Cella di aggregazione saggi per valutare l'associazione della tacca della drosofila con Trans-ligandi e la sua inibizione di Cis-ligandi

Riepilogo

Complessità dei sistemi in vivo rende difficile distinguere tra l'attivazione e l'inibizione del recettore Notch di trans- e cis-ligandi, rispettivamente. Qui, presentiamo un protocollo basato su in vitro saggi l'aggregazione delle cellule per la valutazione qualitativa e semiquantitativa del legame di Drosophila tacca alla trans-ligandi vs cis-ligandi.

Abstract

Tacca di segnalazione è un sistema di comunicazione cellula-cellula evolutivamente conservati utilizzato largamente in sviluppo degli animali e manutenzione dell'adulto. Interazione del recettore Notch con ligandi da cellule vicine induce l'attivazione del pathway di segnalazione (trans-attivazione), mentre l'interazione con ligandi dalla stessa cellula inibisce la segnalazione (cis-inibizione). Giusto equilibrio tra trans-attivazione e cis-inibizione aiuta a stabilire i livelli ottimali di tacca di segnalazione in alcuni contesti durante lo sviluppo degli animali. A causa dei domini di espressione sovrapposti di tacca ed i suoi ligandi in molti tipi cellulari e l'esistenza di meccanismi di feedback, studiando gli effetti di una determinata modifica alberino-translational su trans- versus cis-interazioni della tacca e suoi ligandi in vivo è difficile. Qui, descriviamo un protocollo per l'utilizzo della drosofila S2 cellule nelle analisi di aggregazione cellulare per valutare gli effetti di abbattere un modificatore di pathway di Notch nell'associazione della tacca ogni legante in trans e cis. S2 cellule stabilmente o transitoriamente trasfettate con un vettore che esprimono Notch sono mescolate con le cellule che esprimono ogni ligando Notch (S2-Delta o S2-dentellato). Trans-associazione tra i recettori e ligandi provoca la formazione di aggregati cellulari eterotipiche e viene misurata in termini di numero di aggregati / mL composto > 6 celle. Per esaminare l'effetto inibitorio di cis-ligandi, S2 cellule cheesprimono tacca e ogni ligando sono mescolate con le cellule S2-Delta o S2-dentellato e il numero degli aggregati è quantificato come descritto sopra. La relativa diminuzione del numero degli aggregati per la presenza di cis-ligandi fornisce una misura della cis-ligando-mediato l'inibizione di trans-associazione. Queste analisi semplice sugli effetti delle manipolazioni genetiche o farmacologici sull'associazione della tacca per suoi ligandi in grado di fornire dati semi-quantitativi e possono aiutare a decifrare i meccanismi molecolari sottostanti gli effetti in vivo di tali manipolazioni sulla tacca di segnalazione.

Introduzione

Canonico tacca di segnalazione è un meccanismo di comunicazione tra cellule a corto raggio che richiede il contatto fisico delle cellule per facilitare l'interazione tra recettori Notch e loro ligandi¹vicine. Interazione del recettore Notch (presente sulla superficie delle cellule di segnale di ricezione) con ligandi (presenti sulla superficie di invio di segnale celle) avvia la tacca di segnalazione ed è conosciuta come trans-attivazione². D'altra parte, l'interazione tra tacca ed i suoi ligandi nella stessa cella conduce all'inibizione del pathway Notch ed è conosciuta come cis-inibizione³. L'equilibrio tra trans- e cis-interazioni è necessaria per garantire l'ottima tacca di ligando-dipendenti di segnalazione⁴. Drosophila ha un recettore Notch e due ligandi (Delta e dentellato) al contrario di mammiferi, che hanno quattro tacca recettori e cinque ligandi [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-simile 1 (DLL1), DLL3 e DLL4]⁵. Avendo questa semplicità, il modello di Drosophila offre la facilità per sezionare/studio gli effetti dei modificatori di percorso su interazioni ligando Notch e successivamente su tacca di segnalazione. In determinati contesti durante lo sviluppo degli animali (tra cui lo sviluppo dell'ala in Drosophila), entrambi cis- e trans-interazioni sono coinvolti per ottenere adeguata tacca di segnalazione e delle cellule a destino^1,6 . È importante distinguere gli effetti dei modificatori di pathway di Notch in questi contesti il cis- e trans-interazioni della tacca con suoi ligandi.

Il nostro gruppo ha precedentemente segnalato che l'aggiunta di un residuo di carboidrato chiamato xilosio di Drosophila tacca negativamente regola tacca di segnalazione in determinati contesti, tra cui ala sviluppo⁷. Perdita di shams (l'enzima che xylosylates tacca) conduce ad un fenotipo di "perdita della vena di ala"⁷. Più recentemente, gli esperimenti di dosaggio del gene e l'analisi clonale sono stati utilizzati per mostrare che la perdita di shams migliora tacca Delta-mediata individuazione. Distinguere se la tacca di segnalazione avanzata nei mutanti di shams è il risultato di una riduzione cis-inibizione o aumentata trans-attivazione, studi di sovraespressione ectopica di ligandi di Notch in dischi immaginali larvale ala sono state effettuate utilizzando il driver di dpp-GAL4 . Questi esperimenti fornito prova che suggerisce che Shams regola trans-attivazione di tacca da Delta senza intaccare la tacca cis-inibizione di ligandi⁸. Tuttavia, feed-back regolamenti e gli effetti dei ligandi endogeni potrebbero complicare l'interpretazione di sovraespressione ectopica studi^1,6,9.

Per risolvere questo problema, drosofila S2 cellule¹⁰ sono stati utilizzati, che fornisce un sistema semplice in vitro per tacca-ligando interazione studi^11,12. S2 cellule non esprimono endogeno del recettore Notch e Delta ligando¹¹ ed esprimere un basso livello di dentellato¹³, che non influisce tacca-ligando aggregazione esperimenti⁸. Pertanto, le cellule S2 possono essere stabilmente o transitoriamente transfected di Notch e/o singoli ligandi (Delta o dentellato) per generare le cellule che esprimono esclusivamente il recettore Notch o uno dei suoi ligandi o una loro combinazione. Miscelazione delle cellule che esprimono Notch S2 con ligando-esprimendo risultati di cellule S2 nella formazione degli aggregati eterotipiche mediata da recettore-ligando associazione^11,12,14. Quantificazione della formazione aggregata fornisce una misura della trans-associazione tra tacca e suoi ligandi¹⁵ (Figura 1). Allo stesso modo, le cellule S2 possono essere co-trasfettate con ligandi tacca e Delta o Serrate (cioè cis-ligandi). CIS-ligandi in queste cellule che esprimono Notch S2 abrogare l'associazione della tacca con trans-ligandi e risultato in diminuzione formazione aggregata^8,12,14. Il relativo calo in formazione aggregata causata da cis-ligandi fornisce una misura dell'effetto inibitorio di cis-ligandi sull'associazione tra tacca e trans-ligandi (Figura 2). Di conseguenza, le analisi di aggregazione delle cellule sono state utilizzate per esaminare l'effetto di perdita di xylosylation trans- e cis-interazioni tra tacca ed i suoi ligandi.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per saggi di aggregazione cellulare finalizzata a valutare l'associazione della tacca con trans-ligandi e la sua inibizione di cis-ligandi usando le cellule della drosofila S2. Ad esempio, forniamo i dati che ci ha permesso di determinare l'effetto di xylosylation tacca sull'associazione tra tacca e trans-Delta⁸. Queste analisi semplice forniscono una valutazione semi-quantitativa del tacca-ligando interazioni in vitro e consentono a determinare i meccanismi molecolari sottostanti gli effetti in vivo di modificatori del pathway di Notch.

Protocollo

1. preparazione del doppio incagliato RNA (dsRNA) per atterramento di Shams

1. Amplificazione di PCR dei prodotti
   1. È possibile utilizzare il DNA genomico di selvaggio-tipo bianco giallo (y w) e pAc5.1-EGFP come modello e le seguenti coppie di primer per amplificare i frammenti di DNA utilizzati nella sintesi di dsRNA. Utilizzare il seguente profilo termico di PCR: denaturazione (95 ° C, 30 s), ricottura (58 ° C, 30 s) ed estensione (72 ° C, 1 min).
      Migliorata la proteina fluorescente verde (EGFP) dsRNA primer (5' - 3')-
      Forward primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Reverse primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Shams dsRNA primer (5' - 3')-
      Forward primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Reverse primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      Nota: EGFP dsRNA viene utilizzato come controllo negativo.
2. Gel-purificare i prodotti di reazione a catena (PCR) polimerasi utilizzando un kit di purificazione del gel commerciale secondo il protocollo del produttore.
3. Eseguire la trascrizione in vitro utilizzando un prodotto commerciale in grado di trascrivere da un promotore T7 secondo il protocollo del produttore.
4. Purificare il dsRNA utilizzando un kit di purificazione di RNA secondo il protocollo del produttore e conservare a-80 ° C.
5. Valutare l'efficienza di shams atterramento utilizzando la seguente procedura (1.5.1-1.5.5).
   1. Conteggio celle manualmente utilizzando un emocitometro e piastra 5x10⁵ S2 cellule in ciascun pozzetto di un 6 anche piastra in 1ml/bene di medie di Schneider supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 100 U/mL penicillina-streptomicina.
   2. Aggiungere 7,5 µ g di EGFP- o dsRNA shams ad ogni pozzetto e incubare a 25 ° C per 24 h.
   3. Raccolto il controllo (EGFP dsRNA-Trattato) e shams dsRNA-Trattato S2 cellule pipettando dolce seguita da cubettatura giù mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 min a 25 ° C e di processo per l'isolamento di RNA utilizzando un kit di estrazione di RNA secondo protocollo del produttore.
   4. Quantificare il RNA usando un spettrofotometro e processo di 100 ng di RNA per passaggio 1 qRT-PCR utilizzando reagenti commerciali qPCR e primer/sonde e il seguente profilo termico di PCR: denaturazione (95 ° C, 15 s) e ricottura/estensione (60 ° C, 1 min).
      Nota: Vedere la Tabella materiali per informazioni sui set di primer/sonda e lo strumento utilizzato per esperimenti di qRT-PCR shams e controllo in questi studi.
   5. Calcolare i livelli di mRNA di relativo shams utilizzando 2^–ΔΔCT metodo¹⁶.

2. valutazione dell'associazione tra il recettore Notch e Trans-ligandi

1. Preparare il segnale di ricezione (cellule S2 che esprimono il recettore Notch).
   1. Contare le celle manualmente utilizzando un emocitometro e piastra 5x10⁵ S2 e cellule S2-tacca stabili in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 1ml/bene di medie di Schneider supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina.
      Nota: Per le cellule S2-Notch, che sono disponibili da Drosophila Genomics Resource Center (DGRC), aggiungere 200 metotrexato nM nei media. Per preparare una soluzione stock di metotrexato 0,5 mM, in primo luogo preparare una soluzione di metotrexato 20 mM a 250 µ l di 1 M NaOH. Successivamente, diluire questa soluzione a 0,5 mM a 1 M fosfato tampone salino e conservare a-20 ° C. In cellule S2-tacca, espressione della proteina Notch è sotto il controllo del promotore della drosofila metallotioneina nel vettore di pMT .
   2. Aggiungere 7,5 µ g di dsRNA in ogni pozzetto e incubare a 25 ° C per 24 h.
   3. Aggiungere 0,7 mM CuSO₄ inducono l'espressione di Notch e incubare a 25 ° C per 3 giorni.
      Nota: CuSO₄ viene utilizzato per indurre l'espressione di proteine controllato dal promotore metallotioneina.
2. Preparare l'invio segnale celle (cella di S2 esprimendo ligandi Delta o dentellato).
   1. Contare le celle manualmente utilizzando un emocitometro e piastra ~ 5 x 10⁶ S2-Delta o S2-dentellato^Tom cellule stabili in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 1 mL/pozzetto di medie di Schneider supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina.
      Nota: Aggiungere 200 nM methotrexate per cellule S2-Delta e 100 µ g/mL igromicina per S2-dentellato^Tom cellule nei media. Espressione di Delta e dentellato^Tom— una versione funzionante di dentellato¹²pomodoro-etichetta — è in Drosophila metallotioneina promotore nel vettore di pMT .
   2. Aggiungere 0,7 mM CuSO₄ inducono l'espressione di ligandi e incubare a 25 ° C per 3 h.
3. Eseguire l'aggregazione tra le celle di segnale-invio e ricezione di segnale.
   1. Raccogliere la S2 dsRNA-Trattato (controllo) e cellule S2-tacca di pipettaggio delicato e piastra di 2.5 x 10⁵ cellule/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti dopo il conteggio manuale di un emocitometro.
   2. Aggiungere cellule stabili 5x10⁵ S2-Delta o S2-dentellato^Tom in un volume totale di 200 µ l di terreno di Schneider (supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina).
      Nota: Tutte le cellule S2 gestione (compreso il trattamento di cromatura, induzione e dsRNA) è stato fatto sotto una cappa di biosicurezza.
   3. Collocare la piastra su un agitatore orbitale a 150 giri/min (rad 942,48/min).
   4. Dopo 1 min, mescolare il contenuto di ogni pozzetto e prendere 20 µ l per conteggiare il numero degli aggregati.
      1. Allo stesso tempo prendere un'immagine rappresentativa sotto microscopio composto invertito con ingrandimento 10x (obiettivo PLL 10/0.25).
      2. Contare manualmente le aggregazioni (> 6 celle) utilizzando un emocitometro.
   5. Posizionare la piastra su un agitatore.
   6. Ripetere l'acquisizione dell'immagine e il conteggio dopo 5 min e 15 min di aggregazione.
4. Eseguire la quantificazione di trans-associazione.
   1. Calcolare il numero di aggregazioni / mL tra cellule S2 e S2-Delta o S2-dentellato^Tom come un controllo di sfondo.
   2. Calcolare il numero di aggregazioni / mL tra S2-Notch e cellule S2-Delta o S2-dentellato^Tom (magnitudo di trans-associazione).

3.Valutazione dell'inibizione del legame tra tacca e Trans-ligandi di Cis-ligandi

1. Preparare cellule di segnale di ricezione.
   1. Le cellule di piastra 5x10⁵ S2 in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 1ml/bene di medie di Schneider supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina.
   2. Aggiungere 7,5 µ g di dsRNA in ogni pozzetto e incubare a 25 ° C per 24 h.
   3. Co-transfect le cellule dsRNA-trattate con pBluescript e PMT-tacca¹¹ (DGRC) da solo o con pMT-Notch e pMT-Delta¹¹ (DGRC) o PMT-dentellato¹⁷ per un totale Concentrazione di DNA di 2 µ g/Beh utilizza un reagente di transfezione commerciale secondo il protocollo del produttore.
      Nota: pBluescript viene utilizzato come un controllo. Le cellule co-trasfettate saranno chiamate S2-tacca & Delta^transitoria o S2-tacca & dentellato cellule^transitoria in seguito.
   4. Incubare le cellule S2 transfected transitoriamente a 25 ° C per 24 h.
   5. Aggiungere 0,7 mM CuSO₄ inducono l'espressione di Notch e i ligandi e incubare a 25 ° C per 3 giorni.
2. Preparare l'invio segnale celle come descritto al punto 2.2.
3. Eseguire l'aggregazione tra le celle di segnale-invio e ricezione segnale come descritto nella sezione 2.3.
4. Quantificare l'inibizione di trans-associazione di cis-ligandi.
   1. Calcolare il numero di aggregazioni / mL fra le cellule S2 e S2-Delta o S2-dentellato celle come un controllo di sfondo.
   2. Quantificare la grandezza di inibizione di cis-ligandi come segue.
      1. Definire A come numero di aggregazioni tra S2-tacca^transitoria e cellule S2-Delta.
      2. Definire B come numero di aggregazioni tra S2 cellule transitoriamente co-trasfettate con tacca e Delta (S2-tacca & Delta^transitoria) e cellule S2-Delta.
      3. Calcolare la relativa aggregazione C = (B x 100) /A
      4. Calcolare la grandezza di inibizione di cis- ligando (Delta o dentellato) come 100 – C.
         Nota: ad esempio, se la relativa aggregazione è 45%, cis-ligandi sono considerati per inibire la trans-associazione del 55%.

Risultati

Le nostre osservazioni in vivo hanno suggerito che la perdita dei risultati di shams xylosyltransferase gene in guadagno di tacca di segnalazione causa di aumentata Delta-mediata trans-attivazione di tacca senza intaccare il cis-inibizione di Tacca di ligandi⁸. Per testare questo concetto, sono state eseguite analisi di aggregazione in vitro delle cellule. In primo luogo, shams espressione in cellule S2 è stato...

Discussione

Canonico tacca di segnalazione dipende le interazioni tra il recettore Notch e i suoi ligandi⁵. Anche se la maggior parte degli studi sul pathway di Notch considera principalmente l'associazione della tacca e ligandi in cellule vicine (trans), Notch e leganti delle stesse cellule interagiscono e questi cosiddetti cis-interazioni possono giocare un ruolo inibitorio nella tacca segnalazione di^3,4. Di conseguenza, a decifrar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified	Lonza	04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution	GE Healthcare lifescience	SV30010
CELLSTAR 6 well plate	Greiner Bio-One	657 160
CELLSTAR 24 well plate	Greiner Bio-One	662160
VWR mini shaker	Marshell Sceintific	12520-956
Hemocytometer	Fisher Sceintific	267110
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit	Ambion	AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)	Zymo Research	R1054
VistaVision Inverted microscope	VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software	AmScope	MU-900	Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
Fetal Bovine Serum	GenDepot	F0600-050
Methotrexate	Sigma-Aldrich	A6770-10
Hygromycin B	Invitrogen	HY068-L6
Copper sulphate	Macron Fine Chemicals	4448-02
S2 cells	Invitrogen	R69007
S2-SerrateTom cells			Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells	DGRC	152
S2-Notch cells	DGRC	154
pMT-Delta vector	DGRC	1021	Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector			Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector	DGRC	1022	Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP			Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit	Applied Biosystem	1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)	Applied Biosystem	Dm02144576_g1	with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)	Applied Biosystem	Dm02151827_g1	with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	4351405	96-well Block module