Célula de ensayos de agregación para evaluar el atascamiento de la muesca de Drosophila con Trans-ligandos y su inhibición por Cis-ligandos

Resumen

Complejidad de los sistemas en vivo hace que sea difícil distinguir entre la activación y la inhibición del receptor Notch por trans- y cis-ligandos, respectivamente. Aquí, presentamos un protocolo basado en los análisis agregación celular en vitro para la evaluación cualitativa y semicuantitativa de la Unión de la muesca de la Drosophila a trans-ligandos vs cis-ligandos.

Resumen

Señalización de Notch es un sistema de comunicación célula-célula evolutivamente conservado utilizado ampliamente en el desarrollo de animales y mantenimiento del adulto. Interacción del receptor Notch con ligandos de los vecinos células induce la activación de la vía de señalización (trans-activación), mientras que la interacción con ligandos de la misma célula inhibe la señalización (cis-inhibición). Equilibrio adecuado entre trans-activación y cis-inhibición ayuda a establecer niveles óptimos de señalización Notch en algunos contextos durante el desarrollo animal. Debido a los dominios de expresión superpuestos de la muesca y sus ligandos en muchos tipos celulares y la existencia de mecanismos de retroalimentación, estudiando los efectos de una determinada modificación poste-de translación en trans- y cis-interacciones de la muesca y sus ligandos en vivo es difícil. Aquí, describimos un protocolo para el uso de las células S2 de Drosophila en los ensayos de agregación celular para evaluar los efectos de derribar un modificador de la vía de Notch en la Unión de muesca a cada ligando trans y el cis. S2 las células transfectadas estable o transitorio con un vector de expresión de muesca se mezclan con las células que expresan cada ligando de Notch (serrado S2 o S2-Delta). Trans-unión entre los receptores y ligandos resulta en la formación de agregados celulares heterotípicos y se mide en términos del número de agregados por mL compuesto de > 6 células. Para examinar el efecto inhibitorio de cis-ligandos, S2 las células Co muesca y cada ligando se mezclan con las células Delta del S2 o S2-serrado y se cuantificó el número de agregados como se describió anteriormente. La disminución relativa del número de agregados debido a la presencia de cis-ligandos proporciona una medida de cis-ligand-mediada por la inhibición de la trans-vinculante. Estos ensayos sencillos pueden proporcionar datos semi cuantitativos sobre los efectos de manipulaciones genéticas o farmacológicas en la Unión de ranura a sus ligandos y pueden ayudar a descifrar los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos en vivo de tales manipulaciones sobre la señalización de Notch.

Introducción

Canónica de la señalización de Notch es un mecanismo de comunicación de célula a célula de corto alcance que requiere contacto físico de los vecinos a las células para facilitar la interacción entre receptores Notch y sus ligandos¹. Interacción del receptor Notch (presente en la superficie de las células receptores de señal) con ligandos (presentes en la superficie de envío de señal de las células) inicia la señalización de Notch y se conoce como trans-activación². Por otro lado, la interacción entre muesca y sus ligandos en la célula misma conduce a la inhibición de la vía de Notch y es conocido como cis-inhibición de la³. El equilibrio entre trans- y cis-interacciones es necesaria para asegurar la óptima muesca dependiente de ligando señalización⁴. Drosophila tiene un receptor Notch y dos ligandos (Delta y serrado) a diferencia de los mamíferos, que tienen cuatro receptores Notch y cinco ligandos [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-like 1 (DLL1), DLL3 y DLL4]⁵. Esta simplicidad, el modelo de Drosophila ofrece la facilidad para diseccionar y estudio de los efectos de los modificadores vía las interacciones ligando de Notch y posteriormente sobre la señalización de Notch. En ciertos contextos durante el desarrollo animal (incluyendo desarrollo de ala de Drosophila), cis- y trans-interacciones participan para lograr la adecuada señalización Notch y células destino^1,6 . Es importante distinguir los efectos de los modificadores de la vía de Notch en estos contextos en cis- y trans-las interacciones de la muesca con sus ligandos.

Nuestro grupo reportó anteriormente que además de un residuo de carbohidrato llamado xilosa a Drosophila muesca negativa regula la señalización de Notch en ciertos contextos, incluyendo ala desarrollo⁷. Pérdida de shams (la enzima que xylosylates muesca) conduce a un fenotipo de «pérdida de vena del ala»⁷. Más recientemente, experimentos de dosis génica y análisis clonal fueron utilizados para mostrar que pérdida de shams realza señalar muesca mediada por el Delta. Para distinguir si la señalización de Notch mejorada en shams mutantes es el resultado de la disminución de cis-inhibición o aumento de trans-activación, sobreexpresión ectópico estudios de ligandos de muesca en discos imaginal de ala de larvas se realizaron utilizando el controlador de la dpp-GAL4 . Estos experimentos proporcionan evidencias sugiriendo que Shams regula trans-activación de Notch por Delta sin afectar la muesca cis-inhibición por ligandos⁸. Sin embargo, retroalimentación normativa y efectos de los ligandos endógenos podrían complicar la interpretación de sobreexpresión ectópico estudios^1,6,9.

Para resolver este problema, en células S2 de Drosophila ¹⁰ fueron utilizados, que preven un sistema simple en vitro ligando de Notch-interacción estudios^11,12. Células S2 no expresar endógenos receptor de la muesca y Delta ligando¹¹ y expresar un bajo nivel de Serrate¹³, que no afecta el ligando de Notch-agregación experimentos⁸. Por lo tanto, las células S2 pueden ser estable o transitorio transfected por muesca o ligandos individuales (Delta o serrado) para generar las células que expresan exclusivamente el receptor Notch o uno de sus ligandos o una combinación de ellos. Mezcla de células expresando muesca S2 con resultados de S2 ligand-expresar las células en la formación de agregados heterotípicos mediada por receptor-ligando vinculante^11,12,14. Cuantificación de la formación agregada provee una medida de trans-vinculante entre la muesca y sus ligandos¹⁵ (figura 1). Del mismo modo, las células S2 pueden ser co transfected con muesca y Delta o serrado ligandos (por ejemplo, cis-ligandos). CIS-ligandos en estas células expresando muesca S2 derogar el atascamiento de la muesca con trans-ligandos y resultado en disminución de agregado formación^8,12,14. La disminución relativa de formación agregada causada por cis-ligandos proporciona una medida del efecto inhibitorio de cis-ligandos de unión entre la muesca y trans-ligandos (figura 2). Por consiguiente, se utilizaron estudios de agregación de células para examinar el efecto de la pérdida de xylosylation de trans- y cis-interacciones entre la muesca y sus ligandos.

Aquí, presentamos un protocolo detallado para estudios de agregación de células para evaluar el atascamiento de la muesca con trans-ligandos y su inhibición por cis-ligandos utilizando células S2 de Drosophila . Por ejemplo, ofrecemos los datos que nos permitieron determinar el efecto de la muesca xylosylation de enlace entre la muesca y trans-Delta⁸. Estos ensayos sencillos proporcionan una evaluación semi-cuantitativa de las interacciones ligando-muesca en vitro y determinar los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos en vivo de los modificadores de la vía de Notch.

Protocolo

1. preparación de doble trenzado RNA (dsRNA) por caída de Shams

1. Amplificación por PCR de los productos
   1. Utilice tipo salvaje blanco amarillo (w y) la DNA genomic y pAc5.1-EGFP como plantilla y las siguientes combinaciones de primer para amplificar los fragmentos de ADN utilizados en síntesis de dsRNA. Utilice el siguiente perfil térmico de PCR: desnaturalización (95 ° C, 30 s), recocido (58 ° C, 30 s) y extensión (72 º C, 1 min).
      Mejorada de la proteína verde fluorescente Cartillas de dsRNA (EGFP) (5' - 3')-
      Primer avance-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Revertir la cartilla-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Impostores de dsARN cebadores (5' - 3')-
      Primer avance-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Revertir la cartilla-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      Nota: EGFP dsARN se utiliza como control negativo.
2. Gel-purificar los productos de la reacción en cadena (PCR) de polimerasa usando un kit de potabilización de gel comercial según protocolo del fabricante.
3. Realizar en vitro transcripción utilizando un producto comercial capaz de transcripción desde un promotor T7 según protocolo del fabricante.
4. Purificar el dsRNA utilizando un kit de purificación de RNA según protocolo del fabricante y almacenar a-80 ° C.
5. Evaluar la eficiencia de shams caída siguiendo los siguientes pasos (1.5.1-1.5.5).
   1. Cuenta las celdas manualmente usando un hemocitómetro y placa de 5 x 10⁵ S2 células en cada pozo de 6 bien placa 1 mL/pozo de medio de Schneider suplementado con 10% suero bovino Fetal (FBS) y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
   2. Añadir 7,5 μg de EGFP- o impostores de dsRNA a cada pozo e incubar a 25 ° C durante 24 h.
   3. Cosecha el control (EGFP tratados de dsRNA) y shams dsRNA-S2 las células tratadas mediante pipeteo suave seguida de granulación abajo por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min a 25 ° C y el proceso para el aislamiento de RNA usando un kit de extracción de RNA según Protocolo del fabricante.
   4. Cuantificar el ARN utilizando un espectrofotómetro y proceso 100 ng de ARN para paso 1 qRT-PCR utilizando reactivos comerciales qPCR y puntas de prueba de la cartilla y el siguiente perfil térmico de PCR: desnaturalización (95 ° C, 15 s) y recocido/extensión (60 ° C, 1 min).
      Nota: Consulte la Tabla de materiales de información en el primer punta de prueba y el instrumento utilizado para experimentos de qRT-PCR shams y control en estos estudios.
   5. Calcular los niveles de mRNA de relativa shams usando 2^–ΔΔCT método¹⁶.

2. evaluación de la unión entre el Receptor Notch y Trans-ligandos

1. Preparar recepción de señal (células S2 expresando el receptor Notch).
   1. Contar las celdas manualmente utilizando un hemocitómetro y placa de 5 x 10⁵ S2 y estables células S2-muesca en cada pocillo de una placa de 6 pozos en 1 mL/pozo de medio de Schneider suplieron con 10% FBS y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
      Nota: Para las células S2-Notch, que dispone de centro de recursos de genómica de Drosophila (DGRC), agregue 200 metotrexato nM en los medios de comunicación. Para preparar una solución stock de metotrexato 0,5 mM, en primer lugar, preparar una solución de metotrexato de 20 mM en 250 μl de 1 M NaOH. A continuación, diluir esta solución a 0,5 mM en 1 M fosfato buffer salino y almacenar a-20 ° C. En células S2-muesca, expresión de la proteína Notch está bajo el control del promotor de la metalotioneína de Drosophila en el vector de la pMT .
   2. Añadir 7,5 μg de dsRNA a cada pozo e incubar a 25 ° C durante 24 h.
   3. Añada 0,7 mM CuSO₄ inducen la expresión de la muesca e incubar a 25 ° C durante 3 días.
      Nota: CuSO₄ se utiliza para inducir la expresión de proteínas controladas por el promotor de la metalotioneína.
2. Preparar el envío de señal de las células (S2 célula expresan ligandos Delta o serrado).
   1. Cuenta las celdas manualmente usando un hemocitómetro y placa de ~ 5 x 10⁶ estable Delta S2 o S2-serrado^Tom células en cada pozo de una placa de 6 pozos en 1 mL/pozo de medio de Schneider suplementado con 10% FBS y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
      Nota: Agregue 200 metotrexato nM para células S2-Delta y 100 μg/mL Higromicina para serrado de S2^Tom células en medios de comunicación. Expresión de Delta y Serrate^Tom— una versión funcional etiquetado tomate de Serrate¹²— está bajo el promotor de la metalotioneína de Drosophila en el vector de la pMT .
   2. Añada 0,7 mM CuSO₄ inducir la expresión de ligandos e incubar a 25 ° C durante 3 horas.
3. Realizar la agregación entre las células enviando señales y receptores de señal.
   1. Cosecha el S2 de dsARN tratados (control) y las células S2-muesca por pipeteo suave y placa de 2.5 x 10⁵ células/pozo en un plato 24-well después de conteo manual por hemocitómetro.
   2. Añadir 5 x 10⁵ células estables Delta S2 o S2-serrado^Tom en un volumen total de 200 μL de medio de Schneider (suplementado con 10% FBS y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina).
      Nota: Todas las células del S2 manejo (incluyendo el tratamiento de la galjanoplastia, la inducción y el dsRNA) se realizó bajo un gabinete de bioseguridad.
   3. Colocar la placa sobre un agitador orbital a 150 rpm (942,48 rad/min).
   4. Después de 1 minuto, mezcle el contenido de cada pocillo y saque 20 μl para contar el número de agregados.
      1. Al mismo tiempo coger una imagen representativa bajo microscopio invertido compuesto de 10 aumentos (objetivo PLL 10/0.25).
      2. Contar manualmente los agregados (> 6 células) usando un hemocitómetro.
   5. Coloque la placa en una coctelera Boston.
   6. Repetir la adquisición de la imagen y contar después de 5 min y 15 min de la agregación.
4. Realizar cuantificación de trans-vinculante.
   1. Calcular el número de agregados por mL entre células S2 y S2-Delta o serrado S2^Tom como un control de fondo.
   2. Calcular el número de agregados por mL entre S2-muesca y las células Delta del S2 o S2-serrado^Tom (magnitud de trans-enlace).

3.Evaluación de la inhibición de la unión entre la muesca y Trans-ligandos por Cis-ligandos

1. Preparar las células receptores de señal.
   1. Células de placa de 5 x 10⁵ S2 en cada pocillo de una placa de 6 pozos en 1 mL/pozo de medio de Schneider suplieron con 10% FBS y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
   2. Añadir 7,5 μg de dsRNA a cada pozo e incubar a 25 ° C durante 24 h.
   3. Co transfectar las células tratadas con dsRNA pBluescript y PMT-muesca¹¹ (DGRC) solo o con Muesca de pMT y pMT-Delta¹¹ (DGRC) o Serrado pMT¹⁷ para un total Concentración de DNA de 2 μg/pocillo utilizando un reactivo de transfección comercial según protocolo del fabricante.
      Nota: pBluescript se utiliza como un control. Las células transfected Co se llamará S2-muesca & Delta^transitoria o S2-muesca & serrado las células^transitorias de ahora en adelante.
   4. Incube las células transfected transitorio S2 a 25 ° C durante 24 h.
   5. Añada 0,7 mM CuSO₄ inducen la expresión de Notch y los ligandos e incubar a 25 ° C durante 3 días.
2. Preparar envío de señal de las células como se describe en 2.2.
3. Realizar la agregación entre las células enviando señales y receptores de señal como se describe en la sección 2.3.
4. Cuantificar la inhibición de la trans-vinculante por cis-ligandos.
   1. Calcular el número de agregados por mL entre células S2 y S2-Delta o serrado S2 como un control de fondo.
   2. Cuantificar la magnitud de la inhibición por cis-ligandos como sigue.
      1. A se define como número de agregados entre S2-muesca^transitorio y las células Delta S2.
      2. Definir B como el número de agregados entre las células S2 Co transfectadas transitoriamente con muesca y Delta (S2-muesca & Delta^transitorio) y las células Delta de S2.
      3. Calcular la agregación relativa C = (B x 100) /A
      4. Calcular la magnitud de la inhibición por cis- ligando (Delta o serrado) como 100- C.
         Nota: como ejemplo, si la agregación relativa es 45%, cis-se consideran ligandos inhiben la trans-vinculante en un 55%.

Resultados

Nuestras observaciones en vivo sugirieron que pérdida de la xylosyltransferase gene shams en el aumento de la señalización de Notch debido a aumentado mediada por Delta trans-activación de Notch sin afectar a la cis-inhibición de la Muesca por ligandos⁸. Para probar esta idea, fueron realizados en vitro estudios de agregación de células. En primer lugar, expresión de shams en células S2 fue derribado co...

Discusión

Canónica de la señalización de Notch depende de las interacciones entre el receptor Notch y sus ligandos⁵. Aunque la mayoría de los estudios sobre la vía de Notch considera principalmente la Unión de ranura y ligandos de células vecinas (trans), muesca y misma célula ligandos interactúan y estos llamados cis-interacciones pueden desempeñar un papel inhibitorio en la muesca señalización de^3,4. Por consiguiente,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified	Lonza	04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution	GE Healthcare lifescience	SV30010
CELLSTAR 6 well plate	Greiner Bio-One	657 160
CELLSTAR 24 well plate	Greiner Bio-One	662160
VWR mini shaker	Marshell Sceintific	12520-956
Hemocytometer	Fisher Sceintific	267110
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit	Ambion	AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)	Zymo Research	R1054
VistaVision Inverted microscope	VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software	AmScope	MU-900	Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
Fetal Bovine Serum	GenDepot	F0600-050
Methotrexate	Sigma-Aldrich	A6770-10
Hygromycin B	Invitrogen	HY068-L6
Copper sulphate	Macron Fine Chemicals	4448-02
S2 cells	Invitrogen	R69007
S2-SerrateTom cells			Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells	DGRC	152
S2-Notch cells	DGRC	154
pMT-Delta vector	DGRC	1021	Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector			Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector	DGRC	1022	Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP			Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit	Applied Biosystem	1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)	Applied Biosystem	Dm02144576_g1	with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)	Applied Biosystem	Dm02151827_g1	with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	4351405	96-well Block module