Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe drosófila com Trans-ligantes e sua inibição pelo Cis-ligantes

Resumo

Complexidade dos sistemas na vivo torna difícil distinguir entre a ativação e a inibição do receptor do entalhe por trans- e cis-ligantes, respectivamente. Aqui, apresentamos um protocolo baseado em vitro ensaios de agregação de célula para avaliação qualitativa e semi-quantitativa da vinculação de entalhe de Drosophila Trans-ligantes vs cis-ligantes.

Resumo

Entalhe de sinalização é um sistema de comunicação célula-célula evolutivamente conservada usado amplamente no desenvolvimento animal e manutenção de adulta. Interação do receptor Notch com ligantes de vizinhas células induz a ativação da via de sinalização (trans-ativação), enquanto a interação com ligantes da mesma célula inibe a sinalização (cis-inibição). Equilíbrio adequado entre trans-ativação e cis-inibição ajuda a estabelecer os níveis ideais de entalhe sinalização em alguns contextos durante o desenvolvimento do animal. Por causa dos domínios de expressão sobreposição de entalhe e seus ligantes em muitos tipos de células e a existência de mecanismos de feedback, estudando os efeitos de uma determinada modificação pós-traducional na trans- contra cis-interações de entalhe e seus ligantes na vivo é difícil. Aqui, descrevemos um protocolo para o uso de células de Drosophila S2 em célula-agregação ensaios para avaliar os efeitos de derrubar um modificador de via Notch na ligação de entalhe para cada ligante trans e cis. Células S2 estàvel ou transitoriamente transfectadas com um vetor de entalhe-expressando são misturadas com células expressando cada ligante de entalhe (S2-Delta ou S2-Serrate). Trans-ligação entre o receptor e ligantes resulta na formação de agregados de células heterotypic e é medido em termos de número de agregados por mL, composto de > 6 células. Para examinar o efeito inibitório do cis-ligantes, S2 células expressando co entalhe e cada ligante são misturadas com células S2-Delta ou S2-Serrate e o número de agregados é quantificado como descrito acima. A diminuição relativa do número de agregados devido à presença de cis-ligantes fornece uma medida de cis-ligand-mediados por inibição da trans-ligação. Estes ensaios simples podem fornecer dados semi quantitativos sobre os efeitos de manipulações genéticas ou farmacológicos na ligação de entalhe para seus ligantes e podem ajudar a decifrar os mecanismos moleculares subjacentes os efeitos na vivo de tais manipulações na sinalização Notch.

Introdução

Canônico de sinalização Notch é um mecanismo de comunicação de curto alcance de célula para célula que exige contato físico dos vizinhos células para facilitar a interação entre receptores Notch e seus ligantes¹. Interação do receptor do entalhe (presente na superfície das células do sinal de recepção) com ligantes (presentes na superfície de sinal-enviando células) inicia sinalização Notch e é conhecida como trans-ativação². Por outro lado, a interação entre entalhe e seus ligantes na mesma cela leva à inibição da via de entalhe de e é conhecida como cis-inibição³. O equilíbrio entre trans- e cis-interações é necessária para garantir o ideal Notch ligante-dependentes, sinalização⁴. Drosófila tem um receptor do entalhe e dois ligantes (Delta e Serrate) ao contrário de mamíferos, que têm quatro receptores Notch e cinco ligantes [irregulares 1 (JAG1), JAG2, delta-like 1 (DLL1), DLL3 e DLL4]⁵. Tendo esta simplicidade, o modelo de Drosophila oferece a facilidade para dissecar/estudo os efeitos dos modificadores de percurso em interações de entalhe-ligante e, posteriormente, na sinalização Notch. Em determinados contextos durante o desenvolvimento animal (incluindo desenvolvimento de asa em drosófila), ambos de cis- e trans-interações envolvidas para alcançar a sinalização adequada do entalhe e célula de destino^1,6 . É importante distinguir os efeitos dos modificadores de via Notch nestes contextos na cis- e trans-interações de entalhe com seus ligantes.

Nosso grupo relatado anteriormente que a adição de um resíduo de hidrato de carbono chamado xilose de Drosophila entalhe negativamente regula entalhe sinalização em determinados contextos, incluindo asa desenvolvimento⁷. Perda de Souza (a enzima que xylosylates entalhe) leva a um fenótipo de "perda da veia da asa"⁷. Mais recentemente, experimentos de dosagem de gene e clonal análise foram utilizados para mostrar que perda de Souza realça recordando, mediada por Delta entalhe. Para distinguir se a sinalização reforçada de entalhe em mutantes de Souza é um resultado da diminuição da cis-inibição ou aumento trans-ativação, estudos de gravidez ectópica superexpressão de ligantes Notch em discos imaginária asa larval usando o driver de dpp-GAL4 foram realizadas. Estas experiências fornecidas provas sugerindo que Shams regula trans-ativação de entalhe por Delta sem afetar o entalhe cis-inibição por ligantes⁸. No entanto, feed-back regulamentos e efeitos de ligantes endógenos podem complicar a interpretação dos estudos de superexpressão ectópica^1,6,9.

Para resolver esse problema, células de Drosophila S2¹⁰ foram usados, que preveem um sistema simples em vitro entalhe-ligante interação estudos^11,12. Células de S2 não express endógena do receptor do entalhe e Delta ligante¹¹ e expressar um nível baixo de serrilhado,¹³, que não afeta o entalhe-ligante agregação experimentos⁸. Portanto, as células S2 podem estàvel ou transitoriamente transfected por entalhe e/ou ligantes individuais (Delta ou Serrate) para gerar células que expressam exclusivamente o receptor do entalhe ou um dos seus ligantes ou uma combinação deles. Mistura de células do entalhe-expressando S2 com ligante-expressando resultados de células S2 na formação de agregados heterotypic mediada pelo receptor-ligante ligação^11,12,14. Quantificação da formação agregada fornece uma medida da trans-vinculação entre entalhe e seus ligantes¹⁵ (Figura 1). Da mesma forma, as células de S2 podem ser co transfectadas com ligantes Notch e Delta ou Serrate (ou seja, cis-ligantes). Cis-ligantes nestas células S2 entalhe-expressando revogar a vinculação do entalhe com trans-ligantes e resultado em diminuição da formação agregado^8,12,14. A diminuição relativa na formação de agregados causada por cis-ligantes fornece uma medida do efeito inibitório do cis-ligantes na ligação entre o entalhe e trans-ligantes (Figura 2). Nesse sentido, os ensaios de agregação celular foram utilizados para examinar o efeito de perda de xylosylation trans- e cis-interações entre entalhe e seus ligantes.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para ensaios de agregação de célula objetivou avaliar a vinculação do entalhe com trans-ligantes e sua inibição pelo cis-ligantes utilizando células de Drosophila S2. Como exemplo, podemos fornecer os dados que nos permitiram determinar o efeito de entalhe xylosylation na ligação entre o entalhe e trans-Delta⁸. Estes ensaios simples fornecem uma avaliação semi-quantitativa do entalhe-ligante interações em vitro e ajudam a determinar os mecanismos moleculares subjacentes os efeitos na vivo de modificadores de via Notch.

Protocolo

1. preparação do RNA encalhado dobro (dsRNA) para Knockdown de Souza

1. Amplificação por PCR dos produtos
   1. Use o DNA genômico do selvagem-tipo branco amarelo (y w) e pAc5.1-EGFP como modelo e os seguintes pares de cartilha para amplificar os fragmentos de DNA usados na síntese de dsRNA. Use o seguinte perfil térmico de PCR: desnaturação (95 ° C, 30 s), recozimento (58 ° C, 30 s) e extensão (72 ° C, 1 min).
      Reforçada a proteína verde fluorescente (EGFP) dsRNA Cartilhas (5' - 3')-
      Primeira demão para diante-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Reverter a primeira demão-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Shams dsRNA Cartilhas (5' - 3')-
      Primeira demão para diante-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Reverter a primeira demão-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      Nota: EGFP dsRNA é usado como controle negativo.
2. Gel-purifica os produtos de reação em cadeia (PCR) polimerase usando um kit de purificação de gel de comerciais de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Execute em vitro transcrição usando um produto comercial capaz de transcrever de um promotor T7 de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Purificar o dsRNA usando um kit de purificação de RNA de acordo com o protocolo do fabricante e armazenar a-80 ° C.
5. Avalie a eficiência de Souza knockdown usando as seguintes etapas (1.5.1-1.5.5).
   1. Contagem das células manualmente usando um hemocytometer e placa 5 x 10⁵ S2 células em cada poço de um 6 bem placa em 1 mL/bem do meio do Schneider suplementado com 10% soro Fetal bovino (FBS) e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
   2. Adicione 7,5 µ g de EGFP- ou logros dsRNA a cada poço e incubar a 25 ° C por 24 h.
   3. Colheita do controle (EGFP dsRNA-tratados) e logros dsRNA-tratados S2 células pipetando gentil seguido de granulação para baixo por centrifugação a 1.000 x g por 5 min a 25 ° C e o processo de isolamento do RNA usando um kit de extração de RNA de acordo com protocolo do fabricante.
   4. Quantificar o RNA usando um espectrofotômetro e processo 100 ng do RNA para o 1 passo qRT-PCR utilizando reagentes comerciais qPCR e primer/sondas e o seguinte perfil térmico de PCR: desnaturação (95 ° C, 15 s) e recozimento/extensão (60 ° C, 1 min).
      Nota: Consulte a Tabela de materiais , para obter informações sobre os conjuntos de primer/sonda e o instrumento utilizado para experimentos de Souza e controle qRT-PCR nestes estudos.
   5. Calcule os níveis de mRNA relativo Souza usando o 2^–ΔΔCT método¹⁶.

2. avaliação da ligação entre o receptor do entalhe e Trans-ligantes

1. Prepare o sinal de recepção células (S2 expressando o receptor do entalhe).
   1. Contar as células manualmente usando um hemocytometer e placa de 5 x 10⁵ S2 e estáveis células S2-entalhe em cada poço de uma placa de 6 em 1 mL/bem do meio do Schneider suplementado com 10% FBS e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
      Nota: Para as células S2-entalhe, que estão disponíveis de Drosophila genómica Resource Center (DGRC), metotrexato 200 nM na mídia. Para preparar uma solução stock de metotrexato de 0,5 mM, primeiro prepare uma solução de metotrexato 20 mM em 250 µ l de 1 M de NaOH. Em seguida, diluir esta solução a 0,5 mM na solução salina tampão de fosfato 1 M e em-20 ° C. Nas células de S2-entalhe, expressão da proteína Notch está sob o controle do promotor metalotioneína Drosophila do vetor de PGTO .
   2. Adicione 7,5 µ g do dsRNA a cada poço e incubar a 25 ° C por 24 h.
   3. Adicione 0,7 mM CuSO₄ para induzir a expressão de entalhe e incubar a 25 ° C por 3 dias.
      Nota: CuSO₄ é usado para induzir a expressão de proteínas controlado pelo promotor metalotioneína.
2. Prepare o envio de sinal de células (célula S2 expressando Delta ou Serrate ligantes).
   1. Contar as células manualmente usando um hemocytometer e placa ~ 5 x 10⁶ estável S2-Delta ou S2-Serrate^Tom células em cada poço de uma placa de 6 em 1 mL/poço do meio do Schneider suplementado com 10% FBS e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
      Nota: Adicione 200 metotrexato nM para células S2-Delta e 100 µ g/mL hptII para células S2-Serrate^Tom na mídia. Expressão do Delta e serrilhado^Tom— uma versão funcional, tomate-Tag do serrilhado¹²— está sob Drosophila metalotioneína promotor do vetor de PGTO .
   2. Adicione 0,7 mM CuSO₄ para induzir a expressão de ligantes e incubar a 25 ° C por 3 h.
3. Execute a agregação entre as células-envio de sinal e o sinal de recepção.
   1. Colher o S2 dsRNA-tratados (controle) e células de S2-entalhe por pipetagem suave e placa de 2.5 x 10⁵ células/poço em uma placa de 24 após a contagem manual por hemocytometer.
   2. Adicionar 5 x 10⁵ estável Delta-S2 S2-Serrate^Tom células ou em um volume total de 200 µ l de meio do Schneider (suplementado com 10% FBS e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina).
      Nota: Todas as células de S2 manipulação (incluindo tratamento de chapeamento, indução e dsRNA) foi feito sob uma armário de biossegurança.
   3. Coloque a placa em um agitador orbital a 150 rpm (942,48 rad/min).
   4. Depois de 1 min, misturar o conteúdo de cada poço e levar 20 µ l para contagem do número de agregados.
      1. Ao mesmo tempo tome uma imagem representativa sob microscópio composto invertido usando ampliação de 10x (objetivo PLL 10/0.25).
      2. Contar manualmente os agregados (> 6 células) usando um hemocytometer.
   5. Coloque a placa de um agitador.
   6. Repita a aquisição da imagem e a contar depois de 5 min e 15 min de agregação.
4. Realizar a quantificação de trans-ligação.
   1. Calcule o número de agregados por mL entre células S2 e S2-Delta ou S2-Serrate^Tom células como um controle de fundo.
   2. Calcular o número de agregados por mL entre entalhe em S2 e S2-Delta ou S2-Serrate^Tom células (magnitude de trans-vinculação).

3.Avaliação da inibição da ligação entre o entalhe e Trans-ligantes por Cis-ligantes

1. Prepare células de sinal de recepção.
   1. Placa de 5 x 10⁵ S2 células em cada poço de uma placa de 6 em 1 mL/bem do meio do Schneider suplementado com 10% FBS e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
   2. Adicione 7,5 µ g do dsRNA a cada poço e incubar a 25 ° C por 24 h.
   3. Co transfect as células dsRNA-tratados com pBluescript e PMT-entalhe¹¹ (DGRC) sozinho ou com Entalhe em PGTO e pMT-Delta¹¹ (DGRC) ou pMT-Serrate¹⁷ para um total Concentração de DNA de 2 µ g/bem usando um reagente de transfeccao comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
      Nota: pBluescript é usado como um controle. As células transfectadas co serão chamadas S2-entalhe & Delta^transitória ou S2-entalhe & Serrate^transitória de células daqui por diante.
   4. Incube as células S2 transfectadas transitoriamente a 25 ° C por 24 h.
   5. Adicione 0,7 mM CuSO₄ para induzir a expressão de entalhe e ligantes e incubar a 25 ° C por 3 dias.
2. Prepare o envio de sinal células conforme descrito no ponto 2.2.
3. Execute a agregação entre as células de sinal-envio e recebimento de sinal conforme descrito na seção 2.3.
4. Quantificar a inibição de trans-ligação por cis-ligantes.
   1. Calcule o número de agregados por mL entre células S2 e S2-Delta ou S2-Serrate células como um controle de fundo.
   2. Quantificar a magnitude da inibição pelo cis-ligantes como segue.
      1. Defina A como número de agregados entre S2-entalhe^transitória e células S2-Delta.
      2. Definir B como número de agregados entre células S2 transitoriamente co transfected com entalhe e Delta (S2-entalhe & Delta^transitória) e células S2-Delta.
      3. Calcular a agregação relativa C = (B x 100) /A
      4. Calcular a magnitude de inibição por cis- ligante (Delta ou Serrate) como 100 – C.
         Nota: como exemplo, se a agregação relativa é 45% e, em seguida, cis-ligantes são considerados para inibir o trans-vinculação de 55%.

Resultados

As nossas observações na vivo sugeriram que a perda dos resultados xylosyltransferase gene Souza em ganho de entalhe sinalização devido ao aumentado mediada por Delta trans-ativação de entalhe sem afetar o cis-inibição da Entalhe por ligantes⁸. Para testar esta noção, realizaram-se ensaios de agregação em vitro celular. Primeiro, Souza expressão nas células S2 foi derrubado usando Souza ds...

Discussão

Canônico de sinalização Notch depende das interacções entre o receptor do entalhe e seus ligantes⁵. Embora a maioria dos estudos sobre a via de Notch principalmente considerar a vinculação do entalhe e ligantes em células vizinhas (trans), entalhe e ligantes mesmo células interagem e estes so-called cis-interações podem desempenhar um papel inibitório no entalhe sinalização de^3,4. Nesse sentido, para decifra...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified	Lonza	04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution	GE Healthcare lifescience	SV30010
CELLSTAR 6 well plate	Greiner Bio-One	657 160
CELLSTAR 24 well plate	Greiner Bio-One	662160
VWR mini shaker	Marshell Sceintific	12520-956
Hemocytometer	Fisher Sceintific	267110
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit	Ambion	AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)	Zymo Research	R1054
VistaVision Inverted microscope	VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software	AmScope	MU-900	Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
Fetal Bovine Serum	GenDepot	F0600-050
Methotrexate	Sigma-Aldrich	A6770-10
Hygromycin B	Invitrogen	HY068-L6
Copper sulphate	Macron Fine Chemicals	4448-02
S2 cells	Invitrogen	R69007
S2-SerrateTom cells			Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells	DGRC	152
S2-Notch cells	DGRC	154
pMT-Delta vector	DGRC	1021	Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector			Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector	DGRC	1022	Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP			Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit	Applied Biosystem	1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)	Applied Biosystem	Dm02144576_g1	with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)	Applied Biosystem	Dm02151827_g1	with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	4351405	96-well Block module