Cellule des épreuves d’agrégation pour évaluer la liaison de l’encoche de la drosophile avec Trans-Ligands et son Inhibition par Cis-Ligands

Résumé

Complexité des systèmes de in vivo , il est difficile de distinguer entre l’activation et inhibition du récepteur Notch par trans- et cis-ligands, respectivement. Nous présentons ici un protocole basé sur in vitro tests cellulaires-agrégation pour évaluation qualitative et semi quantitative de la liaison de l’encoche de la drosophile à trans-ligands vs cis-ligands.

Résumé

La signalisation Notch est un système de communication de cellules évolutivement conservés utilisé largement en développement animal et entretien adulte. Interaction des récepteurs Notch avec des ligands de cellules voisines induit l’activation de la voie de signalisation (trans-activation), tandis que l’interaction avec les ligands de la même cellule inhibe la signalisation (cis-inhibition). Juste équilibre entre trans-activation et cis-inhibition permet d’établir des niveaux optimaux de la signalisation Notch dans certains contextes au cours du développement animal. En raison des domaines d’expression qui se chevauchent de Notch et ses ligands dans plusieurs types de cellules et de l’existence de mécanismes de rétroaction, étudier les effets d’une modification post-traductionnelle donnée sur trans- et cis-interaction de la protéine Notch et ses ligands in vivo est difficile. Nous décrivons ici un protocole pour l’utilisation de cellules S2 Drosophila lors d’essais de la cellule-agrégation d’évaluer les effets de faire tomber un modificateur de parcours de Notch sur la liaison de la protéine Notch à chaque ligand dans trans et cis. Cellules S2 stablement ou transitoirement transfectées avec un vecteur exprimant l’encoche sont mélangés avec les cellules exprimant chaque ligand de Notch (S2-Delta ou S2-Serrate). TRANS-liaison entre les récepteurs et ligands se traduit par la formation d’agrégats cellulaires hétérotypiques et est mesurée en termes de nombre d’agrégats par mL composé de > 6 cellules. D’examiner l’effet inhibiteur du cis-ligands, S2 cellules exprimant conjointement Notch et chaque ligand sont mélangées avec des cellules S2-Delta ou S2-Serrate et le nombre d’agrégats est quantifié comme décrit ci-dessus. La diminution relative du nombre d’agrégats en raison de la présence de cis-ligands fournit une mesure de cis-ligand-médiée par l’inhibition de la trans-liaison. Ces tests simples peuvent fournir des données semi-quantitatives sur les effets des manipulations génétiques ou pharmacologiques sur la liaison de la protéine Notch à ses ligands et peuvent aider à déchiffrer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets in vivo des ces manipulations sur la signalisation Notch.

Introduction

La signalisation Notch canonique est un mécanisme de communication de cellule à cellule à courte portée qui nécessite un contact physique des cellules pour faciliter l’interaction entre les récepteurs Notch et leurs ligands¹voisines. Interaction des récepteurs Notch (présent sur la surface des cellules de récepteur de signal) avec des ligands (présentes à la surface de l’envoi de signal cellules) initie la signalisation Notch et est connu comme trans-activation². En revanche, l’interaction entre l’encoche et ses ligands dans la même cellule entraîne l’inhibition de la voie Notch et est connue comme cis-inhibition³. L’équilibre entre trans- et cis-interactions est nécessaire pour assurer optimale ligand-dépendants encoche⁴de signalisation. Drosophile a un récepteur de Notch et deux ligands (Delta et Serrate) par opposition à des mammifères, qui ont quatre récepteurs Notch et cinq ligands [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-like 1 (DLL1), DLL3 et DLL4]⁵. Cette simplicité, le modèle drosophile offre la facilité pour disséquer/étude des effets de modificateurs de la voie sur les interactions ligand-Notch et par la suite sur la signalisation Notch. Dans certains contextes au cours du développement animal (notamment le développement de l’aile chez la drosophile), les cis- et trans-interactions interviennent pour réaliser la signalisation Notch appropriée et cellule sort^1,6 . Il est important de distinguer les effets des modificateurs de parcours de Notch dans ces contextes sur cis- et trans-interaction de la protéine Notch avec ses ligands.

Notre groupe a déjà rapporté qu’addition d’un résidu d’hydrate de carbone appelé xylose Drosophila Notch à négativement régule la signalisation Notch dans certains contextes, y compris le développement aile⁷. Perte de shams (l’enzyme qui xylosylates Notch) mène à un phénotype de « perte de la veine de l’aile »⁷. Plus récemment, des expériences de dosage génique et analyse clonale servaient à montrer que perte de shams améliore l’encoche Delta-mediated singulariser. De distinguer si la signalisation d’encoche renforcée chez les mutants shams est le résultat d’une diminution de cis-inhibition ou accru trans-activation, études de surexpression ectopique de ligands Notch dans les disques imaginaux de larves aile l’utilisation du pilote de la dpp-GAL4 ont été effectuées. Ces expériences fourni de preuve suggérant que Shams régule trans-activation de la protéine Notch par Delta sans affecter l’encoche cis-inhibition par des ligands⁸. Cependant, informations en retour règlement et effets de ligands endogènes pourraient compliquer l’interprétation des études de surexpression ectopique^1,6,9.

Pour résoudre ce problème, Drosophila S2 cellules¹⁰ ont été utilisées, qui prévoit un système simple en vitro Notch-ligand interaction études^11,12. Cellules S2 ne pas exprimer endogène récepteurs Notch et Delta ligand¹¹ et exprimer un faible niveau de Serrate¹³, qui n’affecte pas l’encoche-ligand agrégation expériences⁸. Donc, S2 cellules peuvent être stablement ou transitoirement transfectées par encoche et/ou différents ligands (Delta ou Serrate) pour générer des cellules qui expriment exclusivement les récepteurs Notch ou l’un de ses ligands ou une combinaison d'entre eux. Mélange de cellules exprimant l’encoche S2 avec exprimant le ligand S2 cellules entraîne la formation d’agrégats hétérotypiques médiée par le récepteur-ligand liaison^11,12,14. Quantification de la formation globale fournit une mesure de trans-liaison entre l’encoche et ses ligands¹⁵ (Figure 1). De même, les cellules S2 peuvent être co transfectées avec des ligands Notch et Delta ou Serrate (c.-à-d. cis-ligands). CIS-ligands dans ces cellules exprimant l’encoche S2 abroger la liaison de la protéine Notch avec trans-ligands et résultat dans a diminué de formation total^8,12,14. La diminution relative de la formation globale provoquée par cis-ligands fournit une mesure de l’effet inhibiteur du cis-ligands sur la liaison entre l’encoche et trans-ligands (Figure 2). En conséquence, les essais sur l’agrégation des cellules ont été utilisés pour examiner l’effet de la perte de xylosylation sur trans- et cis-interactions entre l’encoche et ses ligands.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour essais sur l’agrégation des cellules dans le but d’évaluer la liaison de la protéine Notch avec trans-ligands et son inhibition par cis-ligands à l’aide de cellules S2 de drosophile . À titre d’exemple, nous fournissons les données qui nous ont permis de déterminer l’effet d’entaille xylosylation sur la liaison entre l’encoche et trans-Delta⁸. Ces tests simples fournissent une évaluation semi-quantitative de l’encoche-ligand interactions in vitro et aident à déterminer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets in vivo des modificateurs de parcours de Notch.

Protocole

1. préparation d’ARN Double brin (dsRNA) pour Shams Knockdown

1. Amplification par PCR des produits
   1. Utiliser l’ADN génomique sauvage jaune blanc (o y) et pAc5.1-EGFP comme gabarit, les paires d’amorces suivant pour amplifier les fragments d’ADN utilisés dans la synthèse de l’ARNdb. Utiliser le profil thermique de PCR suivant : dénaturation (95 ° C, 30 s), recuit (58 ° C, 30 s) et Extension (72 ° C, 1 min).
      Amélioré la protéine fluorescente verte Amorces de dsRNA (EGFP) (5' - 3')-
      Avant apprêt-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Inverser l’apprêt-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Amorces de dsRNA Shams (5' - 3')-
      Avant apprêt-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Inverser l’apprêt-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      NOTE : EGFP dsRNA est utilisée comme contrôle négatif.
2. Gel-purifier les produits de réaction en chaîne (PCR) polymérase en utilisant un kit de purification de gel commercial selon le protocole du fabricant.
3. Effectuer la transcription d’in vitro à l’aide d’un produit commercial capable de la retranscription d’un instigateur T7 selon le protocole du fabricant.
4. Purifier l’ARNdb en utilisant un kit de purification d’ARN selon le protocole du fabricant et conserver à-80 ° C.
5. Évaluer l’efficacité de knockdown shams en utilisant les étapes suivantes (1.5.1-1.5.5).
   1. Compter les cellules manuellement en utilisant un hémocytomètre et plaque 5 x 10⁵ S2 des cellules dans chaque puits d’un 6 bien plaque dans 1 mL/puits de milieu de Schneider complétée avec 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine.
   2. Ajouter 7,5 µg d' EGFP- ou shams ARNdb dans chaque puits et incuber à 25 ° C pendant 24 h.
   3. Récolte du contrôle (EGFP imprégnées de dsRNA) et couvre-oreillers dsRNA S2 les cellules traitées par pipetage douce suivie d’enrobage vers le bas par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min à 25 ° C et le processus d’isolement à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN conformément à Protocole du fabricant.
   4. Quantifier l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre et processus 100 ng d’ARN pour 1 étape qRT-PCR à l’aide de réactifs commerciaux qPCR et apprêt/sondes et le profil thermique de PCR suivant : dénaturation (95 ° C, 15 s) et recuit/Extension (60 ° C, 1 min).
      Remarque : Consultez la Table des matières pour plus d’informations sur les ensembles d’apprêt/sonde et l’instrument utilisé pour des expériences de qRT-PCR shams et de contrôle dans ces études.
   5. Calculer les niveaux d’ARNm relative shams en utilisant les 2^–ΔΔCT méthode¹⁶.

2. évaluation de la liaison entre le récepteur Notch et Trans-ligands

1. Préparer le récepteur de signal (cellules S2 exprimant le récepteur de l’encoche).
   1. Compter les cellules manuellement à l’aide d’un hémocytomètre et plaque 5 x 10⁵ S2 et cellules S2-encoche stables dans chaque puits d’une plaque de 6 puits dans 1 mL/puits de milieu de Schneider additionné de 10 % FBS et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine.
      Remarque : Pour les cellules S2-Notch, qui sont disponibles de Drosophila génomique Resource Center (DGRC), ajouter 200 méthotrexate nM dans les médias. Pour préparer une solution mère de méthotrexate de 0,5 mM, d’abord préparer une solution de méthotrexate 20 mM pour 250 µL de 1 NaOH M. Ensuite, diluer cette solution à 0,5 mM à 1 M saline de tampon phosphate et conserver à-20 ° C. Dans les cellules S2-Notch, expression de la protéine Notch est sous le contrôle du promoteur dans le vecteur de pMT métallothionéine drosophile .
   2. Ajouter 7,5 µg d’ARNdb dans chaque puits et incuber à 25 ° C pendant 24 h.
   3. Ajouter 0,7 mM CuSO₄ pour induire l’expression de la protéine Notch et incuber à 25 ° C pendant 3 jours.
      NOTE : CuSO₄ est utilisé pour induire l’expression des protéines contrôlée par le promoteur de la métallothionéine.
2. Préparer un envoi de signal de cellules (cellule de S2 exprimant des ligands Delta ou Serrate).
   1. Compter les cellules manuellement en utilisant un hémocytomètre et plaque ~ 5 x 10⁶ S2-Delta ou S2-Serrate^Tom cellules stables dans chaque puits d’une plaque de 6 puits dans 1 mL/puits de milieu de Schneider additionné de 10 % FBS et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine.
      NOTE : Ajouter 200 méthotrexate nM pour cellules S2-Delta et 100 µg/mL hygromycine pour cellules S2-Serrate^Tom dans les médias. Expression de Delta et Serrate^Tom— une version fonctionnelle de Serrate¹²tomates-tag — relève de la drosophile métallothionéine promoteur dans le vecteur de la pMT .
   2. Ajouter 0,7 mM CuSO₄ pour induire l’expression de ligands et incuber à 25 ° C pendant 3 h.
3. Effectuer l’agrégation entre cellules-envoi de signal et le récepteur de signal.
   1. Récolter le S2 dsRNA-traités (contrôle) et les cellules S2-encoche de pipetage doux et plaque 2,5 x 10⁵ cellules/puits dans une plaque 24 puits après comptage manuel par hémocytomètre.
   2. Ajouter 5 x 10⁵ stable S2-Delta ou S2-Serrate^Tom cellules dans un volume total de 200 µL de milieu de Schneider (additionné de 10 % FBS et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine).
      Remarque : Toutes les cellules de S2 de manutention (y compris traitement de placage, induction et dsRNA) a été fait sous une armoire de sécurité biologique.
   3. Placer la plaque dans un agitateur orbital à 150 tr/min (942,48 rad/min).
   4. Après 1 min, mélanger le contenu de chaque puits et retirer 20 µL pour compter le nombre d’agrégats.
      1. En même temps prendre une image représentative sous microscope inversé de composé à l’aide de grossissement de 10 x (objectif de 10/0.25 PLL).
      2. Compter manuellement les agrégats (> 6 cellules) à l’aide d’un hémocytomètre.
   5. Placer la plaque sur un agitateur.
   6. Répétez l’acquisition d’images et de comptage après 5 min et 15 min d’agrégation.
4. Effectuer la quantification des trans-liaison.
   1. Calculer le nombre d’agrégats / mL entre cellules S2 et S2-Delta ou S2-Serrate^Tom comme un contrôle de fond.
   2. Calculer le nombre d’agrégats / mL entre l’entaille en S2 et S2-Delta ou S2-Serrate^Tom cellules (magnitude de trans-liaison).

3.Évaluation de l’Inhibition de la liaison entre l’encoche et Trans-ligands par Cis-ligands

1. Préparer les cellules de récepteur de signal.
   1. Cellules de⁵ S2 plaque 5 x 10 dans chaque puits d’une plaque de 6 puits dans 1 mL/puits de milieu de Schneider additionné de 10 % FBS et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine.
   2. Ajouter 7,5 µg d’ARNdb dans chaque puits et incuber à 25 ° C pendant 24 h.
   3. Transfecter conjointement les cellules dsRNA-Traité avec pBluescript et pMT-Notch¹¹ (DGRC) seul ou avec l’Entaille en pMT et pMT-Delta¹¹ (DGRC) ou pMT-Serrate¹⁷ au total Concentration d’ADN de 2 µg/puits à l’aide d’un réactif de transfection commerciale selon le protocole du fabricant.
      Remarque : pBluescript est utilisé comme un contrôle. Les cellules transfectées Co s’appellera S2-encoche & Delta^transitoire ou S2-encoche & Serrate cellules^transitoires ci-après.
   4. Incuber les cellules transfectées de manière transitoire de S2 à 25 ° C pendant 24 h.
   5. Ajouter 0,7 mM CuSO₄ pour induire l’expression de l’encoche et les ligands et incuber à 25 ° C pendant 3 jours.
2. Préparer l’envoi de signal de cellules tel que décrit au point 2.2.
3. Effectuer l’agrégation entre l’envoi de signal et le récepteur de signal de cellules tel que décrit à la section 2.3.
4. Quantifier l’inhibition de la trans-liant en cis-ligands.
   1. Calculer le nombre d’agrégats / mL entre cellules S2 et S2-Delta ou S2-Serrate comme un contrôle de fond.
   2. Quantifier l’importance de l’inhibition par la CEI-ligands comme suit.
      1. Décrivez A comme nombre d’agrégats entre les cellules de Delta-S2 et S2-encoche^transitoire .
      2. Définir B comme nombre d’agrégats entre les cellules S2 transfectées transitoirement conjointement avec encoche et Delta (S2-encoche & Delta^transitoire) et cellules S2-Delta.
      3. Calculer l’agrégation relative C = (B -x 100) /A
      4. Calculer l’ampleur de l’inhibition par cis- ligand (Delta ou Serrate) 100 – C.
         Remarque : ainsi, si l’agrégation relative est 45 %, cis-sont considérés comme des ligands inhibent la trans-contraignant de 55 %.

Résultats

Nos observations in vivo suggèrent que manque les résultats de shams de gène de xylosyltransferase gain de Notch signalisation due à surcroît Delta-mediated trans-activation de la protéine Notch sans affecter la cis-inhibition de la Encoche de ligands⁸. Pour tester cette notion, en vitro cell agrégation analyses ont été effectuées. Tout d’abord, shams expression dans les cellules S2 a été renversé...

Discussion

La signalisation Notch canonique dépend des interactions entre le récepteur de Notch et ses ligands⁵. Bien que la plupart des études sur la voie de l’encoche considèrent surtout la fixation de ligands dans les cellules voisines (trans) et Notch, entaille et même cellule ligands interagissent-elles et ces soi-disant cis-interactions peuvent jouer un rôle inhibiteur dans l’encoche signalisation de^3,4. En conséque...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified	Lonza	04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution	GE Healthcare lifescience	SV30010
CELLSTAR 6 well plate	Greiner Bio-One	657 160
CELLSTAR 24 well plate	Greiner Bio-One	662160
VWR mini shaker	Marshell Sceintific	12520-956
Hemocytometer	Fisher Sceintific	267110
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit	Ambion	AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)	Zymo Research	R1054
VistaVision Inverted microscope	VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software	AmScope	MU-900	Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
Fetal Bovine Serum	GenDepot	F0600-050
Methotrexate	Sigma-Aldrich	A6770-10
Hygromycin B	Invitrogen	HY068-L6
Copper sulphate	Macron Fine Chemicals	4448-02
S2 cells	Invitrogen	R69007
S2-SerrateTom cells			Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells	DGRC	152
S2-Notch cells	DGRC	154
pMT-Delta vector	DGRC	1021	Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector			Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector	DGRC	1022	Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP			Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit	Applied Biosystem	1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)	Applied Biosystem	Dm02144576_g1	with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)	Applied Biosystem	Dm02151827_g1	with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	4351405	96-well Block module