细胞聚集法评价果蝇切口与反式配体的结合及其对顺式配体的抑制作用

摘要

复杂的在体内系统, 使得很难区分的激活和抑制的缺口受体的跨-和cis配体, 分别。在这里, 我们提出了一个基于体外细胞聚合的方法, 用于定性和半定量评价的结合的果蝇缺口, 以跨配基与顺式配基。

摘要

缺口信号是一种进化保守的细胞-细胞通讯系统, 广泛用于动物发育和成人维护。缺口受体与相邻细胞配体的相互作用诱导信号通路激活 (反式激活), 而同一个细胞的配体相互作用抑制信号传导 (cis抑制)。在跨激活和cis抑制之间的适当平衡有助于在动物发育过程中的某些环境中建立最佳的缺口信号水平。由于凹槽及其配体在许多细胞类型中的重叠表达域和反馈机制的存在, 研究了给定的修饰修改对跨-与cis-缺口相互作用的影响它的配体在体内是困难的。在这里, 我们描述了一个协议, 使用果蝇S2 细胞在细胞聚集的分析, 以评估的影响, 敲下一个缺口通路修饰符的约束力, 每个配体在跨和cis。S2 细胞稳定或瞬时转染一个缺口表达载体与表达每个缺口配体 (S2-Delta 或 S2-Serrate) 的细胞混合。反式-受体与配体之间的结合导致异型细胞聚集物的形成, 并以每毫升和 #62 组成的集料数计算; 6 细胞。为了研究顺式-配体的抑制作用, S2 细胞 co-expressing 凹槽和各配基与 S2-Delta 或 S2-Serrate 细胞混合, 聚合数量按上述方法量化。由于顺式-配体的存在而导致的骨料数量相对减少, 提供了一种测量顺式-配基介导的抑制反式绑定的措施。这些简单的化验可以提供半定量的数据关于基因或药理操作对切口的结合的作用对它的配体, 并且能帮助破译基础的分子机制在体内作用这种对缺口信号的操控。

引言

标准缺口信号是一个短程细胞的细胞通信机制, 需要物理接触相邻细胞, 以促进相互作用的缺口受体和他们的配体¹。缺口受体与配体 (目前在信号接收细胞表面) 的相互作用 (目前在信号发送细胞的表面) 启动缺口信号, 称为反激活²。另一方面, 缺口与其配体在同一细胞中的相互作用导致切口通路的抑制, 被称为cis抑制³。跨-和cis-交互之间的平衡需要确保最佳配体依赖性缺口信号⁴。果蝇有一个缺口受体和两个配体 (三角洲和锯齿), 而不是哺乳动物, 其中有四缺口受体和五配体 [锯齿状 1 (JAG1), JAG2, 三角洲样 1 (DLL1), DLL3 和 DLL4]⁵。在这种简单的情况下,果蝇模型提供了易于解剖/研究通路修饰剂对缺口配体相互作用和随后的缺口信号的影响。在某些情况下在动物发展期间(包括翼发展在果蝇), 两个cis-和跨-相互作用参与获得适当的缺口信号和细胞命运¹⁶.在这些上下文中, 区分缺口路径修饰符对cis-与跨-缺口及其配体的相互作用的影响是很重要的。

我们的小组以前报告说, 添加一种叫做木糖的碳水化合物残渣到果蝇缺口在某些上下文中负调节缺口信号, 包括机翼开发⁷。损失的欺诈 (xylosylates 缺口的酶) 导致 "机翼静脉丢失" 表型 ⁷。最近, 利用基因剂量试验和克隆分析表明, 欺诈的损失提高了三角洲介导的缺口. 要区分 "欺诈" 突变体中增强的缺口信号是否是由于减少了 cis抑制或增加了跨激活, 在幼虫翅形象盘中的缺口配体的异位表达研究已执行使用dpp-GAL4驱动程序。这些实验提供的证据表明, 在不影响凹槽cis的情况下, 在配体⁸的作用下, 该方法可调节反式--由 Delta 激活。然而, 反馈规则和内源性配体的作用可能使异位表达研究的解释复杂化^1,6,9。

为解决此问题, 使用了果蝇S2 单元格¹⁰ , 它提供了一个简单的体外系统, 用于缺口配体相互作用研究^11,12。S2 细胞不表达内源性缺口受体和三角洲配体¹¹ , 表达低锯齿状的¹³, 这不影响缺口配体聚合实验⁸。因此, S2 细胞可以稳定或瞬时转染的缺口和/或个别配体 (三角洲或锯齿), 以产生细胞, 完全表达的缺口受体或其中一个配体, 或他们的组合。S2 细胞配体表达 S2 细胞的混合表现为由受体配体介导的异型团聚体的形成^11,12,14。聚合形成的定量化提供了一种测量缺口与其配体之间的跨绑定的方法¹⁵ (图 1)。同样, S2 细胞可以 co-transfected 与缺口和三角洲或有锯齿配体 (即 cis-配体)。Cis-在这些凹槽表达 S2 细胞的配体中, 用反式配基废除凹槽的绑定, 并导致聚合形成减少^8,12,14。由顺式-配体引起的集料形成的相对减少, 提供了一种在凹槽和反式配体 (图 2) 之间绑定的cis配体的抑制效果的测量。因此, 利用细胞聚集分析研究了 xylosylation 对反式和cis-缺口与配体之间相互作用的影响。

在这里, 我们提出了一个详细的细胞聚集试验的协议, 目的是评估的结合,反式配体和它的抑制, 由cis-配基使用果蝇S2 细胞。例如, 我们提供的数据使我们能够确定缺口 xylosylation 对缺口和跨-Delta⁸之间的绑定的影响。这些简单的分析提供了一个半定量评估缺口配体相互作用的体外和帮助确定的分子机制的基础上的体内的效果的缺口途径修饰。

研究方案

1. 为欺诈击倒的双绞 RNA (dsRNA) 的制备

1. 产品的 PCR 扩增
   1. 使用野生类型的黄白色(y w) 基因组 DNA 和pAc5.1-EGFP作为模板和下面的入门对来放大 dsRNA 合成中使用的 DNA 片段。使用以下 PCR 热剖面: 变性 (95 ° c, 三十年代), 退火 (58 ° c, 三十年代) 和延长 (72 ° c, 1 min)。
      增强型绿色荧光蛋白(EGFP) dsRNA 底漆 (5 "-3")-
      正向引物-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      反向底漆-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      dsRNA 底漆 (5 "-3")-
      正向引物-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      反向底漆-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      注意: EGFP dsRNA 用作负控制。
2. 根据制造商的协议, 用商业凝胶纯化试剂盒凝胶纯化聚合酶链反应 (PCR) 产品。
3. 根据制造商的协议, 使用能够从 T7 启动子转录的商用产品进行体外转录。
4. 根据制造商的协议和存储在-80 ° c, 纯化 dsRNA 使用 RNA 提纯试剂盒。
5. 使用以下步骤评估欺诈击击的效率 (1.5. 1-1. 5.5).
   1. 使用例和板 5 x 10⁵ S2 单元, 在1毫升/施耐德培养基中的6个井板的每一个井中, 加上10% 胎牛血清 (FBS) 和100的 U/毫升青霉素-链霉素, 对这些细胞进行手工计数。
   2. 添加7.5 µg 的EGFP-或欺诈 dsRNA 每个井和孵化在25° c 24 小时.
   3. 获取控制 (EGFP dsRNA 处理) 和欺诈 dsRNA 处理的 S2 细胞由温和的移, 然后在 1000 x g 的离心化, 在25° c 5 分钟, 并通过 rna 提取试剂盒的 rna 分离过程, 根据制造商的协议。
   4. 利用 qPCR 试剂和底漆/探针和以下 pcr 热剖面 (95 ° c, 十五年代) 和退火/延长 (60 ° c, 1 分钟), 用分光光度计和过程100的 rna 对 rna 进行量化, 用于1步 qRT pcr。
      注: 请参见材料表, 以获取有关入门/探头集和用于欺诈的仪器的信息, 并在这些研究中控制 qRT PCR 实验.
   5. 使用 2 ^-ΔΔCT方法¹⁶计算相对欺诈 mRNA 级别。

2. 评价切口受体与反式配体之间的结合

1. 准备信号接收细胞 (S2 细胞表达缺口受体)。
   1. 使用例和板 5 x 10⁵ S2 和稳定的 S2-Notch 单元, 在1毫升/好的施耐德培养基中加上 10% FBS 和 100 U/毫升青霉素-链霉素, 以手动计数单元格。
      注: 对于 S2-Notch 细胞, 可从果蝇基因组资源中心 (DGRC), 添加 200 nM 甲氨蝶呤在媒体。准备一个0.5 毫米的甲氨蝶呤库存解决方案, 首先准备20毫米甲氨蝶呤溶液250µL 1 米氢氧化钠。其次, 稀释此溶液为0.5 毫米在1米磷酸盐缓冲盐水和商店在-20 ° c。在 S2-Notch 细胞中, 缺口蛋白的表达在pMT向量中由果蝇金属硫蛋白启动子控制。
   2. 每井加7.5 µg dsRNA, 在25° c 下孵育24小时。
   3. 添加 0.7 mM 丘索₄以诱导凹槽的表达, 并在25° c 下孵育3天。
      注: 丘索₄用于诱导金属硫蛋白启动子控制的蛋白质表达。
2. 准备信号发送细胞 (S2 细胞表达三角洲或有锯齿配体)。
   1. 使用例和板〜 5 x 10⁶稳定 S2-Delta 或 S2-Serrate^Tom单元格, 在1毫升/好的施耐德培养基中补充 10% FBS 和 100 U/毫升青霉素-链霉素, 以手动计数单元格。
      注: 添加 200 nM 甲氨蝶呤为 S2-Delta 细胞和100µg/毫升霉 S2-Serrate^汤姆细胞在媒体。三角洲和锯齿的表达式^汤姆-一个番茄标记, 功能版本有锯齿的¹²-在pMT向量中的果蝇金属硫蛋白启动子下。
   2. 添加 0.7 mM 丘索₄以诱导配体的表达, 并在25° c 下孵育3小时。
3. 执行信号发送和信号接收单元之间的聚合。
   1. 用温和的移和平板 2.5 x 10⁵细胞 dsRNA 处理的 S2 (控制) 和 S2-Notch 细胞, 在24井板上通过手工计数例。
   2. 将 5 x 10⁵稳定 S2-Delta 或 S2-Serrate^Tom单元格添加到施耐德培养基的200µL 的总容量中 (辅以 10% FBS 和100的 U/毫升青霉素-链霉素)。
      注: 所有 S2 细胞处理 (包括电镀、诱导和 dsRNA 处理) 在生物安全柜下进行。
   3. 将盘放在 150 rpm (942.48 rad/分钟) 的轨道振动筛上。
   4. 1分钟后, 将每一个井的内容混合, 取20µL, 计算骨料数。
      1. 同时采用10x 放大 (PLL 10/0.25 目标) 在倒置复合显微镜下进行具有代表性的图像。
      2. 使用例手动计数聚合 (和 #62; 6 单元格)。
   5. 把盘子放在振动筛上。
   6. 重复图像采集和计数后5分钟和15分钟的聚合。
4. 执行反绑定的量化。
   1. 计算 S2 单元格和 S2-Delta 或 S2-Serrate^Tom单元格之间的每个 mL 的聚合数, 作为后台控件。
   2. 计算 S2-Notch 和 S2-Delta 或 S2-Serrate^Tom单元格之间每毫升的聚合数 (跨绑定的大小)。

3。由顺式配体对缺口与反式配体结合的抑制作用的评价

1. 准备信号接收单元。
   1. 板 5 x 10⁵ S2 细胞在6井板的每井1毫升/好的施耐德培养基补充 10% FBS 和 100 U/毫升青霉素-链霉素。
   2. 每井加7.5 µg dsRNA, 在25° c 下孵育24小时。
   3. 用pBluescript和pmt-缺口¹¹ (DGRC) 单独或与pmt-凹槽和pmt-增量¹¹ (DGRC) 或pmt-锯齿 ¹⁷共用 dsRNA 处理过的单元格根据制造商的协议, 使用商业转染试剂, 2 µg/井的 DNA 浓度。
      注意: pBluescript用作控件。co-transfected 细胞将被称为 S2-Notch 和 #38;D elta^瞬态或 S2-Notch 和 #38; 有锯齿的^瞬态单元格。
   4. 在25° c 下孵育瞬时转染的 S2 细胞24小时。
   5. 添加 0.7 mM 丘索₄以诱导切口和配体的表达, 并在25° c 下孵育3天。
2. 准备信号发送单元, 如2.2 所述。
3. 如2.3 节所述, 执行信号发送和信号接收单元之间的聚合。
4. 通过cis配体对反式绑定进行量化抑制。
   1. 在 S2 单元格和 S2-Delta 或 S2-Serrate 单元格之间计算每个 mL 的聚合数作为背景控件。
   2. 通过以下方式量化cis-配体的抑制程度。
      1. 将 A定义为 S2-Notch^瞬态和 S2-Delta 单元格之间的聚合数。
      2. 将B定义为 S2 单元格之间的聚合数, 瞬时 co-transfected 与凹槽和 Delta (S2-Notch 和 #38;D elta^瞬态) 和 S2-Delta 单元格之间。
      3. 计算相对聚合C = (B x 100)/A
      4. 用cis-配体 (δ或有锯齿) 作为 100- C计算抑制的大小。
         注意: 举个例子, 如果相对聚合为 45%, 则cis-配体被认为是抑制跨绑定的55%。

结果

我们的在体内的观察表明, xylosyltransferase 基因的损失, 欺诈导致增益缺口信号由于增加三角洲介导的 跨-激活的缺口不影响cis抑制凹槽由配体⁸。为了测试这一概念,体外细胞聚合化验被执行。首先, S2 单元格中的欺诈表达式被使用 dsRNA 击倒. EGFP dsRNA 用作控件。用 real-time PCR 法检测了击倒 (KD) 的效率, ?...

讨论

标准缺口信号依赖于缺口受体与它的配体⁵之间的相互作用。虽然大多数研究的缺口通路主要考虑到缺口和配体的结合在相邻的细胞 (跨), 缺口和相同细胞配基确实相互作用, 这些 so-called 的cis-相互作用可以发挥抑制作用的缺口信号^3,4。因此, 要破译修饰符对标准缺口信号的影响的机制, 通常要检查两种类型的缺口配体相互?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified	Lonza	04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution	GE Healthcare lifescience	SV30010
CELLSTAR 6 well plate	Greiner Bio-One	657 160
CELLSTAR 24 well plate	Greiner Bio-One	662160
VWR mini shaker	Marshell Sceintific	12520-956
Hemocytometer	Fisher Sceintific	267110
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit	Ambion	AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)	Zymo Research	R1054
VistaVision Inverted microscope	VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software	AmScope	MU-900	Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
Fetal Bovine Serum	GenDepot	F0600-050
Methotrexate	Sigma-Aldrich	A6770-10
Hygromycin B	Invitrogen	HY068-L6
Copper sulphate	Macron Fine Chemicals	4448-02
S2 cells	Invitrogen	R69007
S2-SerrateTom cells			Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells	DGRC	152
S2-Notch cells	DGRC	154
pMT-Delta vector	DGRC	1021	Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector			Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector	DGRC	1022	Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP			Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit	Applied Biosystem	1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)	Applied Biosystem	Dm02144576_g1	with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)	Applied Biosystem	Dm02151827_g1	with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	4351405	96-well Block module