JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Сложность систем в естественных условиях делает его трудно отличить активации и торможения рецептора Notch транс- и СНГ-лигандов, соответственно. Здесь мы представляем протокол, основанный на в пробирке клеток агрегации анализов для качественного и полуколичественного оценки привязки дрозофилы Notch транс-лигандов против СНГ-лигандами.

Аннотация

Вырезка сигнализации является эволюционно сохранены ячеек системы связи, широко используется в развития животных и взрослых обслуживания. Взаимодействие рецептора Notch с лигандами из соседних клеток вызывает активацию сигнальный путь (транс-активации), в то время как взаимодействие с лигандами из той же клетке подавляет сигнализации (СНГ-торможение). Надлежащий баланс между транс-Активация и СНГ-ингибирование помогает создавать оптимальные уровни Notch сигнализации в некоторых контекстах во время развития животных. Из-за перекрывающихся выражений домены Notch и его лигандов во многих типах клеток и существование механизмов обратной связи, изучению влияния данного столб-поступательные изменения на транс- против СНГ-взаимодействий выемки и его лигандов в естественных условиях трудно. Здесь мы описываем протокол для использования дрозофилы S2 клеток в клетки агрегации анализов для оценки последствий стучать вниз паз путь модификатор в привязке паз для каждого лиганда в транс и в СНГ. S2 клетки стабильно или временно transfected с Notch выражая вектора смешиваются с клетками, выражая каждый паз лиганда (S2-Дельта или зазубренными S2). Транс-связывание рецептора и лигандами приводит к образованию агрегатов гетеротипичной клеток и измеряется количество агрегатов на мл, состоящий из > 6 клеток. Для изучения тормозящий эффект СНГ-лигандов, S2 клетки совместно выражая Notch и каждого лиганда смешиваются с S2-Дельта или S2-зазубренными клеток и количество агрегатов количественно как описано выше. Относительное сокращение числа агрегатов благодаря наличию СНГ-лигандов представляет собой меру СНГ-лиганд-опосредованной ингибирование транс-привязки. Эти просто анализов может обеспечить полу количественные данные о воздействии генетических или фармакологических манипуляций в привязке выемки его лигандов и может помочь расшифровка молекулярные механизмы, лежащие в основе в естественных условиях эффекты Подобные манипуляции на выемку сигнализации.

Введение

Канонические Notch сигнализации является механизм ближней связи к ячейке, который требует физический контакт соседних клеток для облегчения взаимодействия между Notch рецепторов и их лиганды1. Взаимодействие с лигандами рецептора Notch (присутствует на поверхности клеток приема сигнала) (на поверхности отправки сигнала клетки) инициирует Notch сигнализации и известен как транс-активации2. С другой стороны, взаимодействие между Notch и его лигандов в той же ячейке приводит к ингибированию Notch путь и известен как СНГ-ингибирование3. Баланс между транс- и СНГ-взаимодействий необходим для обеспечения оптимальной лиганд зависимых Notch сигнализации4. Дрозофилы имеет один рецептора Notch и два лигандами (Дельта и Серрате) в отличие от млекопитающих, которые имеют четыре Notch рецепторов и пять лигандов [зубчатые 1 (JAG1), JAG2, 1 (DLL1), Дельта как DLL3 и DLL4]5. Имея это простота, дрозофилы модель предлагает простота учиться анализировать/эффекты модификаторы пути на паз лиганд взаимодействий и впоследствии Notch сигнализации. В некоторых контекстах во время развития животных (включая развитие крыла у дрозофилы), СНГ- и транс-взаимодействий участвуют для достижения надлежащего Notch сигнализации и клеточной судьба1,6 . Важно различать воздействия Notch путь модификаторов в этих контекстах на СНГ- против транс-взаимодействий паз с ее лигандами.

Наша группа ранее сообщалось, что добавление углеводный остаток, называется Ксилоза дрозофилы Notch отрицательно регулирует Notch сигнализации в определенных контекстах, включая крыло развития7. Потеря Шамс (фермента, xylosylates выемка) приводит к фенотип «потеря крыла вен»7. Совсем недавно гена дозировка экспериментов и клоновых анализа были использованы для показать, что потеря Шамс повышает выделение Дельта опосредованной Notch. Чтобы отличить ли расширение сигнализации паз в мутантов Шамс является результатом снижения СНГ-ингибирование или увеличение транс-активации, внематочная гиперэкспрессия исследования Notch лигандов в личиночной крыла имагинальных дисков с помощью dpp-GAL4 драйвера были исполнены. Эти эксперименты представила доказательства о том, что Шамс регулирует транс-активация Notch Дельта не затрагивая Notch СНГ-ингибирование лигандов8. Однако, обратной связи правила и эффекты эндогенного лиганда может усложнить толкование внематочная гиперэкспрессия исследования1,6,9.

Для решения этой проблемы, дрозофила S2 клетки10 были использованы, которые обеспечивают простой в vitro системы паз лиганд взаимодействия исследования11,12. S2 клетки не выразить эндогенного рецептора Notch и Дельта лигандом11 и Экспресс низкий уровень зубчатыми13, которая не влияет на паз лиганд агрегации эксперименты8. Таким образом S2 клетки могут стабильно или временно transfected Notch и/или отдельных лигандами (Дельта или Серрате) для генерации клеток, которые исключительно Экспресс рецептора Notch или один из его лигандов, или их комбинации. Смешивание Notch выражая S2 клеток с лигандом выражая S2 клеток приводит к образованию гетеротипичной агрегатов, при посредничестве рецептор лиганд привязки11,12,14. Количественная оценка совокупного образования представляет собой меру транс-привязки между Notch и его лигандов15 (рис. 1). Аналогичным образом, S2 клетки могут быть совместно transfected с Notch и Дельта или Серрате лигандами (т.е. СНГ-лигандами). СНГ-лигандов в этих клетках Notch выражая S2 отменить привязку паз с транс-лигандов и результат в снижение совокупного формирования8,12,14. Относительное уменьшение совокупного формирования, вызванных СНГ-лигандов представляет собой меру тормозящий эффект СНГ-лигандов на привязку между Notch и транс-лигандами (рис. 2). Соответственно, анализов агрегации клеток были использованы для изучения влияния потери xylosylation на транс- и СНГ-взаимодействий между Notch и его лигандами.

Здесь мы представляем подробный протокол для анализов агрегации клеток, направленных для оценки привязки паз с транс-лигандов и его ингибирование СНГ-лигандов с использованием дрозофилы S2 клеток. В качестве примера, мы предоставляем данные, которые позволили нам определить эффект xylosylation паз на привязку между Notch и транс-Дельта8. Эти просто анализы полуколичественного оценку Notch лиганд взаимодействий в пробирке и помочь определить молекулярные механизмы, лежащие в основе эффекты в vivo Notch путь модификаторов.

протокол

1. Подготовка двойной мель РНК (dsRNA) Шамс нокдаун

  1. Амплификации PCR продукции
    1. Используйте одичал тип Желтый Белый (y w) геномной ДНК и pAc5.1-EGFP как шаблон и следующие пары праймера для того чтобы усилить фрагментов ДНК используется в синтезе двуцепочечной ДНК. Используйте следующие ПЦР теплового профиля: денатурация (95 ° C, 30 s), отжига (58 ° C, 30 s) и расширения (72 ° C, 1 мин).
      Более Зеленый флуоресцирующий белок Праймеры двуцепочечной ДНК (EGFP) (5' - 3')-
      Форвард грунт GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Обратный грунт GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Шамс dsRNA грунтовки (5' - 3')-
      Форвард грунт TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Обратный грунт TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      Примечание: EGFP двуцепочечной ДНК используется в качестве отрицательного контроля.
  2. Гель очищайте и полимеразной цепной реакции (ПЦР) продуктов с использованием коммерческих гель комплект очистки согласно протоколу от производителя.
  3. Выполните в vitro транскрипция с помощью коммерческий продукт, способный транскрипции от промоутера T7 согласно протоколу от производителя.
  4. Очистить двуцепочечной ДНК с помощью РНК очистка kit по данным производителя протокол и хранить при температуре-80 ° C.
  5. Оценить эффективность Шамс нокдаун, используя следующие шаги (1.5.1-1.5.5).
    1. Счетчик клеток, вручную с помощью Горяева и плита 5 x 105 S2 клеток в каждой скважине 6 хорошо пластины в 1 мл/хорошо Шнейдера среднего дополнена 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) и 100 ед/мл пенициллин-стрептомицином.
    2. Добавить 7.5 мкг EGFP- или Шамс двуцепочечной ДНК в каждой скважине и Инкубируйте на 25 ° C в течение 24 ч.
    3. Урожай управления (EGFP двуцепочечной ДНК лечение) и Шамс двуцепочечной ДНК лечение S2 клетки, нежный закупорить следуют грануляции вниз центрифугированием на 1000 x g 5 мин при 25 ° C и процесс для изоляции РНК с помощью РНК добыча комплект согласно Протокол от производителя.
    4. Количественного определения РНК с помощью спектрофотометра и процесс 100 нг РНК для 1-шаг qRT ПЦР с использованием коммерческих ПЦР реактивы и грунт/датчики и следующие ПЦР теплового профиля: денатурация (95 ° C, 15 s) и отжиг/расширение (60 ° C, 1 мин).
      Примечание: Смотрите Таблицу материалов для получения информации о грунт/зонд наборы и инструмент, используемый для экспериментов qRT ПЦР -Шамс и управления в этих исследованиях.
    5. Вычислите с помощью 2–ΔΔCT метод16уровни mRNA относительной Шамс .

2. Оценка связывание рецептора Notch и транс-лигандами

  1. Подготовка приема сигнала клетки (S2 выражая рецептора Notch).
    1. Подсчет количества ячеек, вручную с помощью Горяева и Клемная 5 x 105 S2 и стабильной S2-Notch клеток в каждой скважине 6-ну пластины в 1 мл/хорошо Шнейдера среднего дополнена 10% FBS и 100 ед/мл пенициллин-стрептомицином.
      Примечание: Для S2-Notch клеток, которые доступны из центра ресурсов геномики дрозофилы (НАУЧНЫМ), добавьте 200 Нм метотрексата в средствах массовой информации. Чтобы подготовить метотрексат раствор 0,5 мм, сначала Подготовьте 20 мм метотрексат раствор в 250 мкл 1 M NaOH. Далее Разбавьте это решение до 0,5 мм в 1 М фосфатный буфер и хранить при температуре от-20 ° C. В клетках S2-паз экспрессия белка Notch находится под контролем промотора металлотионеина дрозофила в векторе ПЛТ .
    2. Добавить 7.5 мкг двуцепочечной ДНК в каждой скважине и Инкубируйте на 25 ° C в течение 24 ч.
    3. Добавление 0,7 мм4 CuSO побудить выражение Notch и инкубировать при 25 ° C в течение 3 дней.
      Примечание: CuSO4 используется для вызывают экспрессию белков контролируется металлотионеина промоутер.
  2. Подготовьте отправки сигнала клетки (клетки S2 выражая Дельта или Серрате лигандами).
    1. Подсчет количества ячеек, вручную с помощью Горяева и пластины ~ 5 x 106 стабильной S2-Дельта или S2-зазубреннымиTom клеток в каждой скважине 6-ну плиты в 1 мл/хорошо Шнейдера среды дополняется 10% FBS и 100 ед/мл пенициллин-стрептомицином.
      Примечание: Добавьте 200 Нм метотрексата для S2-Дельта клетки и 100 мкг/мл hygromycin для S2-зазубреннымитомом клетки в средствах массовой информации. Выражение Delta и зубчатымиTom— помидор меткой, функциональная версия зубчатыми12— под дрозофилы металлотионеина промоутер в векторе ПЛТ .
    2. Добавление 0,7 мм4 CuSO побудить выражение лигандов и инкубировать при 25 ° C в течение 3 ч.
  3. Выполните агрегирование между сигнал отправки и приема сигнала клетки.
    1. Урожай двуцепочечной ДНК лечение S2 (управления) и S2-Notch клетки нежный закупорить и пластины 2,5 x 105 клеток/хорошо в пластине 24-Ну после ручного подсчета Горяева.
    2. Добавить 5 x 105 стабильной S2-Дельта или S2-зазубреннымитомом клетки в общем объеме 200 мкл Шнейдера среды (дополнено с 10% FBS и 100 ед/мл пенициллин-стрептомицином).
      Примечание: Все клетки S2, обработка (включая покрытие, индукция и dsRNA лечение) было сделано под биобезопасности кабинета.
    3. Место пластину на орбитальный шейкер на 150 об/мин (942.48 rad/мин).
    4. После 1 мин смешать содержимое каждой скважины и вывезти 20 мкл для подсчета количества агрегатов.
      1. Одновременно принимать образ представителя под Перевернутый составной микроскоп с использованием 10 крат (PLL цель 10/0,25).
      2. Вручную количество агрегатов (> 6 ячеек) с использованием Горяева.
    5. Место пластину в шейкере.
    6. Повторите захвата изображений и подсчета после 5 минут и 15 минут агрегации.
  4. Выполняют количественной оценки транс-привязки.
    1. Рассчитайте количество агрегатов на мл между S2 клетки и клетки, S2-Дельта или S2-зазубреннымиTom как фон элемента управления.
    2. Рассчитать количество агрегатов на мл между S2-паз и S2-Дельта или S2-зазубреннымитомом клетки (масштабы транс-привязка).

3.Оценка ингибирование Binding между Notch и транс-лигандов СНГ-лигандами

  1. Подготовка клетки приема сигнала.
    1. Клемная 5 x 105 S2 клеток в каждой скважине 6-ну пластины в 1 мл/хорошо Шнейдера среднего дополнена 10% FBS и 100 ед/мл пенициллин-стрептомицином.
    2. Добавить 7.5 мкг двуцепочечной ДНК в каждой скважине и Инкубируйте на 25 ° C в течение 24 ч.
    3. Совместно transfect двуцепочечной ДНК лечение клетки с pBluescript и ПМТ паз11 (НАУЧНЫМ) самостоятельно или с pMT-Notch и ПМТ Дельта-11 (НАУЧНЫМ) или Зазубренными ПЛТдля всего17 Концентрация ДНК 2 мкг/скважины с использованием коммерческих трансфекции реагент согласно протоколу от производителя.
      Примечание: pBluescript используется как элемент управления. Совместно transfected клеток будет называться S2-паз & Deltaпереходных или S2-паз & далее зазубреннымипереходных клеток.
    4. Инкубируйте временно transfected клеток S2 при 25 ° C в течение 24 ч.
    5. Добавление 0,7 мм4 CuSO побудить выражение Notch и лигандами и инкубировать при 25 ° C в течение 3 дней.
  2. Подготовьте отправки сигнала клетки, как описано в 2.2.
  3. Выполните агрегирование между сигнал отправки и приема сигнала клетки, как описано в разделе 2.3.
  4. Количественно ингибирование транс-привязка по СНГ-лигандами.
    1. Рассчитайте количество агрегатов на мл между S2 клетки и клетки, S2-Дельта или зазубренными S2 как фон элемента управления.
    2. Количественно оценить масштабы ингибирование СНГ-лигандов следующим образом.
      1. Определите A как количество агрегатов между S2-Notchпереходных и S2-Дельта клетки.
      2. Определить B как количество агрегатов между ячейками S2 временно совместно transfected с Notch и Дельта (S2-паз & Deltaпереходных) и S2-Дельта клетки.
      3. Рассчитать относительный агрегации C = (B x 100) /A
      4. Рассчитать величину торможения по СНГ- лиганда (Дельта или Серрате) 100- C.
        Примечание: в качестве примера, если относительная агрегации 45%, то СНГ-лигандов считаются подавляют транс-привязки на 55%.

Результаты

Наши замечания в естественных условиях предложил увеличить потерю результатов Шамс гена xylosyltransferase в прирост Notch сигнализации Дельта опосредованной транс-активация паз не затрагивая СНГ-ингибирование Паз на лигандов8. Чтобы проверить ...

Обсуждение

Канонические Notch сигнализации зависит от взаимодействия между рецептора Notch и его лигандов5. Хотя большинство исследований на пути Notch прежде всего рассмотреть связывание Notch и лигандами в соседних клетках (транс), паз и же элементная лиганды взаимодействуют и эти так н...

Раскрытие информации

Авторы имеют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Авторы признают поддержки от NIH/NIGMS (R01GM084135 HJN) и Фонд Мидзутани Glycoscience (Грант #110071 HJN) и благодарны том V. ли для обсуждения и предложения на анализы и Spyros Artavanis-Tsakonas, Хьюго Беллен, Роберт Флеминг, Кен Ирвин и центр ресурсов дрозофилы геномики (НАУЧНЫМ) для плазмидов и клеточных линий.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, ModifiedLonza04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solutionGE Healthcare lifescience SV30010
CELLSTAR 6 well plateGreiner Bio-One657 160
CELLSTAR 24 well plateGreiner Bio-One662160
VWR mini shakerMarshell Sceintific12520-956
HemocytometerFisher Sceintific 267110
FuGENE HD Transfection ReagentPromegaE2311
MEGAscrip T7 Transcription KitAmbionAM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)Zymo ResearchR1054
VistaVision Inverted microscopeVWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced SoftwareAmScopeMU-900Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction KitInvitrogenK210012
Fetal Bovine SerumGenDepotF0600-050
MethotrexateSigma-AldrichA6770-10
Hygromycin BInvitrogenHY068-L6
Copper sulphateMacron Fine Chemicals4448-02
S2 cellsInvitrogenR69007
S2-SerrateTom cellsGift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cellsDGRC152
S2-Notch cellsDGRC154
pMT-Delta vectorDGRC1021Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vectorGift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vectorDGRC1022Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFPGift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step KitApplied Biosystem1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)Applied BiosystemDm02144576_g1 with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)Applied BiosystemDm02151827_g1with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR systemApplied Biosystem435140596-well Block module

Ссылки

  1. de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
  2. Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
  3. del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
  4. Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
  5. Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
  6. Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
  7. Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).
  8. Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).
  9. Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
  10. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
  11. Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
  12. Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
  13. Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
  14. Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
  15. Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  17. Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
  18. Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
  19. Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
  20. Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

131S2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены