JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo manoscritto descrive la procedura per fabbricare e caratterizzare fibre elettrofilate per volta Griffithsin poli (acido lattico-co-glicolico) che illustrano le attività di adesivo ed antivirale potente contro l'infezione di tipo 1 del virus dell'immunodeficienza umana in vitro. Metodi utilizzati per sintetizzare, superficie-modificare e caratterizzare la morfologia risultante, coniugazione, e desorbimento di Griffithsin dalle fibre modificate in superficie sono descritti.

Abstract

Fibre elettrofilate (EFs) sono stati ampiamente utilizzati in una varietà di applicazioni terapeutiche; Tuttavia, solo recentemente sono stati applicati come una tecnologia per prevenire e curare sessualmente trasmissibili (malattie sessualmente trasmissibili). Inoltre, molte tecnologie di EF concentrano sull'incapsulamento l'agente attivo, rispetto che utilizzano la superficie per impartire biofunzionalità. Qui descriviamo un metodo per fabbricare e superficie-modificare le fibre elettrofilate (PLGA) acidi poly(lactic-co-glycolic), con il potente antivirale lectin Griffithsin (GRFT). PLGA è un polimero approvato dalla FDA che è stato ampiamente utilizzato nella somministrazione di farmaci a causa di sue eccezionali proprietà chimiche e biocompatibile. GRFT è un naturale, potente, sicuro lectin che possiede vasta attività contro numerosi virus compreso il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1). Quando combinati, GRFT-modificato fibre hanno dimostrato potente inattivazione di HIV-1 in vitro. Questo manoscritto descrive i metodi per fabbricare e caratterizzare GRFT-modificato EFs. In primo luogo, PLGA è elettrofilate per creare un'impalcatura di fibra. Le fibre sono successivamente modificate in superficie con GRFT utilizzando 1-etil - 3-(3-dimetetilpropile) carbodiimide (EDC) e N-Idrossisuccinimide (NHS) chimica. Microscopia elettronica (SEM) è stato utilizzato per valutare la dimensione e la morfologia delle formulazioni modificate in superficie. Inoltre, un gp120 o emoagglutinina (HA)-ELISA base può essere usato per quantificare la quantità di GRFT coniugato a, come pure il desorbimento GRFT dalla superficie della fibra. Questo protocollo può essere applicato più ampiamente per fabbricare fibre che vengono modificate in superficie con una varietà di differenti proteine.

Introduzione

L'utilizzo di EFs come una piattaforma di consegna attuale ha il potenziale per ridurre in modo significativo le malattie sessualmente trasmissibili. Attualmente, ci sono oltre 36 milioni persone affette da HIV, con oltre 2 milioni di nuovi casi segnalati nel 2015 solo1,2. Inoltre, virus herpes simplex tipo 2 (HSV-2) infezione colpisce centinaia di milioni di persone in tutto il mondo e ha dimostrato di migliorare l'acquisizione dell'HIV da 2-5 volte3. A causa di questa relazione tra infezione HSV-2 e acquisizione di HIV, c'è notevole interesse nello sviluppo di nuovi agenti attivi che forniscono protezione simultanea contro più di malattie sessualmente trasmissibili. Inoltre, lo sviluppo di nuovi veicoli per migliorare l'erogazione di questi agenti antivirali offre il potenziale per migliorare ulteriormente la potenza protettiva e terapeutica. Verso questo obiettivo, EFs sono stati studiati come una nuova piattaforma di consegna per ridurre la prevalenza di infezioni da HIV-1 e HSV-2.

Durante le due decadi scorse, EFs sono stati ampiamente utilizzati nei campi della somministrazione di farmaci e di ingegneria del tessuto4. Spesso, polimeri biocompatibili sono selezionati per tradurre facilmente per applicazioni terapeutiche. Per fabbricare polimerici EFs, il polimero selezionato è disciolto in una soluzione acquosa o solvente organica, a seconda del grado di idrofobicità di litio5. Agenti attivi di interesse vengono quindi aggiunti alla soluzione acquosa o solvente prima del processo di elettrofilatura. La soluzione di polimero viene poi aspirata in una siringa e lentamente espulso mentre è soggetto ad una corrente elettrica. Questo processo normalmente produce fibre di polimeri con foglio o macrostrutture cilindrico (Figura 1) e diametri di fibra che vanno dai6ai micro-nano-scala. Per le applicazioni più terapeutiche, agenti attivi sono incorporati nelle fibre durante il processo di elettrofilatura e vengono rilasciati dalla fibra tramite diffusione e degradazione della fibra successive. Il tasso di degradazione o di rilascio può essere modificato utilizzando diversi tipi di polimeri o miscele di polimeri per stabilire un profilo di rilascio desiderata, impartendo le proprietà chimiche e fisiche uniche7e promuovere l'incapsulamento di praticamente qualsiasi composti. Come tale, EFs hanno dimostrato benefici alla consegna dei farmaci piccola molecola e agenti biologici tra cui proteine, peptidi, oligonucleotidi e fattori di crescita6,8,9.

Nel campo della prevenzione di STI, EFs sono stati recentemente utilizzati per incorporare e fornire o inducibile-rilascio prolungato di agenti antivirali10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. In uno degli studi più in anticipo, fibre pH-sensible a reagire sono stati sviluppati per rilasciare agenti attivi in risposta ai cambiamenti ambientali all'interno del tratto riproduttivo femmina (FRT), come un metodo su richiesta di protezione contro l'HIV-111. Da allora, altri studi hanno studiato i miscugli di polimeri composto di ossido di polietilene (PEO) e acido poli-L-lattico (PLLA), per valutare il rilascio sintonizzabile di agenti antivirali e contraccettivi per HIV-1 prevenzione e contraccezione in vitro 12. studi supplementari hanno dimostrato la fattibilità di EFs per fornire la seguente documentazione: prolungato rilascio di piccole molecole antivirali14, forte e flessibile proprietà meccaniche20, architetture 3D consegna21 , inibizione di sperma penetrazione12e la capacità di fondersi con altre tecnologie di consegna13. Infine, il lavoro precedente ha valutato fibre polimeriche per la consegna di sostenuta degli agenti antivirali contro il virus co-infective comuni, HSV-2 e di HIV-114. In questo studio, fibre polimeriche fornito attività complementare alla consegna antivirale mantenendo la loro struttura per fino a 1 mese e fornendo una barriera fisica per entrata virale. Da questi risultati, è stato osservato che EFs può essere utilizzato sia fisicamente e chimicamente ostacolare l'infezione del virus.

Mentre rilascio sintonizzabile proprietà rendono polimerici EFs una piattaforma attraente recapito per la consegna di microbicida, EFs sono state sviluppate in altre applicazioni per servire come scaffold modificate in superficie7. EFs sono stati utilizzati per simulare la morfologia della matrice extracellulare (ECM), spesso agendo come scaffold per la rigenerazione cellulare22di migliorare e potenziare la loro utilità in tessuto ingegneria23,24. Fibre di polimeri come poli-ε-caprolattone (PCL) e PLLA sono state modificate in superficie con fattori di crescita e proteine dopo elettrofilatura per conferire proprietà simil-ECM cui adesione e la proliferazione cellulare aumentata25 , 26. Inoltre, EFs modificate in superficie antimicrobica sono state valutate per impedire la crescita di batteri patogeni specifici27,28. A causa di questa versatilità e la capacità di indurre effetti biologici, tecnologia EF continua ad espandersi attraverso una varietà di campi per fornire funzionalità di multi-meccanicistico. Eppure, nonostante la loro utilità in una varietà di applicazioni, fibre modificate in superficie solo di recente sono stati esplorati nel campo microbicida29.

In parallelo con lo sviluppo di nuove tecnologie per la distribuzione per prevenire e curare le malattie sessualmente trasmissibili, approcci terapeutici biologici sono stati sviluppati. Uno dei più promettenti candidati microbicida è l'adesivo lectina antivirale, GRFT30. Originariamente derivato da una specie di alghe rosse, GRFT ha dimostrato l'attività come un potente inibitore dell'HIV, HSV-2, SARS, così come l'epatite C virus31,32,33,34, 35 , 36. infatti, tra inibitori biologicamente-based, GRFT ha la più potente attività anti-HIV, inattivando HIV-1 quasi immediatamente al contatto30, mantenendo stabilità e attività in presenza di terreni di coltura da vaginale microbi per fino a 10 giorni37. Più recentemente, un gel GRFT 0,1% è stato indicato per proteggere i topi contro intravaginale sfida di HSV-2, che lo rende un candidato di promessa per la prima linea di protezione contro HSV-2 sia HIV-132, 38. per HIV in particolare, GRFT inibisce l'infezione legandosi fisicamente i residui di glycan N-collegati di mannosio gp120 o terminal su superfici di envelope virale per prevenire la voce38,39,40,41 ,42. Questa inibizione è altamente potente, con IC50s avvicina 3 ng/mL43. Oltre ad inibire l'infezione da HIV, studi hanno anche dimostrato che GRFT protegge contro l'infezione HSV-2 inibendo la diffusione della cellula--cellula del virus32. In tutti i casi, il GRFT ha dimostrato di essere adesivo di particelle virali, pur dimostrando elevata resistenza alla denaturazione. Ultima, GRFT ha dimostrato l'attività sinergica con combinazioni di Tenofovir (TFV) e altri farmaci antivirali44, rendendo fattibile e probabilmente utile per somministrare con EFs. Le potenti proprietà di GRFT rendono un eccellente candidato antivirale biologicamente-based, in cui la consegna può essere migliorata con tecnologia EF.

Utilizzando questa conoscenza delle proprietà adesive e innata antivirale di GRFT, un'impalcatura di fibra polimerica è stata progettata, che integra queste proprietà per fornire il primo strato di virus voce inibizione29. Trovare ispirazione nel modo che cervicovaginali muco ostacola il trasporto virus principalmente attraverso interazioni di mucina mucoadesive, abbiamo supposto che utilizzando EFs come un'impalcatura e covalenza modificando la superficie con GRFT, un'alta densità di superficie-coniugati GRFT sarebbe debilitano e inattivare il virus al suo entrypoint45,46,47. Qui EFs sono stati sviluppati come un ponteggio fisso per fornire una piattaforma virale, basato su proteine inattivanti adesivo barriera. Abbiamo cercato di combinare le potenti proprietà antivirali di GRFT con una piattaforma di polimero biocompatibile, modificabile e durevole, per creare un virus novello "trappola".

Per raggiungere questi obiettivi, fibre composto da PLGA erano elettrofilate e chimica di EDC-NHS è stato utilizzato per modificare in seguito la superficie EF con GRFT. PLGA servito come un polimero modello dovuto il relativo uso esteso in elettrofilatura48, combinato con la sua biocompatibilità e rapporto costo-efficacia. Inoltre, modificazione superficiale sfrutta l'ampia superficie di EFs e fornisce un'alternativa utile che può essere combinata con incapsulamento per massimizzare la fibra utilità49. A differenza dei metodi tradizionali di incapsulamento dove solo una parte del GRFT è disponibile (e solo transitoriamente presenti nella FRT), modificazione superficiale può abilitare GRFT mantenere la massima bioattività durante tutta la durata del trattamento. Inoltre, l'incorporazione dei composti idrofili quali proteine, dai metodi tradizionali di elettrofilatura, potrebbero inferiore incapsulamento efficienze e perdita di proteina attività50. Di conseguenza, fibre di modificazione superficiale GRFT possono offrire un promettente metodo di consegna alternativo che può essere utilizzato da solo o in combinazione con elettrofilatura per migliorare la protezione contro l'infezione di STI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. preparazione e montaggio dell'impalcatura di fibre elettrofilate

Attenzione: tutti i lavori con solventi o soluzioni di polimero devono essere eseguiti in una cappa chimica . Vedere la scheda tecnica di sicurezza materiale di ciascun reagente prima di iniziare il protocollo.

  1. a electrospin una soluzione di polimero di 3 mL 15% w/w PLGA, pesare 720 mg di 50: 50 poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA; 0,55-0,75 dL/g, 31-57 kDa) in un flacone da 10 mL di scintillazione. Il volume della soluzione si basa sui vostri lotti tipici utilizzati negli studi attuali.
    Nota: La massa di polimero per aggiungere a un determinato volume di solvente deve essere calcolata dal primo determinazione della densità del solvente utilizzato per sciogliere il polimero. La densità del solvente Hexafluoro-2-propanolo (HFIP) è 1,59 g/mL. Così, il peso di solvente, basato su un volume di 3,0 mL HFIP necessari, è 4,8 g (3,0 mL x 1,59 g / mL). Per una frazione di 15% w/w di PLGA per HFIP 720 mg PLGA deve essere aggiunto a 3,0 mL HFIP (0,15 x 4.800 mg = 720 mg). Il vantaggio dell'utilizzo di un polimero/soluzione % w/w, anziché % w/v, è che questo fornisce un peso definito della soluzione finale. Questo peso definito consente una più accurata sostituzione solvente, nel caso di evaporazione del solvente durante passaggio 1.3.
  2. Aggiungere 3,0 mL HFIP nel flaconcino di scintillazione di vetro contenente PLGA (dal punto 1.1) usando una pipetta di vetro sierologica. Coprire il flaconcino con pellicola di plastica, poi misurare e registrare il flaconcino mass.
  3. Incubare la sospensione di polimero durante la notte a 37 ° C per garantire la completa dissoluzione del polimero. Se qualsiasi solvente evapora, diminuendo la massa di fiala, aggiungere HFIP fino a quando il flaconcino raggiunge sua massa originale nel passaggio 1.2.
  4. Dopo l'incubazione, preparare l'apparato di elettrofilatura ( Figura 2 A). Anche può essere usato un mandrino di qualsiasi dimensione, qui un rotazione mandrino in acciaio inox di diametro esterno 25 mm è stato usato come il collettore.
    Nota: Un più grande diametro del mandrino consentirà di ridurre lo spessore della fibra, dato lo stesso volume di soluzione di elettrofilatura.
  5. Aspirare la soluzione di polimero in una siringa da 3 mL.
  6. Collegare una punta smussata del ago calibro 18, ½ pollice alla siringa ed erogare la soluzione in eccesso (in genere 0,25 mL) per rimuovere il vuoto dello spazio di testa nella punta dell'ago.
  7. Posizionare la siringa su una pompa a siringa e impostare la velocità di flusso di strumento a 2,0 mL/h.
    Nota: La portata precedentemente è stata ottimizzata basata sulla viscosità del polimero per questa formulazione.
  8. Collegare la fonte di energia per l'ago della siringa ed electrospin la soluzione di polimero utilizzando una tensione di + 27 kV. La distanza tra l'ago e il collettore deve essere impostata su circa 25 cm ( Figura 2 B).
    Attenzione: Il processo di elettrofilatura crea un vapore solvibile. Utilizzare una cappa aspirante o un apparecchio chiuso ( Figura 2) per rimuovere il vapore nocivo .
  9. Una volta che l'intera soluzione è elettrofilate, spegnere la fonte di alimentazione e consentire il mandrino a girare per altri 30 min far evaporare completamente il solvente.
  10. Turn off il collettore mandrino rotante e usare una lama di rasoio per tagliare la fibra dal mandrino. Utilizzare la lama per Sbucci delicatamente la fibra da mandrino.
  11. Raccogliere la fibra PLGA elettrofilate in una capsula di Petri con etichetta e inserire in un desiccatorovernight per rimuovere il solvente residuo.

2. Superficie-modifica delle fibre con GRFT

  1. preparare soluzioni di tampone fosfato salino (PBS) e 2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido (buffer di MES). Preparate PBS sciogliendo 8 g NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 e 0,24 g KH 2 PO 4 in 1 L di acqua ultrapura. Allo stesso modo, sciogliere g 19,52 MES (acido libero, 195,2 MW) e 29,22 g NaCl in 1 L di acqua ultrapura, per preparare il tampone di MES. Garantire il pH finale di ogni soluzione è compreso tra 7.2-7.5 e 5.0-6.0, rispettivamente, utilizzando un misuratore di pH.
  2. Preparare soluzioni individuali di lavoro di EDC (2 mM) e NHS (5 mM).
    1. Rimuovere l'EDC e NHS dal freezer e consentire loro di stabilizzare a temperatura ambiente prima della pesatura.
    2. Pesare 4 mg di EDC in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
    3. Pesare 6 mg di NHS in un altro tubo del microcentrifuge.
    4. Aggiungere 1 mL MES buffer per ogni tubo. Vortice di entrambi i tubi energicamente affinché i reagenti sono completamente dissolte.
  3. Preparare una soluzione di idrossilammina pesando 70 mg in una provetta conica per centrifuga da 50 mL.
  4. Aggiungere 20 mL di PBS per l'idrossilammina e vortex per sciogliere.
  5. Massa fuori una quantità appropriata di fibra di PLGA in una provetta da centrifuga a fondo conico da 15 mL. In genere, 75 mg di fibra viene utilizzato per ogni batch di reazione:.
  6. Aggiungere 8 mL di tampone MES per il tubo da 15 mL.
  7. Aggiungere 1 mL delle soluzioni EDC e NHS preparato in precedenza sul tubo. Il volume finale della soluzione dovrebbe essere 10 mL. Le concentrazioni finali di EDC e NHS dovrebbero essere 0,4 mg/mL e 0,6 mg/mL, rispettivamente.
  8. Nelle vicinanze e sigillare il tubo da 15 mL con film plastico e mettere su un rotatore per consentire la soluzione deve essere invertito delicatamente per 15 min a temperatura ambiente ( Figura 3 B). Questo passaggio consente di attivare i gruppi carbossilici il polimero per consentire modifica covalente con la proteina GRFT ( Figura 3 A).
  9. Dopo l'attivazione, attentamente placare la reazione aggiungendo 14 µ l di β-mercaptoetanolo al tubo. Capovolgere la provetta diverse volte a garantire la completa miscelazione.
    Attenzione: β-mercaptoetanolo è altamente tossico e deve essere utilizzato solo in una cappa chimica.
  10. Scartare il surnatante e lavare due volte, la fibra PLGA con 10 mL di PBS, per rimuovere qualsiasi residuo β-mercaptoetanolo.
  11. Dopo il risciacquo, è necessario aggiungere una quantità appropriata di soluzione stock GRFT al tubo. Ad esempio, un 5 nmol fibra GRFT/mg richiederebbe 6,35 µ l di soluzione madre GRFT (da uno stock di 10 mg/mL) per mg di fibra. Quindi un campione di fibra 75mg richiederebbe 476.25 µ l di soluzione madre di 10 mg/mL GRFT.
    Nota: Fibre GRFT con carichi teorici di 0,05 e 0,5 nmol 5 GRFT per fibra di mg sono stati fabbricati.
  12. Aggiungere abbastanza PBS per portare il volume finale a 8 mL, chiudere e capovolgere la provetta per garantire la completa miscelazione.
  13. Guarnizione tubo con film plastico e posto su un rotore di nuovo, questa volta per 2 h.
  14. Dopo il 2 h incubazione, placare la reazione aggiungendo 2 mL di soluzione di idrossilammina nella provetta da centrifuga da 15 mL. Secondo le istruzioni del produttore, la concentrazione finale di idrossilammina durante la reazione di tempra dovrebbe essere di 0,7 mg/mL.
  15. Mescolare bene la soluzione e scartare il surnatante. Sciacquare la fibra PLGA modificate in superficie due volte con 10 mL di acqua ultrapura per rimuovere qualsiasi non coniugata GRFT.
  16. Trasferire la fibra ad una capsula di Petri e posto all'interno di un essiccatore fino a quando la fibra è completamente asciutta. Trasferimento di Petri a 4 ° C per deposito.

3. SEM caratterizzazione di GRFT superficie-modificata fibre

Monte campione
  1. luogo una striscia di nastro biadesivo carbonio su un SEM. Etichettare il fondo del supporto del campione con le informazioni di identificazione del campione usando un pennarello indelebile.
  2. Tagliare tre campioni da una fibra ottica modificate in superficie e metterli su supporti separati esemplare. Lo spessore di ogni campione è di circa 0,5 mm.
  3. Polverizzi ricoprire i campioni utilizzando deposizione delle particelle di elettrone-indotta da un piatto di oro. Sputter cappotto per 90 s, a 2,4 kV.
    Nota: Il tempo di cappotto Polverizzi variano a seconda dei parametri di attrezzature, tra cui tensione e amperaggio.
  4. i campioni di immagine a 8 kV con un ingrandimento che vanno da 1.000 a 5, 000 x.

4. Estrazione di GRFT da fibre modificate in superficie

  1. massa fuori 2 mg di fibra in triplice copia in provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
  2. Aggiungere solfossido dimetilico 1ml (DMSO) nella provetta, quindi vortex e incubare per 1 min a temperatura ambiente per sciogliere completamente la fibra.
  3. Dopo l'incubazione, diluire un'aliquota di 10 µ l di la soluzione di DMSO-fibra dalla fase 4.2, almeno 100 volte in tampone Tris-EDTA (TE) (pH = 8,0).
  4. Conservare i campioni a-20 ° C fino al caricamento di caratterizzazione con ELISA.

5. Misura GRFT desorbimento dalle fibre

  1. per valutare la quantità di GRFT rilasciato o sotto esame desorbita dalla fibra, pesare 5-10 mg di modificazione superficiale della fibra e posto in un tubo del microcentrifuge. Registrare la massa di fibra in ciascun tubo.
  2. Aggiungere 1 mL di una soluzione adeguata che riproduce l'ambiente fisiologico (per esempio, PBS, buffer di TE, fluido vaginale simulato (SVF), ecc.) per ogni campione.
  3. Incubare i campioni per 1 ora su un agitatore rotante a 200 giri/min, 37 ° C.
  4. Dopo incubazione, rimuovere circa 1 mL di buffer di TE contenente il GRFT desorbito dal flaconcino e aliquota al cluster tubi. Conservare a-20 ° C fino alla quantificazione della proteina.
  5. Trasferire il campione ad un nuovo tubo del microcentrifuge, aggiungere 1 mL di soluzione tampone fresco alla fibra all'interno del tubo del microcentrifuge e incubare fino al prossimo punto di tempo.
  6. Punti di tempo tipico usati per misurare il rilascio includono: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 ore e 1 settimana desorbimento trascurabile è stata osservata in questi studi dopo 4 h.

6. Quantificazione di estrazione GRFT e desorbimento via ELISA

  1. cappotto a 96 pozzetti ELISA piastra con 0,1 mL di HA (10 µ g/mL) per pozzetto come precedentemente descritto 51. Sigillare la piastra con la pellicola di plastica e incubare per una notte a 4 ° C ( Figura 4).
  2. Rimuovere il tampone di rivestimento e aggiungere 0,3 mL bloccante tampone (2-3% albumina di siero bovino (BSA) in PBS con 0.05% polisorbato 20) ad ogni pozzetto. Incubare la piastra per almeno 2 ore a temperatura ambiente.
  3. Dopo l'incubazione, risciacquare la piastra 3 volte con PBS 1x con 0,1% polisorbato 20 (PBS-P). Dopo il risciacquo, pipettare 0,1 mL di campione, standard o PBS come controllo negativo nei relativi pozzetti. Incubare la piastra ancora per 1 ora a temperatura ambiente.
  4. Risciacquare la piastra 3 volte con PBS-P. Dopo il risciacquo, aggiungere 0,1 mL di anticorpo primario (antisiero anti-GRFT di capra) in ogni pozzetto e incubare per almeno 1 h a temperatura ambiente. In genere, la soluzione di anticorpo primario è diluita 1: 10.000 in PBS.
  5. Dopo incubazione dei campioni con risciacquo di anticorpo primario le piastre ancora 3 volte con PBS-P. Aggiungere 0,1 mL di anticorpo secondario (perossidasi di rafano (HRP)-anti-capra coniglio coniugato IgG) ad ogni pozzetto ed incubare per 1 h a temperatura ambiente. La soluzione di anticorpo secondario è diluita 1: 10.000 in PBS.
  6. Lavare la piastra 3 volte. Aggiungere 0,1 mL TMB 2-perossidasi substrato in ciascun pozzetto. Monitorare lo sviluppo del colore (circa 2 min), quindi aggiungere 0,1 mL H 2 così 4 (1 N) per placare la reazione. Leggere la piastra a 450 nm in un lettore di piastra.
  7. Media dei valori OD di sfondo (pozzi che ricevono solo PBS) e questo deve essere sottratto i gruppi sperimentali.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Morfologia delle fibre ha un effetto significativo sulla capacità di modificazione superficiale EFs per fornire protezione contro i virus. Anche se elettrofilatura è una procedura semplice e conveniente, formulazioni polimeriche non ottimizzato possono provocare la morfologia delle fibre irregolari (Figura 5B-C). Alterazioni in condizioni di elettrofilatura che risultano nella formazione di morfologie di mat-come perline o amorfe, sono spes...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Grazie alle strutture porose e grandi superfici, EFs hanno trovato una varietà di applicazioni nel settore sanitario, uno dei quali comprende che serve come veicoli di consegna terapeutico. Farmaci e altri agenti attivi possono essere incorporati all'interno di EFs per consegna sintonizzabile, mentre biologics e leganti chimici possono essere coniugati alla superficie della fibra per cellula-specifico targeting52 o biosensoristica53. Qui la fabbricazione di GRFT modificate...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Siamo grati al fondo patrimonio ebraico per eccellenza per la ricerca di finanziamenti. Ringraziamo il Dr. Stuart Williams II per generosamente fornendo l'utilizzo del sistema di elettrofilatura. Ringraziamo anche il Dr. Kenneth Palmer per averci fornito con Griffithsin. Ringraziamo inoltre Dr. Nobuyuki Matoba e suo laboratorio per la formazione di che noi nell'ELISA GRFT lavorare.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50LactelB6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)Thermo Scientific 147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2Brico Medical SuppliesBN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tipVWR309657
Parafilm (plastic film)Sigma AldrichP7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)Sigma AldrichM3671 
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653
Potassium ChlorideSigma AldrichP9333
Sodium phosphate dibasicSigma AldrichS7907
Potassium phosphate monobasicSigma AldrichP0662
Hydroxysuccinimide (NHS)Thermo Scientific 24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)Thermo Scientific 22980
2-MercaptoethanolFisherBP176
Griffithsin (GRFT)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Dimethyl SulfoxideMilipore317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)Sigma AldrichP9416 
Tris EDTA BufferSigma Aldrich93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well PlatesThermo Scientific 3355
Influenza Hemagglutinin (HA)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)Santa Cruz2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase SubstrateKPL52-00-00

Riferimenti

  1. Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
  2. Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
  4. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  5. Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
  6. Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
  7. Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  8. Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
  9. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  10. Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
  11. Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
  12. Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792(2012).
  13. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  14. Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
  15. Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
  16. Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
  17. Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
  18. Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
  19. Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
  20. Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  21. Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
  22. Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
  23. Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108(2010).
  24. Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
  25. Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
  26. Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
  27. Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
  28. Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
  29. Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
  30. Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
  31. Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
  32. Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
  33. O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
  34. Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
  35. Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
  36. Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
  37. Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635(2011).
  38. Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
  39. Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
  40. Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
  41. Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
  42. Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
  43. O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
  44. Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
  45. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
  46. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
  47. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
  48. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
  49. Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
  50. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
  51. Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
  52. Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
  53. Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
  54. Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
  55. Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
  56. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
  57. Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
  58. Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
  59. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
  60. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
  61. Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
  62. Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
  63. Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
  64. Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
  65. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  66. Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Bioingegneriaproblema 128fibre elettrofilatesessualmente trasmesse infezionivirus dell immunodeficienza umanamodificazione della superficiemicrobicidaGriffithsinpoli acido lattico co glicolico

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati