セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子

要約

-トランス・シスによる活性化と Notch 受容体の阻害の区別が困難な体内システムの複雑さ-配位子、それぞれ。ここでは、トランスにショウジョウバエノッチのバインディングの定性・半定量評価のための in vitro細胞凝集アッセイに基づくプロトコルを提案する-配位子 vs cis-配位子。

要約

Notch シグナルは、動物の開発および成人のメンテナンスに幅広く使用されて進化的に保存された細胞間コミュニケーション システムです。隣接セルからのリガンドと Notch 受容体の相互作用を誘導するシグナル伝達経路の活性化 (トランス-活性化)、同じ細胞から配位子との相互作用を阻害するシグナル伝達 (cis-抑制)。トランスとの間の適切なバランス-活性化とcis-抑制は、ノッチは動物の開発時にいくつかのコンテキストにおけるシグナル伝達の最適なレベルを確立するのに役立ちます。ノッチと多くの細胞タイプの有機配位子の重複式ドメインとフィードバック機構の存在のためトランス-シス対に与えられた翻訳後修飾の効果の研究-ノッチの相互作用とその配位子生体内で困難です。ここでは、ノッチのトランスとcis各リガンドへのバインドをノッチ経路修飾子をノックダウンの効果を評価する細胞凝集アッセイでショウジョウバエS2 細胞を使用するためのプロトコルについて述べる。S2 細胞安定または一過性発現するノッチ表現のベクトル (S2 デルタまたは S2 鋸歯) 各ノッチ リガンドを発現する細胞と混在しています。トランス-リガンドと受容体の結合は異型細胞集塊の形成に結果し、成る mL あたりの集計の数の点では測定 > 6 セル。Cisの抑制効果を検討する-配位子、ノッチとそれぞれの ligand の共発現 S2 細胞が S2 デルタまたは S2 鋸歯状細胞混在、集計数は上記のように定量化します。Cisの存在のため集計数の相対的な減少-配位子によりcis-リガンド-トランスの阻害を介した-バインド。これらの簡単な試その配位子にノッチのバインディングの遺伝的または薬理学的操作の効果の半定量的なデータを提供できるし、の生体内で効果の基礎となる分子メカニズムの解明に役立つことができます。Notch シグナルのような操作。

概要

正規 Notch シグナルは、隣接するノッチの受容体とそのリガンド¹間の相互作用を促進する細胞の物理的な接触を必要とする短距離の細胞コミュニケーション メカニズムです。(信号受信細胞の表面上に存在) Notch 受容体リガンドとの相互作用 (信号送信の表面に細胞) Notch シグナルを開始し、トランスとして知られている-活性化²。その一方で、ノッチと同じセル内とそのリガンドの相互作用のノッチ経路の阻害につながるし、 cisとして知られている-抑制³。トランス- とcisのバランス-相互作用が最適なリガンド依存性 Notch⁴をシグナルのために必要です。ショウジョウバエは 4 ノッチの受容体と 5 配位子を持つ哺乳類とは異なり (デルタと Serrate) 2 つの配位子 1 つのノッチの受容体を持ちます [ジャグ 1 (JAG1)、JAG2、デルタのような 1 (DLL1) DLL3 および DLL4]⁵。このシンプルさを持つショウジョウバエモデルはノッチ-リガンド相互作用とその後 Notch シグナル経路の修飾子の効果の分析・研究に使いやすさを提供しています。(ショウジョウバエの翼の開発を含む)、動物の開発時に特定のコンテキストで両方cis- および-適切な Notch シグナルを達成し、運命^{1,6 セルの相互作用が関与しています。}.シス-トランス対にこれらのコンテキストでノッチ経路の修飾子の効果を区別することが重要だ-ノッチとそのリガンドとの相互作用。

当社グループは、ショウジョウバエのノッチにキシロースを否定的と呼ばれる炭水化物残留物の添加が翼開発⁷を含む、特定のコンテキストで Notch シグナルを調節することを報告しました。シャムスの損失 (酵素、xylosylates ノッチ)「翼の静脈の損失」表現型⁷に 。最近では、クローン解析と遺伝子投与実験は、シャムスの損失がデルタ介したノッチ名指しを強化することを使用されました。シャムス変異体で強化された Notch シグナルが減少したcisの結果かどうかを区別するために-抑制または増加トランス-活性化、幼虫翅成虫原基におけるノッチ ligands の異所性発現の研究dpp GAL4ドライバーを使用して行われました。これらの実験は証拠を示唆シャムスがトランスを調節することを提供-ノッチcisに影響を与えずにデルタでノッチの活性化-⁸配位子による抑制。ただし、フィード バック規制と内因性リガンドの作用の異所性発現研究^1,6,9の解釈を複雑にします。

ショウジョウバエS2 細胞¹⁰を用いて, この問題を解決するには、ノッチ-リガンド相互作用研究^11,12の簡単な生体外でシステムが得られます。S2 細胞しない内因性 Notch 受容体とデルタ リガンド¹¹を表現し、鋸歯状の¹³ノッチ リガンド凝集実験⁸に影響しない低レベルを表現します。したがって、S2 細胞をノッチおよび/または個々 の配位子 (デルタまたは Serrate) 専ら Notch 受容体またはその配位子の 1 つを表すセルを生成するまたはそれらの組み合わせによって、その安定または一過性を導入することができます。S2 のノッチを表現する細胞の受容体リガンド結合^11,12,14を介した血液凝集体の形成に配位子を表現する S2 細胞結果を混ぜてください。集計の形成の定量化は、トランスの測定を提供します-ノッチとその配位子¹⁵ (図 1) との結合します。同様に、S2 細胞が cotransfected ノッチとデルタまたは Serrate 配位子とすることができます (すなわち cis-配位子)。Cis-これらのノッチ表現 S2 細胞における配位子はトランスとノッチのバインディングを破棄する-配位子との結果集計形成^8,12,14を減少しました。Cisによる会合体形成の相対的な減少-配位子は、 cisの抑制効果の測定を提供します-ノッチとトランス間のバインディングに配位子-配位子 (図 2)。したがって、細胞凝集アッセイが活かされて -トランス・シスの xylosylation の損失の影響を調べるためのノッチとそのリガンドの相互作用。

ここでは、提案する詳細なプロトコル細胞凝集アッセイはトランスとノッチの結合を評価する目的のため-配位子とcisによるその阻害-ショウジョウバエS2 細胞を用いた配位子。例として、我々 はノッチ xylosylation のノッチとトランス間のバインディングへの影響を判断できるようにデータを提供-デルタ⁸。これらの簡単な試金はノッチ-リガンド相互作用の in vitroの半定量的評価を提供し、ノッチ経路修飾子の生体内での効果発現の分子機構を調べる。

プロトコル

1.シャムスノックダウンのため二重鎖 RNA (dsRNA) の準備

1. Pcr の製品の
   1. DsRNA の合成に使用される DNA のフラグメントを増幅するのにテンプレート、次のプライマーのペアとして野生型黄色白(y w) ゲノム DNA とpAc5.1 EGFPを使用します。次の PCR の熱プロファイルを使用: 変性 (95 ° C、30 s)、焼鈍 (58 ° C、30 s) と拡張子 (72 ° C、1 分)。
      緑色蛍光タンパク質を強化(EGFP) dsRNA のプライマー (5' 3')-
      前方プライマー GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      逆プライマー GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      シャムスdsRNA のプライマー (5' 3')-
      前方プライマー TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      逆プライマー TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      注: EGFP dsRNA はネガティブ コントロールとして使用されます。
2. ゲル - 製造元のプロトコルに従って商業ゲル精製キットを使用してポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の製品を浄化します。
3. 製造元のプロトコルに従って T7 プロモーターから転写できる商品を使用しての in vitro転写を実行します。
4. 製造元のプロトコルに従って RNA 精製キットを使用して dsRNA を浄化し、-80 ° C で保存
5. 次の手順 (1.5.1-1.5.5) を使用して、シャムスノックダウンの効率を評価します。
   1. 6 の各ウェルにも検定とプレート 5 x 10⁵ S2 セルを使用して手動でセル 1 mL/シュナイダーの中のプレートを添加した 10% 胎仔ウシ血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシンの数。
   2. 各ウェルにEGFP- またはシャムスdsRNA の 7.5 μ g を追加し、25 ° C 24 時間インキュベートします。
   3. 収穫制御 (EGFP dsRNA 処理) と 25 ° C で 5 分間 1,000 x g とによると RNA 抽出キットを使用しての RNA の隔離のためのプロセスでの遠心分離によってダウン ペレット化が続く穏やかなピペッティングによるシャムスdsRNA 扱われる S2 細胞製造元のプロトコル。
   4. 分光光度計およびプロセス 100 使用して RNA を定量化する商業 qPCR 試薬とプライマー ・ プローブと次の PCR の温度プロファイルを使用してステップ 1 qRT PCR のために RNA の ng: 変性 (95 ° C、15 s) と焼鈍/拡張 (60 ° C、1 分)。
      注: は、プライマー ・ プローブ セットでこれらの研究でshams さんとコントロールの qRT PCR 実験用計測器については材料の表を参照してください。
   5. 2^-16ΔΔCTメソッドを使用して相対シャムスの mRNA のレベルを計算します。

2. Notch 受容体とトランス間のバインドの評価-配位子

1. 信号受信セル (Notch 受容体を発現する S2 細胞) を準備します。
   1. 診断を使用して手動でのセルをカウントし、FBS と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 10% を添加したプレート 5 x 10⁵ S2 とシュナイダーの中よく/1 mL で 6 ウェル プレートの各ウェルに安定した S2 ノッチ細胞。
      注: S2 ノッチ細胞、ショウジョウバエゲノム リソース センター (DGRC) から利用可能なメディアで 200 nM メトトレキサートを追加します。0.5 mM メトトレキサート ストック溶液を調製するには、最初 1 M NaOH の 250 μ L の 20 mM メトトレキサート ソリューションを準備します。次に、このソリューションを 0.5 mM 1 M リン酸バッファー生理食塩水、-20 ° C でストアを希釈します。S2 ノッチ細胞にノッチ蛋白質の表現はpMTベクトルでショウジョウバエのメタロチオネインのプロモーターの制御下です。
   2. 各ウェルに dsRNA の 7.5 μ g を追加し、25 ° C 24 時間インキュベートします。
   3. 0.7 mM CuSO₄ノッチの発現を誘導し、, 25 ° C で 3 日間を追加します。
      メモ: CuSO₄は、メタロチオネインのプロモーターによって制御タンパク質の発現を誘導するために使用されます。
2. 信号を送る細胞 (S2 セル デルタまたは Serrate 配位子を表現する) を準備します。
   1. 10⁶安定した S2 デルタまたは S2 鋸歯^トムセル 1 mL で 6 ウェル プレートの各ウェルに x の検定とプレート 〜 5 を使用して手動でのセルをカウント/シュナイダーの中の井戸 10% 添加した FBS と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン。
      注: は、メディアで S2 デルタ細胞の 200 nM メトトレキサートと S2 鋸歯^トム細胞の 100 μ g/mL hygromycin を追加します。デルタと鋸歯状^トムの式-鋸歯状¹²トマト タグ付きで機能的なバージョン- pMTベクトルでショウジョウバエメタロチオネインのプロモーター下にあります。
   2. 0.7 mM CuSO₄リガンドの発現を誘導し、, 3 h の 25 ° C でを追加します。
3. 信号の送信と受信の細胞間の集約を実行します。
   1. DsRNA 扱われる S2 を収穫 (コントロール) と穏やかなピペッティングしてプレート 2.5 x 10 の⁵細胞/ウェルで検定による手動カウント後 24 ウェル プレート S2 ノッチ細胞。
   2. シュナイダーの媒体の 200 μ L の総ボリュームで 5 × 10⁵安定した S2 デルタまたは S2 鋸歯^トムのセルを追加 (FBS、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 10% を添加した)。
      注: 処理 (めっき、誘導、dsRNA の処理) を含むすべての S2 セルは、バイオ セーフティ キャビネットの下で行われていた。
   3. 150 rpm (942.48 rad/分) で軌道シェーカーにプレートを配置します。
   4. 1 分後、各ウェルの内容を混合し、集計の数を数えるために 20 μ L を取る。
      1. 同時に 10 倍の倍率 (PLL 10/0.25 目標) を使用して逆の化合物の顕微鏡下での代表的な画像を取る。
      2. 手動で集計をカウント (> 6 細胞) 診断。
   5. シェーカーにプレートを配置します。
   6. 画像の取得と 5 分後と 15 分間集計のカウントを繰り返します。
4. トランスの定量化を実行-バインド。
   1. バック グラウンド コントロールとして S2 細胞と S2 デルタまたは S2 鋸歯^トムと mL あたりの集計の数を計算します。
   2. S2 ノッチと S2 デルタまたは S2 鋸歯^トムセル間の mL あたりの集計の数を計算 (トランスの大きさ-バインディング)。

3。ノッチとトランス間の結合阻害の評価- Cisによって配位子の配位子

1. 信号受信セルを準備します。
   1. シュナイダーの中よく/1 mL で 6 ウェル プレートの各ウェルのプレート 5 x 10⁵ S2 セルは、FBS と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン 10% を添加しました。
   2. 各ウェルに dsRNA の 7.5 μ g を追加し、25 ° C 24 時間インキュベートします。
   3. 共同 transfect dsRNA 処理細胞pBluescriptとpMT ノッチ¹¹ (DGRC) だけで、 pMT ノッチとpMT デルタ¹¹ (DGRC) またはpMT 鋸歯状の合計¹⁷2 μ g/ウェルを使用して製造元のプロトコルに従って商業トランスフェクション試薬の濃度は DNA。
      メモ: pBluescriptは、コントロールとして使用されます。共同 transfected セルは S2 ノッチと呼ばれる、& デルタ^過渡または S2 ノッチ & 以下^一時的な細胞を鋸歯状します。
   4. 25 ° C 24 時間で一過性トランスフェクション S2 細胞を孵化させなさい。
   5. 0.7 mM CuSO₄ノッチとリガンドの発現を誘導し、, 25 ° C で 3 日間を追加します。
2. 2.2 で説明されているように信号を送る細胞を準備します。
3. セクション 2.3 で説明した信号を送信して信号受信セル間の集約を実行します。
4. トランスの阻害を定量化- cisによってバインド-配位子。
   1. バック グラウンド コントロールとして S2 細胞と S2 デルタまたは S2 鋸歯と mL あたりの集計の数を計算します。
   2. Cisによって抑制の大きさを定量化-次のように配位子。
      1. S2 ノッチ^過渡と S2 デルタ セルの集計の数としてAを定義します。
      2. S2 セル間集計数なノッチとデルタで一過性 co transfected Bを定義 (S2 ノッチ & デルタ^過渡) と S2 デルタ細胞。
      3. 相対的な集合Cを計算 (B x 100) =/A
      4. Cis- 100 としてリガンド (デルタまたは Serrate) – によって抑制の大きさを計算するC。
         注: 例として、相対的な集計が 45%、 cisの場合-配位子はトランスを阻害すると考えられている-55% によるバインドします。

結果

私たちの生体内観察提案、Notch シグナルによる利得の xylosyltransferase 遺伝子のシャムス結果の損失増加デルタ介したトランス-シスに影響を与えずにノッチの活性化-の抑制配位子⁸ノッチ。この概念をテストするための in vitro細胞凝集アッセイを行った。まず、S2 細胞におけるシャムス発現ノックダウンされた

ディスカッション

正規 Notch シグナルは、Notch 受容体とそのリガンド⁵間の相互作用に依存します。ノッチのパスに関するほとんどの研究は、主にノッチと隣接セル (トランス) の配位子の結合を検討、ノッチと同じ細胞リガンドが影響しあうか、およびこれらのいわゆるcis-ノッチの抑制的役割を果たす相互作用^3,4をシグナリングします?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified	Lonza	04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution	GE Healthcare lifescience	SV30010
CELLSTAR 6 well plate	Greiner Bio-One	657 160
CELLSTAR 24 well plate	Greiner Bio-One	662160
VWR mini shaker	Marshell Sceintific	12520-956
Hemocytometer	Fisher Sceintific	267110
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit	Ambion	AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)	Zymo Research	R1054
VistaVision Inverted microscope	VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software	AmScope	MU-900	Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
Fetal Bovine Serum	GenDepot	F0600-050
Methotrexate	Sigma-Aldrich	A6770-10
Hygromycin B	Invitrogen	HY068-L6
Copper sulphate	Macron Fine Chemicals	4448-02
S2 cells	Invitrogen	R69007
S2-SerrateTom cells			Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells	DGRC	152
S2-Notch cells	DGRC	154
pMT-Delta vector	DGRC	1021	Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector			Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector	DGRC	1022	Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP			Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit	Applied Biosystem	1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)	Applied Biosystem	Dm02144576_g1	with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)	Applied Biosystem	Dm02151827_g1	with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	4351405	96-well Block module