых пробирок 15мл. В соответствии с инструкциями производителя, конечная концентрация гидроксиламина во время тушения реакции должно быть 0,7 мг/мл.
  15. Раствор тщательно перемешать и удалить супернатант. Промойте поверхность модифицированные волокна PLGA дважды с 10 мл сверхчистого водой, чтобы удалить любые неконъюгированной GRFT.
  16. Передачи волокна Петри блюдо и место внутри эксикатора до тех пор, пока волокно абсолютно сухой. Передача на Петри блюдо до 4 ° C для хранения.

3. SEM характеристика GRFT поверхность-модифицированные волокна

  1. место полосы углерода двухсторонние ленты на SEM образца горе. Метка нижней части образца гору с образец идентификационной информации с помощью постоянного маркера.
  2. Сократить три образцов из одной поверхности модифицированные волокна и разместить их на отдельный образец крепления. Толщина каждого образца составляет примерно 0,5 мм.
  3. Распыления покрытия образцы, используя осаждения частиц, электронов индуцированной из золотой пластине. Распыления пальто для 90 s, в 2.4 кв.
    Примечание: Время распыления пальто может варьироваться в зависимости от параметров оборудования, включая напряжение и силу тока.
  4. Изображения образцов в 8 кв с увеличением от 1 000 до 5 000 X.

4. Добыча GRFT от поверхности модифицированные волокна

  1. массы из 2 мг волокна в трех экземплярах в 1,5 мл пробирок microcentrifuge.
  2. Добавить 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) на трубу, затем вихря и инкубировать 1 мин при комнатной температуре до полного растворения волокна и.
  3. После инкубации, развести 10 мкл Алиготе из ДМСО волокна решение от шага 4.2, по крайней мере 100-кратного в буфер Tris-ЭДТА (TE) (рН = 8.0).
  4. Хранить образцы при-20 ° C до загрузки характеристика с ELISA.

5. Измерение GRFT десорбции из волокон

  1. оценить количество GRFT выпущен или десорбированного из волокна, весят 5-10 мг поверхности модифицированные волокна и место в пробки microcentrifuge. Запись массы волокна в каждой тюбике.
  2. Добавляют 1 мл соответствующее решение, которое имитирует физиологических окружающей среды (например, PBS, TE буфера, имитируемых вагинальной жидкости (СФДВ), и т.д.) для каждой выборки.
  3. Проинкубируйте образцы для 1 h на вращающейся шейкер на 200 об/мин, 37 ° C.
  4. После инкубации, удалить примерно 1 мл TE буфер, содержащий десорбировано GRFT из флакона и Алиготе кластер трубки. Хранить при-20 ° C до белка квантификации.
  5. Передавать новые пробки microcentrifuge образца и инкубировать до следующей точки время и добавьте 1 mL свежих буферного раствора с волокном в пробки microcentrifuge.
  6. Стандартное время точек, используемых для измерения выпуска включают в себя: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h и 1 wk., незначительным десорбции было отмечено в этих исследованиях после 4 ч.

6. Количественная оценка добычи GRFT и десорбции через ELISA

  1. пальто ИФА 96-луночных плита с 0,1 мл га (10 мкг/мл) в колодец как описано 51. Уплотнение пластины с пластиковой пленкой и инкубировать на ночь при 4 ° C ( рис. 4).
  2. Удалить буфер покрытия и добавлять 0,3 мл, блокирование буфера (2-3% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS с 0,05% Полисорбат 20) для каждой скважины. Инкубировать пластину для по крайней мере 2 ч при комнатной температуре.
  3. После инкубации, промойте пластины 3 раза с ПБС с 0.1% Полисорбат 20 (PBS-P). После ополаскивания, отказаться от 0,1 мл образцов, стандартом или PBS как отрицательный контроль в соответствующих скважины. Инкубировать пластину за 1 ч при комнатной температуре.
  4. Промойте пластины 3 раза снова с PBS-P. После ополаскивания, добавить 0,1 мл основное антитело (коза анти GRFT антисыворотка) в каждой скважине и проинкубируйте по крайней мере 1 ч при комнатной температуре. Как правило, основное антитело раствор разбавляют путем мэм в PBS.
  5. После инкубации пробы с основное антитело промыть пластины снова 3 раза с PBS-P. Добавить 0,1 мл вторичные антитела (пероксидазы (ПХ)-конъюгированных кролик анти коза IgG) к каждому хорошо и инкубировать 1 час при комнатной температуре. Вторичное антитело раствор разбавляют путем мэм в PBS.
  6. Мыть пластину 3 раза. Добавьте 0,1 мл ТМБ 2-пероксидаза субстрата в каждой скважине. Мониторинг развития цвета (около 2 мин), а затем добавить 0,1 мл Ч 2 так 4 (1 N) чтобы утолить реакции. Читайте пластины на 450 Нм на тарелку reader.
  7. Средние значения ОД фон (скважины, которые получают только PBS) и вычесть это от экспериментальных групп.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Морфология волокно имеет значительное влияние на способность поверхности модифицированные EFs для защиты от вирусов. Хотя electrospinning является удобной и простой процедурой, неоптимизированных полимерные составы может привести к неправильной волокна морфологии (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Благодаря своей пористой структуры и большой площади поверхности EFs нашли целый ряд применений в области здравоохранения, одна из которых включает в себя в качестве терапевтического доставки. Наркотики и другие активные вещества могут быть включены в EFs перестраиваемый доставки, в то ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы признательны Еврейский фонд наследия для передового опыта для финансирования этого исследования. Мы благодарим д-р Стюарт Уильямс II за щедро предоставленные использования системы electrospinning. Мы также благодарим д-р Кеннет Палмер за предоставление нам с Griffithsin. Мы дополнительно поблагодарить доктора Нобуюки Матоба и его лаборатории для подготовки работы нам в GRFT ELISA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50LactelB6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)Thermo Scientific 147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2Brico Medical SuppliesBN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tipVWR309657
Parafilm (plastic film)Sigma AldrichP7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)Sigma AldrichM3671 
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653
Potassium ChlorideSigma AldrichP9333
Sodium phosphate dibasicSigma AldrichS7907
Potassium phosphate monobasicSigma AldrichP0662
Hydroxysuccinimide (NHS)Thermo Scientific 24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)Thermo Scientific 22980
2-MercaptoethanolFisherBP176
Griffithsin (GRFT)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Dimethyl SulfoxideMilipore317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)Sigma AldrichP9416 
Tris EDTA BufferSigma Aldrich93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well PlatesThermo Scientific 3355
Influenza Hemagglutinin (HA)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)Santa Cruz2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase SubstrateKPL52-00-00

Ссылки

  1. Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
  2. Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
  4. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  5. Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
  6. Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
  7. Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  8. Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
  9. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  10. Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
  11. Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
  12. Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792(2012).
  13. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  14. Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
  15. Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
  16. Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
  17. Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
  18. Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
  19. Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
  20. Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  21. Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
  22. Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
  23. Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108(2010).
  24. Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
  25. Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
  26. Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
  27. Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
  28. Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
  29. Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
  30. Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
  31. Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
  32. Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
  33. O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
  34. Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
  35. Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
  36. Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
  37. Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635(2011).
  38. Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
  39. Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
  40. Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
  41. Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
  42. Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
  43. O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
  44. Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
  45. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
  46. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
  47. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
  48. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
  49. Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
  50. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
  51. Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
  52. Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
  53. Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
  54. Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
  55. Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
  56. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
  57. Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
  58. Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
  59. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
  60. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
  61. Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
  62. Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
  63. Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
  64. Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
  65. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  66. Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

128ElectrospunGriffithsinco

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены