JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המורכבות של מערכות ויוו מקשה להבחין בין הפעלת עיכוב של קולטן חריץ על ידי טרנס- ו - cis-ליגנדים, בהתאמה. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מבוסס על במבחנה תא-צבירת מבחני הערכה כמותיים למחצה של הכריכה של חריץ דרוזופילה טרנס-ליגנדים vs cis-ליגנדים.

Abstract

חריץ איתות הינה מערכת תקשורת תא שנשמרת אבולוציונית-תא בשימוש נפוץ חיות פיתוח ותחזוקה למבוגרים. האינטראקציה של הקולטן חריץ עם ליגנדים מגבולות התאים גורם ההפעלה של מסלול איתות (טרנס-הפעלה), תוך אינטראקציה עם ליגנדים מאותו תא מעכב איתות (cis-עיכוב). האיזון הראוי בין הטרנס-הפעלה ו- cis-עיכוב מסייעת בהקמת רמות אופטימלית של חריץ איתות בהקשרים מסוימים במהלך התפתחות בעלי חיים. בגלל על התחומים ביטוי חופפים בין החריץ שלה ליגנדים סוגי תאים רבים על קיום מנגנוני משוב, לומד את ההשפעות של שינוי post-translational נתון על טרנס- לעומת cis-האינטראקציות של דרגה, קשה שלה ליגנדים ויוו . כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור שימוש בתאים דרוזופילה -S2 תא-צבירת מבחני כדי להעריך את ההשפעות של מפילה את צירוף מסלול חריץ על הכריכה של חריץ כדי כל ליגנד טרנס , ב- cis. S2 תאים stably או transiently transfected עם חריץ-להביע וקטור מעורבבים עם תאים לבטא כל ליגנד דרגה (S2-דלתא או מסורית-S2). טרנס-מחייבים בין קולטן ליגנדים גורמת להיווצרות של אגרגטים תא heterotypic, נמדד במונחים של מספר אגרגטים לכל mL המורכב > 6 תאים. כדי לבחון את ההשפעה המעכבת של cis-S2 תאים משותפת להביע חריץ ואת כל ליגנד מעורבבים עם תאים S2-דלתא או S2-מסורית של ליגנדים, המספר של אגרגטים הוא לכמת כמתואר לעיל. הירידה היחסית במספר של אגרגטים בשל נוכחותם של cis-ליגנדים מספק מידה של cis-ליגנד-מתווכת עיכוב של טרנס-איגוד. אלה מבחני פשוטה יכול לספק נתונים כמותיים למחצה על ההשפעות של גנטית או תרופתי מניפולציות על הכריכה של חריץ כדי ליגנדים שלה, יכול לעזור לפענח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס ויוו השפעות כזה מניפולציות על חריץ איתות.

Introduction

איתות חריץ קאנוני הוא מנגנון תקשורת לתא לטווח קצר הדורש מגע פיזי של השכנה תאים כדי להקל על האינטראקציה בין קולטני חריץ שלהם ליגנדים1. האינטראקציה של חריץ קולטן (קיים על פני תאי קליטת אות) עם ליגנדים (בהווה על פני השטח של שליחת אות תאים) יוזם חריץ איתות, המכונה הטרנס-הפעלת2. מצד שני, האינטראקציה בין החריץ שלה ליגנדים באותו התא מוביל אל עיכוב של מסלול חריץ, ידועה בשם cis-עיכוב3. האיזון בין הטרנס- cis-האינטראקציות נדרש כדי להבטיח חריץ תלויות ליגנד-אופטימלי איתות4. דרוזופילה יש קולטן חריץ אחד, שני ליגנדים (דלתא ו Serrate) לעומת יונקים, אשר יש קולטנים דרגה ארבע חמש ליגנדים [משוננים 1 (JAG1), JAG2, כמו דלתא 1 (DLL1), DLL3, DLL4]5. המודל דרוזופילה נתקל הפשטות, מציע את הקלות כדי לנתח/לימוד ההשפעות של מסלול מכפילי על אינטראקציות חריץ-ליגנד ובעקבות כך על חריץ איתות. בהקשרים מסוימים במהלך התפתחות בעלי חיים (כולל אגף פיתוח בדרוזופילה), הן cis- והן הטרנס-האינטראקציות מעורבים איתות חריץ המתאים ושאיפה תא גורל1,6 . חשוב להבחין את ההשפעות של חריץ מכפילי מסלול בהקשרים אלה ב- cis- לעומת הטרנס-האינטראקציות של חריץ עם ליגנדים שלה.

הקבוצה שלנו דיווחו בעבר כי תוספת של משקע פחמימות שנקרא xylose כדי חריץ דרוזופילה שלילית מווסת את חריץ איתות בהקשרים מסוימים, כולל אגף פיתוח7. אובדן שמס (האנזים הזה xylosylates דרגה) שמוביל פנוטיפ "אובדן וריד כנף"7. לאחרונה, ג'ין המינון ניסויים וניתוח המשובטים שימשו כדי להראות כי אובדן שמס מגבירה את חריץ בתיווך דלתא להתמקד. כדי להבחין בין אם באיתות חריץ משופרת במוטציות שמס הוא תוצאה של ירידה cis-עיכוב או מוגבר טרנס-הפעלה, ביטוי חוץ רחמי מחקרים של ליגנדים דרגה ב דיסקים דמותי כנף זחל בוצעו באמצעות מנהל התקן dpp-GAL4 . ניסויים אלה סיפק ראיות שמרמזות על כך שמס מווסת את טרנס-הפעלה של חריץ על ידי דלתא מבלי להשפיע על הרמה cis-עיכוב על ידי ליגנדים8. עם זאת, הזנה-בחזרה תקנות, ההשפעות של ליגנדים אנדוגני עלול לסבך את הפרשנות של ביטוי חוץ רחמי מחקרים1,6,9.

כדי לפתור בעיה זו, תאים S2 דרוזופילה 10 שימשו, אשר מספקים מערכת פשוטה במבחנה חריץ-ליגנד אינטראקציה מחקרים11,12. תאים S2 לא אקספרס אנדוגני חריץ קולטן ו- ליגנד דלתא11 ולבטא רמה נמוכה של מסורית13, אשר אינה משפיעה על הרמה-ליגנד צבירה ניסויים8. לכן, S2 תאים יכולים להיות stably או transiently transfected על ידי חריץ ו/או ליגנדים בודדים (דלתא או Serrate) כדי ליצור תאים המבטאים באופן בלעדי את הקולטן חריץ או באחד ליגנדים שלה, או שילוב של אותם. ערבוב של תאים לבטא חריץ S2 עם הבעת-ליגנד S2 תאים תוצאות להיווצרות של אגרגטים heterotypic מתווכת על-ידי ליגנד קולטן איגוד11,12,14. כימות של היווצרות צבירה מספק מידה של טרנס-מחייב בין החריץ שלה ליגנדים15 (איור 1). באופן דומה, תאים S2 יכול להיות שותף transfected עם ליגנדים חריץ, דלתא או Serrate (דהיינו cis-ליגנדים). Cis-ליגנדים בתאים אלה S2 לבטא חריץ מחסלים. את הכריכה של חריץ עם טרנס-תוצאה של ליגנדים ירד היווצרות הצבירה8,12,14. הירידה היחסית במבנה הצבירה הנגרמת על ידי חבר העמים-ליגנדים מספק מדד ההשפעה המעכבת של cis-ליגנדים על איגוד בין הרמה הטרנס-ליגנדים (איור 2). בהתאם לכך, מבחני צבירת תא נוצלו לבחון את ההשפעה של אובדן xylosylation על טרנס- ו - cis-האינטראקציות בין דרגה ליגנדים שלה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור תא צבירת מבחני שנועדה להעריך את הכריכה של חריץ עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים באמצעות תאים S2 דרוזופילה . לדוגמה, אנו מספקים את הנתונים אפשרה לנו לקבוע את ההשפעה של חריץ xylosylation על איגוד בין הרמה הטרנס-דלתא8. אלה מבחני ישירה לספק הערכה כמותית למחצה של חריץ-ליגנד אינטראקציות במבחנה , לעזור לקבוע את המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההשפעות ויוו ממגבילי מסלול חריץ.

Protocol

1. הכנה של RNA תקועים כפול (dsRNA) נוקאאוט שמס

  1. PCR הגברה של המוצרים
    1. להשתמש DNA גנומי פראי-סוג לבן צהוב (y w) ו pAc5.1-EGFP כמו תבנית זוגות פריימר הבאים כדי להגביר את שברי DNA המשמשים סינתזה dsRNA. להשתמש בפרופיל תרמי PCR הבאים: דנטורציה (95 ° C, 30 s), מחזק (58 ° C, 30 s) והסיומת (72 ° C, 1 דקות).
      משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) dsRNA תחל (5' - 3')-
      פריימר לפנים-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      הפוך פריימר-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      שמס dsRNA תחל (5' - 3')-
      פריימר לפנים-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      הפוך פריימר-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      הערה: EGFP dsRNA משמש בקרה שלילית.
  2. ג'ל-לטהר המוצרים תגובת שרשרת (PCR) פולימראז באמצעות ערכת טיהור ג'ל מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן.
  3. לבצע במבחנה תמלול באמצעות מוצר מסחרי מסוגל תעתיק של מקדם T7 לפי הפרוטוקול של היצרן.
  4. לטהר את dsRNA באמצעות ערכת טיהור RNA לפי הפרוטוקול של היצרן ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
  5. להעריך את היעילות של נוקאאוט שמס באמצעות השלבים הבאים (1.5.1-1.5.5).
    1. ספירת התאים באופן ידני באמצעות hemocytometer ותאי 5 x 105 S2 צלחת כל טוב של 6 טוב צלחת 1 מ"ל/טוב של המדיום של שניידר בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין....
    2. להוסיף 7.5 µg של EGFP- או שמס dsRNA מכל קידוח, דגירה 25 ° c במשך 24 שעות ביממה.
    3. קציר הפקד (EGFP שטופלו dsRNA) ותאים שמס שטופלו dsRNA S2 מאת pipetting עדין ואחריו pelleting למטה על ידי צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות 25 ° c ותהליך לבידוד RNA באמצעות ערכת חילוץ RNA לפי הפרוטוקול של היצרן.
    4. לכמת את הרנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים תהליך 100 ננוגרם של RNA עבור לרביעיית 1-צעד-שימוש qPCR מסחרי ריאגנטים, פריימר/רגשים והפרופיל הבאים PCR תרמי PCR: דנטורציה (95 ° C, 15 s) והסיומת Annealing / (60 ° C, 1 דקות).
      הערה: נא עיין טבלה של חומרים למידע על ערכות פריימר/בדיקה, כלי המשמש עבור ניסויים לרביעיית-PCR שמס , בקרת במחקרים אלה.
    5. לחשב את רמות ה-mRNA היחסי שמס באמצעות 2–ΔΔCT שיטת16.

2. הערכה של האיגוד בין דרגה קולטן הטרנס-ליגנדים

  1. להכין את קליטת אות תאים (S2 תאים המבטאים את הקולטן חריץ).
    1. לספור את התאים באופן ידני באמצעות hemocytometer, צלחת 5 x 105 S2 ו- S2-דרגה יציבה, בתאים מכל קידוח של צלחת. ובכן 6 ב 1 מ"ל/טוב של המדיום של שניידר בתוספת 10% FBS ו פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין....
      הערה: עבור חריץ S2 תאים, אשר הינם זמינים מן מרכז משאבים גנומיקה דרוזופילה (DGRC), הוסף 200 ננומטר מטוטרקסט בתקשורת. כדי להכין פתרון מניות של מטוטרקסט 0.5 מ מ, יש להכין תחילה פתרון מטוטרקסט 20 מ מ ב- 250 µL של 1 M NaOH. בשלב הבא, לדלל שפתרון זה 0.5 מ מ 1 מ' מאגר פוספט תמיסת מלח וחנות ב-20 ° C. בתאים חריץ S2, ביטוי של החלבון חריץ הוא תחת השליטה של האמרגן metallothionein דרוזופילה ב- pMT וקטור.
    2. להוסיף 7.5 µg של dsRNA מכל קידוח, דגירה 25 ° c במשך 24 שעות ביממה.
    3. הוסף 0.7 מ מ CuSO4 זירוז הביטוי של חריץ, דגירה 25 ° c למשך 3 ימים.
      הערה: CuSO4 משמש כדי לעודד ביטוי של חלבונים נשלט על ידי האמרגן metallothionein.
  2. להכין את התאים. שולח אות (S2 תא לבטא ליגנדים דלתא או Serrate).
    1. לספור את התאים באופן ידני באמצעות hemocytometer וצלחת ~ 5 x 106 יציב S2-דלתא או S2-מסוריתטום תאים כל טוב של צלחת. ובכן 6 ב 1 מ"ל/טוב של המדיום של שניידר בתוספת 10% FBS ו פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין....
      הערה: להוסיף 200 ננומטר מטוטרקסט עבור תאי דלתא S2 ו 100 hygromycin µg/mL עבור תאים S2-מסוריתטום בתקשורת. ביטוי של דלתא, מסוריתטום— גרסה מתויג עגבניות, פונקציונלי של מסורית12— תחת דרוזופילה יזם metallothionein ב- pMT וקטור.
    2. הוסף 0.7 מ מ CuSO4 זירוז הביטוי של ליגנדים, דגירה 25 ° c במשך 3 שעות.
  3. לבצע צבירה בין האות-לשליחה וקבלה אות תאים.
    1. הקציר S2 שטופלו dsRNA (בקרה) ותאים S2 חריץ pipetting עדין, צלחת 2.5 10x5 תאים/היטב לתוך צלחת 24-ובכן לאחר ספירה ידנית על-ידי hemocytometer.
    2. מוסיפים 5 x 105 יציב S2-דלתא S2-מסוריתטום תאים או הנפח הכולל של 200 µL בינוני של שניידר (בתוספת 10% FBS ו פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין...).
      הערה: כל התאים S2 טיפול (כולל טיפול יופיצ, אינדוקציה, dsRNA) נעשתה תחת אבטחה ארון.
    3. מניחים את הצלחת על תפקודי לב / נשימה-150 סל ד (ראד 942.48/דקה).
    4. לאחר 1 דקות, מערבבים את התוכן של כל טוב, להוציא 20 µL לספירת מספר אגרגטים.
      1. במקביל לקחת תמונה ייצוגית תחת הפוך מיקרוסקופים המתחם באמצעות הגדלה x 10 (PLL 10/0.25 המטרה).
      2. באופן ידני לספור מצרפי (> 6 תאים) באמצעות של hemocytometer.
    5. מניחים את הצלחת על מטרף.
    6. חזור על רכישת התמונה וסופר לאחר 5 דקות, 15 דקות של מצבור.
  4. לבצע כימות של טרנס-איגוד.
    1. לחשב את המספר של אגרגטים לכל mL בין S2 תאים ותאים S2-דלתא או S2-מסוריתטום כפקד רקע.
    2. לחשב את מספר אגרגטים לכל מ ל S2 חריץ בין תאים S2-דלתא או S2-מסוריתטום (סדר הגודל של טרנס-מחייב).

3.הערכה של עיכוב של האיגוד בין הרמה הטרנס-ליגנדים מאת Cis-ליגנדים

  1. להכין את קליטת אותות התאים.
    1. צלחת 5 x 10 תאים5 S2 היטב בכל צלחת. ובכן 6 ב 1 מ"ל/טוב של המדיום של שניידר בתוספת 10% FBS ו פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין....
    2. להוסיף 7.5 µg של dsRNA מכל קידוח, דגירה 25 ° c במשך 24 שעות ביממה.
    3. שיתוף transfect התאים שטופלו dsRNA עם pBluescript ו- pMT-דרגה11 (DGRC) לבד או עם חריץ pMT , pMT-דלתא11 (DGRC) או מסורית-pMT17 עבור סכום ריכוז ה-DNA של 2 µg/היטב באמצעות ריאגנט תקנים מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן.
      הערה: pBluescript משמש פקד. התאים משותפת transfected ייקרא S2 חריץ & דלתאארעי או חריץ S2 & מסורית תאיםארעי להלן.
    4. דגירה התאים S2 transiently transfected ב 25 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
    5. הוסף 0.7 מ מ CuSO4 זירוז הביטוי של הרמה, על ליגנדים, דגירה 25 ° c למשך 3 ימים.
  2. להכין את התאים. שולח אות כמתואר ב- 2.2.
  3. לבצע צבירה בין תאים. שולח אות וקליטת אות כמתואר בסעיף 2.3.
  4. לכמת עיכוב של טרנס-מחייבות לפי חבר העמים-ליגנדים.
    1. לחשב את המספר של אגרגטים לכל mL בין S2 תאים ותאים S2-דלתא או S2-מסורית כפקד רקע.
    2. לכמת את סדר הגודל של עיכוב על ידי חבר העמים-ליגנדים כדלקמן.
      1. להגדיר A כמו מספר של אגרגטים בין חריץ S2ארעי ותאים S2-דלתא.
      2. הגדר B כמו מספר של אגרגטים בין תאים S2 transiently משותפת transfected עם חריץ ודלתא (S2-חריץ & דלתאארעי) ותאים S2-דלתא.
      3. חישוב צבירה היחסי C = (B x 100) /A
      4. לחשב את סדר הגודל של עיכוב על ידי חבר העמים- ליגנד (דלתא או Serrate) כמו 100 – C.
        הערה: בתור דוגמה, אם צבירת היחסי הוא 45%, אז חבר העמים-ליגנדים נחשבים כדי לעכב את טרנס-מחייב ב- 55%.

תוצאות

התצפיות ויוו הציע כי אובדן של ג'ין xylosyltransferase שמס התוצאות ברווח של חריץ איתות בשל מוגבר בתיווך דלתא הטרנס-הפעלה של חריץ מבלי להשפיע על cis-עיכוב של חריץ על ידי ליגנדים8. כדי לבדוק את הרעיון הזה, במבחנה תא צבירת מבחני בוצעו. ראשית, הביטוי

Discussion

איתות חריץ הקנוני תלוי האינטראקציות בין הקולטן החריץ שלה ליגנדים5. אמנם רוב המחקרים על השביל חריץ לשקול בעיקר הכריכה של חריץ, ליגנדים בתאים הסמוכים (טרנס), דרגה, לאותו תא ליגנדים אינטראקציה, ואת אלה כביכול cis-האינטראקציות יכולים לשחק תפקיד מעכבות בחריץ איתות

Disclosures

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

המחברים לאשר תמיכה NIH/NIGMS (R01GM084135 כדי HJN), מיזוטני Glycoscience (מענק #110071 HJN), שיטות מודה טום (פ') לי על דיונים והצעות מבחני, והיסוד ספירו Artavanis-Tsakonas, הוגו Bellen, רוברט פלמינג, קן אירווין, את דרוזופילה גנומיקה משאב מרכז (DGRC) פלסמידים וקווים התא.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, ModifiedLonza04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solutionGE Healthcare lifescience SV30010
CELLSTAR 6 well plateGreiner Bio-One657 160
CELLSTAR 24 well plateGreiner Bio-One662160
VWR mini shakerMarshell Sceintific12520-956
HemocytometerFisher Sceintific 267110
FuGENE HD Transfection ReagentPromegaE2311
MEGAscrip T7 Transcription KitAmbionAM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)Zymo ResearchR1054
VistaVision Inverted microscopeVWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced SoftwareAmScopeMU-900Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction KitInvitrogenK210012
Fetal Bovine SerumGenDepotF0600-050
MethotrexateSigma-AldrichA6770-10
Hygromycin BInvitrogenHY068-L6
Copper sulphateMacron Fine Chemicals4448-02
S2 cellsInvitrogenR69007
S2-SerrateTom cellsGift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cellsDGRC152
S2-Notch cellsDGRC154
pMT-Delta vectorDGRC1021Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vectorGift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vectorDGRC1022Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFPGift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step KitApplied Biosystem1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)Applied BiosystemDm02144576_g1 with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)Applied BiosystemDm02151827_g1with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR systemApplied Biosystem435140596-well Block module

References

  1. de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
  2. Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
  3. del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
  4. Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
  5. Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
  6. Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
  7. Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).
  8. Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).
  9. Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
  10. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
  11. Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
  12. Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
  13. Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
  14. Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
  15. Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  17. Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
  18. Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
  19. Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
  20. Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131S2cis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved