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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren zu fabrizieren und zu charakterisieren Griffithsin veränderten Poly (Milchsäure-co-Glykol Säure) Electrospun Fasern, die starke Klebe- und antivirale Aktivität gegen humane Immundefizienz-Virus Typ 1-Infektion nachweisen in Vitro. Methoden zur Synthese, Fläche zu ändern, und die daraus resultierende Morphologie, Konjugation, prägen und Desorption des Griffithsin von oberflächenmodifizierten Fasern werden beschrieben.

Zusammenfassung

Electrospun Fasern (EFs) haben in einer Vielzahl von therapeutischen Anwendungen am meisten benutzt worden; jedoch wurden sie erst vor kurzem übernommen wie eine Technologie zur Vorbeugung und Behandlung von sexuell Infektionen (STI übertragenen). Darüber hinaus konzentrieren sich viele EF Technologien auf Kapselung des Wirkstoffs im Verhältnis zu der Nutzung der Oberfläche Biofunktionalität zu vermitteln. Hier beschreiben wir eine Methode um zu fabrizieren und poly(lactic-co-glycolic) Säure (PLGA) Electrospun Fasern, mit der potente antivirale Lektin Griffithsin (GRFT) Fläche zu ändern. PLGA ist ein FDA-zugelassene Polymer, das bei der Medikamentenabgabe aufgrund seiner herausragenden Eigenschaften von chemischen und biokompatiblen verbreitet. GRFT ist ein natürliches, potent, und sichere Lektine, die breite Wirkung gegen zahlreiche Viren einschließlich der humanen Immundefizienz-Virustyp 1 (HIV-1) besitzt. In Kombination haben GRFT veränderten Fasern potente Inaktivierung von HIV-1 in Vitronachgewiesen. Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zu fabrizieren und zu charakterisieren EFs GRFT geändert. Erstens ist PLGA Electrospun ein Faser-Gerüst zu erstellen. Fasern sind anschließend oberflächenmodifizierten mit GRFT mit 1-Ethyl - 3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDC) und N-Hydroxysuccinimide (NHS) Chemie. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wurde verwendet, um die Größe und Morphologie der oberflächenmodifizierten Formulierungen zu beurteilen. Darüber hinaus ein gp120 oder Hämagglutinin (HA)-basierte ELISA verwendet werden, um die Menge an GRFT konjugiert sowie GRFT Desorption von der Faseroberfläche zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann mehr weit angewendet werden, um Fasern herzustellen, die Oberfläche mit einer Vielzahl verschiedener Proteine modifiziert sind.

Einleitung

Die Verwendung von EFs als eine topische Delivery-Plattform hat das Potenzial, sexuell übertragbaren Krankheiten deutlich zu reduzieren. Derzeit gibt es mehr als 36 Millionen Menschen mit HIV, mit mehr als 2 Millionen neue Fälle von berichtet in 2015 allein1,2. Darüber hinaus sind Herpes-Simplex-Virus Typ 2 (HSV-2) Infektion wirkt sich auf Hunderte von Millionen von Menschen weltweit und wurde gezeigt, dass die Übernahme von HIV zu verbessern um 2-5 fach3. Aufgrund dieser Beziehung zwischen HSV-2 Infektionen und HIV Erwerb gibt es erhebliches Interesse an der Entwicklung neuer Wirkstoffe, die gleichzeitigen Schutz gegen mehrere sexuell übertragbaren Krankheiten bieten. Darüber hinaus bietet die Entwicklung von neuen Fahrzeugen zur Verbesserung dieser antivirale Wirkstoffe weiter verbessern, schützende und therapeutische Potenz. Dieses Ziel zu erreichen wurden EFs als neue Lieferung Plattform zur Verringerung der Prävalenz von HIV-1 und HSV-2 Infektionen untersucht.

In den vergangenen zwei Jahrzehnten haben EFs intensiv im Bereich der Drug-Delivery und Tissue engineering4genutzt. Oft werden biokompatible Polymeren ausgewählt, um leicht zu therapeutischen Anwendungen zu übersetzen. Um Polymere EFs zu fabrizieren, ist das ausgewählte Polymer in einer organischen Lösungsmittel oder wässrige Lösung, je nach dem Grad der Polymer Hydrophobie5gelöst. Wirkstoffe von Interesse sind dann die Lösungsmittel oder wässrige Lösung vor dem Elektrospinnen Prozess hinzugefügt. Die Polymerlösung ist dann in eine Spritze aspiriert und langsam ausgeworfen, während abhängig von elektrischem Strom. Dieser Prozess führt in der Regel Polymerfasern mit Blatt oder zylindrische Performance (Abbildung 1) und Faserdurchmesser von der Mikro-Nano-Maßstab-6. Für die meisten therapeutischen Anwendungen Wirkstoffe fließen innerhalb der Fasern während der Elektrospinnen Prozess und werden von der Faser über Diffusion und anschließende Faser Abbau freigegeben. Die Rate der Degradierung oder Entlassung kann geändert werden, durch die Verwendung unterschiedlicher Arten von Polymeren oder Polymer mischt, um eine gewünschte Version profilieren, Vermittlung von einzigartigen chemischen und physikalischen Eigenschaften7sowie die Förderung der Kapselung von praktisch jedem zusammengesetzte. Als solche haben EFs vorteilhaft für die Lieferung von kleinen Molekül-Drogen und biologischen Arbeitsstoffen einschließlich Proteine, Peptide, Oligonukleotide und Wachstumsfaktoren6,8,9bewährt.

Auf dem Gebiet der STI-Prävention haben EFs vor kurzem verwendet worden, zu integrieren oder induzierbaren-retard - antivirale Mittel10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. In einer der frühesten Studien wurden pH-responsive Fasern entwickelt, um Wirkstoffe in Reaktion auf Veränderungen der Umwelt innerhalb der weiblichen Fortpflanzungsorgane (FRT), loslassen als eine Methode des Schutzes gegen HIV-1-11. Da haben andere Studien untersucht Polymerblends bestehend aus Polyethylen-Oxid (PEO) und Poly-L-Milchsäure (PLLA), die einstellbaren Version antivirale und empfängnisverhütende Mittel für HIV-1-Prävention und Verhütung in Vitro testen 12. weitere Studien haben gezeigt, die Machbarkeit der EFs, Folgendes anzugeben: verlängerte Freisetzung niedermolekularer Virostatika14, starke und flexible mechanische Eigenschaften20, 3-d-Lieferung Architekturen21 , Hemmung der Spermien eindringen12und die Fähigkeit, mit anderen Lieferung Technologien13zu verschmelzen. Zu guter Letzt hat Vorarbeiten Polymere Fasern für die nachhaltige Bereitstellung von antivirale Wirkstoffe gegen gemeinsame co-infective Viren, HSV-2 und HIV-1-14ausgewertet. In dieser Studie bereitgestellt Polymerfasern ergänzende Tätigkeit zu antiviralen Lieferung durch Beibehaltung ihrer Struktur für bis zu 1 Monat und eine physische Barriere, virale Eintrag. Aus diesen Ergebnissen wurde festgestellt, dass EFs verwendet werden können, sowohl physisch als auch chemisch Virus-Infektion zu verhindern.

Während abstimmbaren Trenneigenschaften Polymeren EFs eine attraktive Plattform für Mikrobizide Lieferung machen, entwickelten EFs in anderen Anwendungen als oberflächenmodifizierten Gerüste7dienen. EFs wurden verwendet, um die Morphologie der extrazellulären Matrix (ECM), oft als Gerüste zur Zellregeneration22, verbessern und ihre Nützlichkeit in Tissue engineering23,24zu imitieren. Fasern bestehend aus Polymeren wie Poly-ε-Caprolacton (PCL) und PLLA wurden oberflächenmodifizierten mit Wachstumsfaktoren und Proteine nach Elektrospinnen ECM-ähnliche Eigenschaften, einschließlich erhöhte zelluläre Adhäsion und Verbreitung25 zu vermitteln , 26. Darüber hinaus antimikrobielle oberflächenmodifizierten EFs ausgewertet wurden, um zu verhindern das Wachstum von spezifischen pathogenen Bakterien27,28. Aufgrund dieser Vielseitigkeit und die Fähigkeit, biologische Wirkungen induzieren weiterhin EF-Technologie in den unterschiedlichsten Bereichen Multi-mechanistischen Funktionalität bereitstellen. Noch, haben trotz ihrer Dienstprogramm in einer Vielfalt von Anwendungen, oberflächenmodifizierten Fasern erst vor kurzem in der Mikrobizide Feld29erforscht.

Parallel mit der Entwicklung der neuen-Delivery-Technologien zur Vorbeugung und Behandlung von sexuell übertragbaren Krankheiten neuer biologischer Therapeutika entwickelt worden. Eines der vielversprechendsten Microbicide Kandidaten ist der Klebstoff antivirale Lektin, GRFT30. Ursprünglich abgeleitet von einer Spezies von Rotalgen, GRFT zeigte Aktivität als ein potenter Inhibitor von HSV-2, HIV, SARS, sowie Hepatitis C Virus31,32,33,34, 35 , 36. In der Tat unter biologisch-basierten Inhibitoren, GRFT hat die stärkste Anti-HIV-Aktivität, Inaktivierung HIV-1 fast sofort nach Kontakt30, unter Beibehaltung der Stabilität und Aktivität im Beisein von Kulturmedien von vaginalen Mikroben für bis zu 10 Tagen37. Vor kurzem wurde eine 0,1 % GRFT Gel gezeigt, Mäuse gegen intravaginale HSV-2-Challenge, so dass es einen viel versprechender Kandidat für die erste Verteidigungslinie gegen HSV-2 und HIV-1-32 zu schützen, 38. für HIV insbesondere GRFT hemmt Infektion durch physisch verbindliche gp120 oder Terminal Mannose N verbunden Glycan Rückstände auf Oberflächen der Virushülle Eintrag38,39,40,41 zu verhindern ,42. Diese Hemmung ist hochwirksames, mit IC50s 3 ng/mL43nähert. Neben der Hemmung der HIV-Infektion, haben Studien auch gezeigt, dass GRFT gegen HSV-2-Infektion schützt, durch die Hemmung der Zelle zu Zelle Ausbreitung des Virus32. In allen Fällen nachweislich GRFT Klebstoff auf virale Partikel werden und hohe Beständigkeit gegen Denaturierung demonstriert. Schließlich zeigte GRFT synergistische Tätigkeit mit einer Kombination von Tenofovir (TFV) und anderen antiviralen Medikamenten44, machen es möglich und wahrscheinlich vorteilhaft zusammen mit EFs zu verwalten. Die potenten Eigenschaften von GRFT machen es einen ausgezeichneten biologisch basierten antiviralen Kandidat, in dem Lieferung mit EF-Technologie verbessert werden kann.

Mit Hilfe dieses Wissens der Klebe- und angeborenen antiviralen Eigenschaften von GRFT, wurde leski Polymeren Faser entwickelt, die diese Eigenschaften bieten die erste Schicht des Virus Eintrag Hemmung29integriert. Finden Inspiration in der Weise, dass Cervicovaginal Schleim Virus Transport in erster Linie durch mucoadhäsiven Mucin Wechselwirkungen behindert, theoretisierte wir, daß durch die Verwendung von EFs als Gerüst und kovalent ändern die Oberfläche mit GRFT, eine hohe Dichte an GRFT Oberfläche konjugiert würde Schwächen und inaktivieren Virus bei ihrer Entrypoint45,46,47. Hier wurden EFs als stationäre Gerüst um eine Protein-basierten, virale Klebstoff-Inaktivierung Barriere Plattform entwickelt. Wir wollten die potenten antiviralen Eigenschaften der GRFT mit einer biokompatiblen, modifizierbar und langlebig Polymer Plattform, einen neuartigen Virus erstellen "Falle." kombinieren

Um diese Ziele zu erreichen, wurden Fasern bestehend aus PLGA Electrospun und EDC-NHS Chemie wurde verwendet, um die EF-Fläche mit GRFT nachträglich zu ändern. PLGA diente als Modell Polymer aufgrund seines umfangreichen Einsatzes Elektrospinnen48, kombiniert mit seiner Biokompatibilität und Wirtschaftlichkeit. Darüber hinaus Oberflächenmodifizierung nutzt die große Fläche von EFs und bietet eine sinnvolle Alternative, die mit Kapselung, Faser-Dienstprogramm49zu maximieren kombiniert werden können. Im Gegensatz zu traditionellen Kapselung Methoden, wo nur ein Teil des GRFT ist verfügbar (und nur vorübergehend in der FRT), kann Oberflächenmodifizierung GRFT maximale Bioaktivität während der gesamten Dauer der Behandlung zu ermöglichen. Darüber hinaus kann die Aufnahme von hydrophilen Verbindungen wie Proteinen, durch traditionelle Elektrospinnen Methoden, untere Kapselung Effizienz und Verlust von Protein Aktivität50führen. GRFT oberflächenmodifizierten Fasern bieten daher eine viel versprechende alternative Übermittlungsmethode, die allein oder in Kombination mit Elektrospinnen verwendet werden können, um STI Infektionsschutz zu verbessern.

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Protokoll

1. Vorbereitung und Herstellung des Gerüstes Electrospun Fiber

Vorsicht: alle Arbeiten mit Lösungsmitteln oder Polymerlösungen durchgeführt werden, in einem chemischen Abzug . Siehe Datenblatt Materialsicherheit jedes Reagenz vor Beginn des Protokolls.

  1. Electrospin eine 3 mL 15 % w/w PLGA Polymerlösung, Gewicht von 720 mg 50: 50 Poly (Milchsäure-co-glykolische Säure) (PLGA; 0,55 bis 0,75 dL/g, 31-57 kDa) in ein 10 mL-Fläschchen funkeln. Das Volumen der Lösung basiert auf der typischen Losgröße in aktuellen Studien verwendet.
    Hinweis: Die Polymer-Masse hinzufügen zu einem bestimmten Volumen des Lösungsmittels muss berechnet werden, durch die erste Bestimmung der Dichte des Lösungsmittels verwendet, um das Polymer auflösen. Die Dichte des Lösungsmittels Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) ist 1,59 g/mL. Damit das Gewicht des Lösungsmittels, basierend auf ein Volumen von 3,0 mL HFIP benötigt, beträgt 4,8 g (3,0 mL x 1,59 g / mL). Für 15 % w/w Sekundenbruchteile PLGA zu HFIP müssen 3,0 mL HFIP (0,15 x 4.800 mg = 720 mg) 720 mg PLGA hinzugefügt werden. Der Vorteil der Verwendung einer % w/w/Polymerlösung, anstatt % w/V, ist, dass dies ein definiertes Gewicht der endgültigen Lösung bietet. Diese definierte Gewicht ermöglicht genauere Lösungsmittel Ersatz im Falle von Lösungsmittel verdampfen während Schritt 1.3.
  2. 3,0 mL HFIP hinzufügen der Glasphiole funkeln mit PLGA (aus Schritt 1.1) mit einer serologischen Glaspipette. Decken Sie das Fläschchen mit Kunststoff-Folie, dann messen und aufzeichnen die Durchstechflasche Mass
  3. Brüten die Polymer-Suspension über Nacht bei 37 ° C zur vollständigen Auflösung des Polymers zu gewährleisten. Wenn keine Lösungsmittel verdampft, verringern die Durchstechflasche Masse HFIP hinzufügen, bis die Durchstechflasche seiner ursprüngliche Masse in Schritt 1.2 erreicht.
  4. Nach der Inkubation, bereiten die Elektrospinnen Apparatur ( Abbildung 2 A). Obwohl ein Dorn von beliebiger Größe verwendet werden kann, hier ein rotierende 25 mm Außendurchmesser Edelstahl Dorn diente als Kollektor.
    Hinweis: Ein größerer Dorn Durchmesser verringert sich die Faser-Dicke, angesichts des gleichen Volumens der Elektrospinnen Lösung.
  5. Die Polymerlösung in eine 3 mL Spritze Aspirieren.
  6. Verbinden Sie eine stumpfe Nadelspitze 18-Gauge, ½ Zoll mit der Spritze und die überschüssige Lösung (in der Regel 0,25 mL) entfernen Sie leere Gasraum in der Spitze der Nadel zu verzichten.
  7. Legen Sie die Spritze auf eine Spritzenpumpe und Instrument-Durchfluss auf 2,0 mL/h
    Hinweis: Diese Flussrate wurde bisher optimiert basierend auf Polymer Viskosität für diese Formulierung.
  8. Verbinden Sie die Stromquelle mit Spritzennadel und Electrospin der Polymerlösung mit einer Spannung von 27 kV. Der Abstand zwischen Nadel und Sammler sollte festgelegt werden, bis etwa 25 cm ( Abbildung 2 B).
    Achtung: Die Elektrospinnen Prozess erstellt eine Lösungsmitteldampf. Einem Abzug oder eine geschlossene Apparatur ( Abbildung 2) verwenden, um entfernen schädliche Dämpfe .
  9. Sobald die gesamte Lösung Electrospun ist, schalten Sie die Stromversorgung und den Dorn zu drehen für eine zusätzliche 30 min Lösungsmittel vollständig verdunsten lassen.
  10. Turn off den rotierenden Dorn-Sammler und eine Rasierklinge verwenden, um die Faser aus der Spindel geschnitten. Verwenden Sie die Klinge vorsichtig schälen die Faser von der Dorn.
  11. Die Electrospun PLGA-Faser in eine beschriftete Petrischale zu sammeln, und legen Sie in eine Desiccatorovernight, restliche Lösungsmittel zu entfernen.

2. Oberflächenmodifizierung von Fasern mit GRFT

  1. Prepare Lösungen von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES-Puffer). Bereiten Sie PBS durch Auflösen von 8 g NaCl, 0,2 g KCl und 1,44 g Na 2 HPO 4 0,24 g KH 2 PO 4 in 1 Liter Reinstwasser vor. In ähnlicher Weise lösen 19,52 g MES (freie Säure, MW 195.2) und 29,22 g NaCl in 1 Liter Reinstwasser, MES Puffer vorzubereiten. Sicherzustellen, dass der endgültige pH-Wert der jeweiligen Lösung zwischen 7.2-7.5 und 5.0-6.0, bzw. mit dem pH-Meter.
  2. Bereiten individuelle Arbeitslösungen EDC (2 mM) und NHS (5 mM).
    1. EDC und NHS aus der Tiefkühltruhe zu entfernen und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur vor dem Wiegen equilibrate.
    2. Wiegen 4 mg EDC zu einem Microcentrifuge Schlauch 1,5 mL.
    3. Wiegen 6 mg des NHS in einem anderen Microcentrifuge Schlauch.
    4. Add 1 mL MES Puffer, jedes Rohr. Wirbel, die beide Rohre energisch darauf die Reagenzien sind vollständig aufgelöst.
  3. Bereiten die Lösung von Hydroxylamin durch wiegen 70 mg in einer konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL.
  4. 20 mL PBS hinzu kommen die Hydroxylamin und Strudel aufzulösen.
  5. Masse, einen angemessenen Betrag von PLGA-Faser in einem konischen Zentrifugenröhrchen 15 mL. In der Regel 75 mg Ballaststoffe für jede Reaktion dient.
  6. Der 15 mL Tube 8 mL MES Puffer hinzugefügt.
  7. Add 1 mL der EDC und NHS Lösungen vorbereitet früher am Rohr. Der letzte Band der Lösung sollte 10 mL betragen. Die Endkonzentrationen von EDC und NHS sollte 0,4 mg/mL und 0,6 mg/mL bzw..
  8. Schließen und versiegeln die 15 mL Tube mit Kunststoff-Folie und auf ein Rotator ermöglichen die Lösung sanft für 15 min bei Raumtemperatur ( Abbildung 3 B) invertiert werden. Dieser Schritt aktiviert die Carboxylgruppen auf das Polymer zu ermöglichen kovalente Modifikation mit dem GRFT Protein ( Abbildung 3).
  9. Nach der Aktivierung, stillen sorgfältig die Reaktion durch das Rohr 14 µL der β-Mercaptoethanol hinzufügen. Das Rohr mehrmals zu invertieren, um vollständige Durchmischung zu gewährleisten.
    Achtung: β-Mercaptoethanol ist sehr giftig und sollte nur verwendet werden, in einer chemischen Dampfhaube.
  10. Überstand verwerfen und spülen Sie die PLGA-Faser zweimal, mit 10 mL PBS, entfernen alle verbleibenden β-Mercaptoethanol.
  11. Nach dem Spülen, hinzufügen eine entsprechende Menge an Vorratslösung GRFT am Rohr. Beispielsweise müsste ein 5 Nmol GRFT/mg Faser 6,35 µL der Stammlösung GRFT (aus einem Bestand von 10 mg/mL) pro mg Ballaststoffe. So müsste eine 75 mg-Faser-Probe 476.25 µL der Stammlösung 10 mg/mL GRFT.
    Hinweis: GRFT Fasern mit theoretischen Belastungen von 0,05, 0,5 und 5 Nmol GRFT pro mg Faser hergestellt wurden.
  12. Schließen und invertieren das Rohr dafür ein gründliches Mischen hinzufügen genügend PBS um das Endvolumen zu 8 mL.
  13. Dichtung des Rohrs mit Kunststoff-Folie und legen Sie einen Rotor erneut auf, dies Mal für 2 h
  14. Nach 2 h Inkubation, stillen die Reaktion durch Zugabe von 2 mL Hydroxylamin-Lösung in der 15 mL Zentrifugenröhrchen. Pro Anweisungen des Herstellers, die Endkonzentration von Hydroxylamin während der Reaktion abschrecken sollte 0,7 mg/mL.
  15. Die Lösung gut mischen und den Überstand verwerfen. Spülen Sie die oberflächenmodifizierten PLGA Faser zweimal mit 10 mL Reinstwasser, jede unconjugated GRFT entfernen.
  16. Übertragen die Faser in eine Petrischale und Ort in den Exsikkator gestellt, bis die Faser vollständig trocken ist. Die Petrischale auf 4 ° C für die Lagerung zu übertragen.

3. Charakterisierung von GRFT oberflächenmodifizierten Fasern SEM

  1. Ort einen Streifen doppelseitiges Carbon Band auf ein SEM Exemplar montieren. Der Unterseite der Probe Halterung mit der Probe-Informationen zur Identifizierung mit einem Permanentmarker beschriften.
  2. Drei Proben aus einer oberflächenmodifizierten Faser schneiden und legen Sie sie auf separate Probe Reittiere. Die Dicke jeder Probe ist ca. 0,5 mm.
  3. Sputter beschichten die Proben unter Verwendung Elektron-induzierte Partikelabscheidung aus einer Gold-Platte. Sputter-Mantel für 90 s bei 2,4 kV.
    Hinweis: Die Sputter-Mantel-Zeit variieren je nach Geräteparameter, einschließlich Spannung und Stromstärke.
  4. Bild der Proben bei 8 kV mit einer Vergrößerung von 1.000 bis hin zu 5, 000 x.

4. Gewinnung von GRFT aus oberflächenmodifizierten Fasern

  1. Masse, 2 mg Ballaststoffe in dreifacher Ausfertigung in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Das Rohr, dann Wirbel 1 mL Dimethyl Sulfoxid (DMSO) hinzufügen und 1 min. bei Raumtemperatur die Faser vollständig auflösen inkubieren.
  3. Nach der Inkubation verdünnen eine aliquote 10 µL des die DMSO-Faser-Lösung von Schritt 4.2, mindestens 100-fold Tris-EDTA (TE)-Puffer (pH = 8,0).
  4. Proben bei-20 ° C bis zur Charakterisierung mit ELISA geladen lagern.

5. Messung der GRFT Desorption von Fasern

  1. beurteilen die Höhe der GRFT freigegeben oder von der Faser desorbiert wiegen ca. 5-10 mg oberflächenmodifizierten Faser und Ort in einem Microcentrifuge Schlauch. Die Faser-Masse in jedem Röhrchen aufnehmen.
  2. Fügen Sie 1 mL eine geeignete Lösung, die die physiologischen Umwelt imitiert (z.B., PBS, TE-Puffer, simulierte Scheidenflüssigkeit (SVF), etc.) zu jeder Probe.
  3. Brüten die Proben für 1 h auf einem rotierenden Shaker bei 200 u/min, 37 ° c
  4. Nach Inkubation, entfernen Sie etwa 1 mL der TE-Puffer mit bierten GRFT aus dem Fläschchen und Aliquot zu Cluster-Röhren. Shop bei-20 ° C bis Protein Quantifizierung.
  5. Übertragen Sie die Probe auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch, der Faser in den Microcentrifuge Schlauch 1 mL frischer Pufferlösung hinzu, und bis zum nächsten Zeitpunkt inkubieren.
  6. Typische Zeitpunkte zur Messung der Veröffentlichung enthalten: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h und 1 @daveplugers vernachlässigbar Desorption wurde in diesen Studien beobachtet, nach 4 Std.

6. Quantifizierung der GRFT Extraktion und Desorption per ELISA

  1. Mantel einer 96-Well-ELISA-Platte mit 0,1 mL HA (10 µg/mL) pro Bohrloch 51 wie zuvor beschrieben. Die Dichtplatte mit Kunststoff-Folie und Inkubation über Nacht bei 4 ° C ( Abbildung 4).
  2. Entfernen den Beschichtung-Puffer, und 0,3 mL Puffer (ca. 2-3 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS mit 0,05 % Polysorbat 20) in jede Vertiefung zu blockieren. Die Platte für mindestens 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Nach der Inkubation, spülen Sie die Platte 3 Mal mit 1 X PBS mit 0,1 % Polysorbat 20 (PBS-P). Nach dem Spülen, verzichten Sie 0,1 mL der Probe, Standard oder PBS als Negativkontrolle in die jeweiligen Vertiefungen. Die Platte wieder für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Spülen die Platte 3 mal wieder mit PBS-P. Nach dem Spülen, fügen Sie 0,1 mL des primären Antikörpers (Ziege Anti-GRFT Antiserum) in jede Vertiefung und mindestens 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. In der Regel wird die primären Antikörper-Lösung von 1: 10.000 mit PBS-Puffer verdünnt.
  5. Nachdem den Proben mit Primärantikörper spülen Bebrüten die Platten wieder 3 Mal mit PBS-P. Fügen Sie 0,1 mL Sekundärantikörper (Meerrettich Peroxidase (HRP)-konjugierten Kaninchen Anti-Ziege IgG) zu jedem gut und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Die sekundäre Antikörper-Lösung von 1: 10.000 mit PBS-Puffer verdünnt ist.
  6. Waschen die Platte 3 Mal. Fügen Sie 0,1 mL TMB 2-Peroxidase-Substrat in jede Vertiefung. Farbentwicklung (ca. 2 min) zu überwachen, dann fügen Sie 0,1 mL H 2 SO 4 (N 1) um die Reaktion zu stillen. Lesen Sie Platte bei 450 nm auf einer Platte Reader.
  7. Durchschnittswerte der Hintergrund OD (Brunnen, die nur, PBS erhalten), und dies von den experimentellen Gruppen subtrahieren.

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Ergebnisse

Faser-Morphologie hat erhebliche Auswirkungen auf die Fähigkeit der oberflächenmodifizierten EFs zum Schutz vor Viren. Obwohl Elektrospinnen eine bequeme und einfache Prozedur ist, können nicht optimierte Polymer Formulierungen in unregelmäßigen Faser Morphologie (Abbildung 5B-C) führen. Veränderungen im Elektrospinnen Bedingungen, die bei der Bildung von Perlen oder amorphen Mat-ähnlichen Morphologien, entstehen oft durch Lösungsmit...

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Diskussion

Aufgrund ihrer porösen Strukturen und große Flächen fanden EFs eine Vielzahl von Anwendungen im Gesundheitswesen, die eines davon dient als therapeutische Lieferfahrzeuge umfasst. Drogen und andere Wirkstoffe können eingebaut werden in EFs für durchstimmbare Lieferung während Biologics und chemische Liganden an der Faseroberfläche zellspezifische targeting52 oder Biosensoren53konjugiert werden können. Hier oberflächenmodifizierten die Herstellung von GRFT PLGA EFs,...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir sind dankbar, die Jewish Heritage Fund for Excellence für die Finanzierung dieser Forschung. Wir danken Dr. Stuart Williams II für die großzügige Bereitstellung Nutzung des Systems Elektrospinnen. Wir danken Dr. Kenneth Palmer für uns Griffithsin zur Verfügung zu stellen. Wir danken außerdem Dr. Nobuyuki Matoba und seinem Labor für die Ausbildung, die uns im GRFT ELISA arbeiten.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50LactelB6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)Thermo Scientific 147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2Brico Medical SuppliesBN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tipVWR309657
Parafilm (plastic film)Sigma AldrichP7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)Sigma AldrichM3671 
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653
Potassium ChlorideSigma AldrichP9333
Sodium phosphate dibasicSigma AldrichS7907
Potassium phosphate monobasicSigma AldrichP0662
Hydroxysuccinimide (NHS)Thermo Scientific 24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)Thermo Scientific 22980
2-MercaptoethanolFisherBP176
Griffithsin (GRFT)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Dimethyl SulfoxideMilipore317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)Sigma AldrichP9416 
Tris EDTA BufferSigma Aldrich93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well PlatesThermo Scientific 3355
Influenza Hemagglutinin (HA)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)Santa Cruz2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase SubstrateKPL52-00-00

Referenzen

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