腹膜源性肥大细胞的分离及其功能特征的 Ca2 +成像和脱粒测定

摘要

在这里, 我们提出了一个隔离和培养小鼠腹膜肥大细胞的协议。我们还描述了两个协议的功能表征: 一个荧光成像的细胞内游离 Ca^{2 +}浓度和脱粒检测的基础上的色度量化的释放β-hexosaminidase。

摘要

肥大细胞 (MCs) 作为免疫系统的一部分, 在保护宿主抵抗几种病原体和引发过敏性免疫应答方面起着关键作用。通过将表面 IgE 与高亲和 IgE 受体 (FcεRI) 的交联, 以及通过其他几种受体的刺激, 激活 MCs, 启动了游离胞内 Ca^{2 +}级 ([Ca^{2 +}]_i) 的上升。这促进了炎症和过敏介质的释放。这些信号通路中所涉及的分子成分的识别对于理解 MC 函数的调节是至关重要的。本文介绍了一种通过腹腔灌洗和腹腔 MCs 培养分离小鼠结缔组织型 mcs 的协议。采用这种方法对各种击倒小鼠模型的 MCs 进行培养, 是鉴别 MC 信号通路所涉及蛋白质的一种有用方法。此外, 我们还描述了一个单细胞 Fura-2 成像协议, 作为一个重要的技术, 以量化的 Ca^{2 +}信号在 MCs. 基于荧光的监测 [ca^{2 +}]_我是一个可靠和常用的方法来研究 Ca^{2 +}信号事件, 包括存储操作的钙进入, 这是至关重要的 MC 激活。对于 MC 脱粒的分析, 我们描述了β hexosaminidase 释放试验。将β-hexosaminidase 释放到培养基中的量被认为是 MCs 中描述的所有三种不同分泌亚群的脱粒标记. β-hexosaminidase 可以很容易地被量化的反应与 colorigenic 基板在微量滴定板比色法。这种高度可重复的技术具有成本效益, 不需要专门的设备。总体而言, 所提供的协议表明了一个高产量的 mcs 表达典型的 MC 表面标记, 显示典型的形态和表型特征的 mcs, 并表明高重现性反应 secretagogues 在 Ca^{2 +}-影像学和脱粒化验。

引言

MCs 在先天和后天免疫应答中起着突出的作用。具体地说, MCs 参与杀害病原体, 如细菌和寄生虫, 并降低潜在的有毒内源性肽或毒液成分 (审查见加利等2008¹)。MCs 在先天和适应性免疫中的生理作用是激烈争论的主题。因此, 在不同的 MC 缺陷小鼠模型的研究中, 大量的数据差异需要对²过敏后的 MCs 免疫功能进行系统的重新评估。成熟的 MCs 大多是局部的组织和器官, 如皮肤, 肺和肠道, 通常只在少量的血液中发现。MCs 来源于造血前体, 如 MC 祖细胞, 在几乎所有血管化组织的微环境中完成它们的分化和成熟¹。T 细胞衍生因子白细胞介素 (IL)-3 有选择地促进小鼠 MCs 的多能种群的生存能力, 增殖和分化从他们的造血祖父母³。干细胞因子 (超临界) 是由组织中的结构细胞产生的, 在 MC 的发展、生存、迁移和功能⁴中起着至关重要的作用。单个 MCs 的性质可能因其合成和贮存各种蛋白酶或软骨的能力而异。在小鼠中, 根据肝素和蛋白酶⁵的解剖定位、形态学和含量, 将所谓的结缔组织型 mcs 与黏膜 mcs 区别开来。

在 MCs 中, 增加游离胞浆 Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_i) 是脱粒和生产 eicosanoids, 以及细胞因子的合成和转录因子的活化反应的抗原和各种 secretagogues⁶。这些刺激的主要下游目标是磷脂酶 C, 水解磷酸肌醇 45-bisphosphate 到甘油 (达格·哈马舍尔德) 和肌醇 14, 5-trisphosphate。IP3 激活蛋白激酶 C, 并从内质网中释放出钙^{2 +}的离子。这些商店的枯竭激活了 ca^{2 +}通过等离子膜 ca^{2 +}通道流入, 导致储存操作钙进入 (SOCE)。这一过程是通过与 Ca^{2 +}传感器, 基质相互作用 molecule-1 (Stim1) 的互动, 在内质网与 Orai1⁷以及通过活化的瞬态受体电位规范 (TRPC) 通道蛋白质 (复习见 Freichel等。2014⁸) 在血浆膜。

为了研究这些通道的生理作用, 通常使用几种药理学 (通道阻滞剂的应用) 或遗传方法。在后一种情况下, 抑制蛋白质表达是通过靶向 mRNA (击倒) 或基因组 DNA 编辑与全球或组织特定的⁹删除一个外显子编码一个孔形成亚单位的通道 (挖空)。对这些通道有足够特异性的拦截剂的供应是有限的。此外, 被击倒的方法需要仔细控制它的有效性使用, e., 西方污点分析, 并由于缺乏特定的抗体为靶向的渠道蛋白在许多情况下。因此, 剔除鼠标模型的使用仍然被认为是这种分析的黄金标准。对 MC 功能进行调查的一种优选的体外模型是培养可被隔离为完全成熟的种群 (相对于体外, e., 骨髓细胞的不同的 MCs)¹⁰.与骨髓源性 MCs (BMMCs) 相比, 它也通常用于研究 MC 功能的体外, FcεRI 和β hexosaminidase 释放的刺激分别增加8倍和100倍。在本文中, 我们描述了一种分离和培养小鼠的方法, 它允许在2周后获得大量的纯结缔组织类型的 MCs, 足以进一步分析。

尽管最近在开发和应用基因编码钙指标方面取得了进展, 但它们的使用仍受限于向目标细胞提供基因的困难, 特别是在诸如初级培养的 MCs 等高度专门化的细胞中。此外, 这组荧光指示器为 [^{2 +}]_i测量仍然缺乏比例染料以一个高动态范围。因此, 比例 [Ca^{2 +}]_i测量的首选方法仍然是使用荧光染料 "Fura-2"¹¹。

目前, 对 MC 活化和脱粒的评价最常用的方法是β-hexosaminidase 活性的测量。β-hexosaminidase, 过敏性调解人, 是 MC 颗粒成分之一, 与组胺的联合释放, 从 MCs¹²的恒定比例。β-hexosaminidase 可以通过其与特定基质的反应而容易而准确地测量, 从而产生可测量的 colorigenic 产品的数量, 在微板块比色法中很容易检测到。本文介绍了该技术在脱粒分析中对各种刺激反应的应用。

高亲和 plasmalemmal IgE 受体 (FcɛRI) 的聚集在 MCs 中激活一个多功能的细胞内信号通路, 导致分泌颗粒含量在周围细胞外空间释放。除了特定的抗原, 许多其他刺激可以激活 MCs 释放多种免疫调节介质, 如补充 anaphylatoxins (e., C3a 和 C5a)¹³, 收缩肽内皮素 1 (ET1)¹⁴, 以及许多阳离子物质和药物引起的 pseudoallergic 反应 (e., icatibant)¹⁵通过绑定到 MRGPRX2¹⁶。MRGPR 诱导的 MCs 脱粒细胞内信号通路与 FcɛRI 介导的细胞内信号传递的特征相比较差;这些途径只开始密集地被研究在最近几年¹⁷在受体识别¹⁶以后。在很大程度上, 涉及钙进入 MRGPRX2 刺激的等离子膜离子通道仍有待了解。因此, 本文还重点研究了 MRGPR 激动剂刺激的 MCs 细胞内钙信号和脱粒。

研究方案

所有动物规程根据德国立法指南被执行了对实验室动物的关心和用途 (正式地批准由卡尔斯鲁厄区域理事会)。

1. 经腹腔灌洗的 PMC 分离和培养

1	冰
2	10毫升注射器
3	27克针
4	20克针
5	泡沫塑料块和别针
6	收集管 (50 毫升塑料离心管)
7	70% 乙醇
8	RPMI 介质 (预冷和保持在冰上)
9	PMC 培养基: RPMI 中等 + 20% FCS (胎小牛血清) + 1% 青霉素链霉素溶液 (笔链球菌)
10	Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 DPBS (没有钙2 +和镁2 +)
11	培养烧瓶 (25 厘米)
12	生长因子库存解决方案 (IL-3: 1 微克/ul;超临界: 2.5 微克/毫升)
13	血清吸管 (10 毫升)
14	吸管提示无菌 (20–200µL)
15	Hemocytometer
16	台式离心机
17	剪刀和镊子
18	联合2小鼠室
19	开放式无菌罩
20	封闭式无菌罩
21	细胞孵化器 (37 °c 和 5% CO2)
22	转移吸管 (20–200µL)

表 1: 步骤1的材料。

1. 腹腔灌洗分离 PMC
   1. 在细胞隔离之前, 准备表 1中列出的材料。
   2. 用8到14周大的雄性小鼠进行 PMC 隔离。弄死一只老鼠, 共₂吸入, 并确认死亡的反射损失。用70% 乙醇喷雾鼠标, 用别针 (背侧向下) 将其固定在泡沫块上。使用钝刃剪刀去除鼠标的腹侧皮肤。避免损害腹膜腔。
      注意: 我们通常使用这个协议为 C57BL/6N 菌株遗传背景的小鼠。
   3. 使用装有27克针的10毫升注射器, 在腹膜腔中注入7毫升的冰冷 RPMI 培养基和5毫升的空气。在腹膜中小心地推针, 不要穿孔任何器官。使用在附睾脂肪区域的斑点, 以减少器官穿孔的风险。
   4. 注射后, 摇动鼠标1分钟, 将腹膜细胞分离到 RPMI 培养基中。不要太强烈地摇动鼠标, 避免损害内脏, 并用血液污染腹膜腔。
   5. 用新的20克套管将10毫升注射器重新使用。将内脏转移到一侧, 通过倾斜泡沫块, 轻轻地拍打在长凳上, 使中吸更容易从另一侧。插入20克针, 斜角向上, 并从腹部轻轻地和缓慢地吸入液体 (~ 0.5 毫升/秒), 以避免内脏堵塞。收集尽可能多的液体 (通常5–6毫升)。
   6. 从注射器中取出针头, 将收集到的细胞悬浮液转移到冰上的收集管中。如果有明显的血液污染, 就丢弃样品管。
   7. 离心管与细胞悬浮在 ~ 300 x g 5 分钟。在无菌罩下吸上清。对于每只老鼠, 将样品丸组合在4毫升的冷 (4–10°c) PMC 培养基中, 将细胞悬浮液转移到25厘米²培养瓶中。将生长因子 IL-3 和超临界增加到最终浓度 10 ng/毫升和 30 ng/毫升分别。将含有细胞的烧瓶放在孵化器中 (37 摄氏度和 5% CO₂), 并孵化为 ~ 48 小时直到下一个过程。
2. PMC 文化
   1. 2天 (隔离后48小时): 中等变化
      1. 要去除上清和非黏附细胞 (红细胞和死细胞), 通过放置一个巴斯德吸管尖端在烧瓶的边缘, 并保持瓶几乎水平, 从烧瓶中吸入培养基。每只鼠标添加4毫升预预热的 PMC 介质。添加生长因子 IL-3 (10 ng/毫升) 和超临界 (30 ng/毫升)。将含有细胞的烧瓶放在孵化器中 (37 摄氏度和 5% CO₂)。
   2. 天 9: 细胞分裂
      1. 将细胞悬浮液从细胞培养瓶中转移到50毫升的塑料离心管中。用10毫升预热 (37 °c) Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 清洗烧瓶三次, 用同50毫升塑料离心管中的分离细胞收集细胞悬浮液。用 hemocytometer 计数细胞浓度, 计算细胞总数。
      2. 离心细胞悬浮在 ~ 300 x g 5 分钟, 并吸入上清。恢复预预热的 PMC 培养基 (37 °c) 的颗粒, 以获得细胞浓度 1 x 10⁶细胞/毫升。将细胞悬浮液转移到新的25厘米²培养瓶中。将旧烧瓶与成纤维细胞附着在底部。
      3. 添加生长因子 IL-3 (10 ng/毫升) 和超临界 (30 ng/毫升), 并放置含有细胞在孵化器 (37 °c 和 5% CO₂) 的烧瓶。
   3. 天 12–15: 细胞测量
      1. 如果有任何刺激 FcɛRI 受体的实验计划, 在标准培养基中, 用300毫升的 IgE 抗预处理细胞过夜。继续执行步骤2或步骤3。

2. 临时市政局荧光细胞内游离钙浓度测定

1. 在测量之前, 准备表 2中列出的材料。此外, 准备一个成像设置包括: 倒置荧光显微镜;目的:40 x/1.3 油;Fura 2 过滤器集;CCD 摄像机;励磁光源;图像采集程序;重力馈液应用系统。

1	PMC (12–15天) 1 x 106细胞/毫升
2	刀豆蛋白 A
3	Fura-2 是
4	Pluronic F-127 20% 解决方案
5	盖滑眼镜轮;ø25毫米;1号
6	dinitrophenol-人血清白蛋白) 库存溶液
7	抗扩散抗体 (IgE) 库存解决方案
8	平底板 (12 井)
9	复合48/80 库存解决方案
10	覆盖井成像室
11	Hemocytometer
12	转移吸管 (20–200µL)

表 2: 步骤2的材料。

2. Fura-2 成像准备
   1. 使用 hemocytometer 执行细胞计数, 并将细胞浓度调整为 1 x 10⁶细胞/毫升。用1毫升的吸管尖轻轻吹打 (3–5倍) 分裂两局殖民地。
   2. 准备一个 ca^{2 +}含 HEPES 缓冲盐溶液 (ca^{2 +}HBSS) 由135毫米氯化钠, 6 毫米氯化钾, 2 毫米 CaCl₂, 1.2 毫米氯化镁₂, 10 毫米 HEPES 和12毫米葡萄糖组成。用3米氢氧化钠将 pH 值调整为7.4。
   3. 在无菌罩下, 在每25毫米圆盖玻璃上吹打1滴刀豆蛋白溶液 (0.1 毫克/毫升), 准备刀豆蛋白涂覆的幻灯片。把水滴放在盖子上至少1分钟, 然后用吸管除去大部分溶液, 让盖子滑干45分钟. 仔细按刀豆蛋白在橡胶成像室上处理过的盖子滑 (见材料表), 直到他们附上获得显微镜成像室。
      注: 聚 l-赖氨酸涂层可作为替代品使用。
   4. 将荧光钙^{2 +}染料 Fura-2 AM (1 毫米) 溶于二甲基亚砜 (亚砜)。存储此解决方案免受光照的侵害。
   5. 稀释 Fura-2 在 Ca^{2 +}HBSS 的库存解决方案, 最终浓度为5µM, 以准备 "加载缓冲区"。补充5µL/毫升 20% pluronic F-127 在亚砜。
   6. 混合500µL 的 "加载缓冲区" 与500µL 的 PMC 细胞悬浮。将混合物注入成像室, 在黑暗中在室温下孵化细胞20–30分钟。
   7. 根据激励协议, 建立具有不同解决方案的重力馈电应用系统。补充注射器1与40毫升的 ca^{2 +}HBSS 解决方案, 注射器2与40毫升的 ca^{2 +}-HBSS 解决方案, 其中包含 100 ng/毫升, 注射器3与40毫升的 Ca^{2 +}-HBSS 解决方案包含50µg/毫升化合物 48/80, 注射器4与40毫升的名义上 ca^{2 +}自由 HBSS 解决方案, 和注射器5与40毫升名义上 ca^{2 +}自由 HBSS 解决方案, 其中包含2µM Thapsigargin。
   8. 准备一个40X 高孔径油浸泡目标, 放置一小滴浸入油。
   9. 在倒置显微镜的舞台上安装应用系统。将成像室与加载的单元格放在应用系统中, 并确保其安全以防止录制过程中的移动。打开传送的光并聚焦细胞。
   10. 使用重力馈的应用系统, 用 Ca^{2 +}HBSS 缓冲器冲洗细胞三次。
   11. 将 Ca^{2 +}-HBSS 中的细胞孵化为5分钟, Fura-2 的酯化反应。
   12. 在开始成像之前再冲洗一次细胞, 清除任何可能泄漏的荧光染料。
3. 细胞成像
   1. 在生理采集模式下启动图像采集程序。打开设置窗口, 并调整焦点和最佳捕获时间 (这应该是相同的励磁与340毫微米和380毫微米和通常范围之间 50–150 ms)。
      注: 尽量减少 Fura-2 加载单元的曝光量, 以避免染料漂白。
   2. 对引用图片进行图像处理, 并将单元格标记为感兴趣的区域 (ROI)。在不存在单元格的区域中标记最后的 ROI, 并将其定义为背景。
   3. 完成安装, 并开始测量的 5 s 的购置率。
      注: 细胞将交替照明与激发光340毫微米和 380 nm, 并发射荧光 (> 510 nm) 将收集使用 CCD 相机。荧光信号 F340 纳米和 F380 nm 的图像以及比值 (F340 nm/F380 nm) 将显示在三窗口中。个体 ROIs 荧光强度平均值的时间过程图也将持续显示。
   4. 根据实验设计, 在适当的周期编号中添加解决方案:
      1. 为了测量抗原诱导海拔的 [Ca^{2 +}]_i, 如图 2A, 2B, 在循环20后应用注射器2解决方案, 并停止记录后, 周期150。
      2. 要测量 [Ca^{2 +}]_i的复合48/80 诱导海拔, 如图 2C所示, 在循环20后应用注射器3解决方案, 并在周期150之后停止录制。
      3. 要测量由 SOCE 诱发的 [Ca^{2 +}] 的海拔, 如图 2D所示, 在循环10后应用注射器4溶液, 在循环5后应用注射器70溶液, 在循环4后应用注射器120溶液,在循环150后应用注射器1解决方案, 并在220周期后停止录制。
   5. 完成测量后, 将结果转换为包含和不带背景校正的励磁波长的测量强度的比值表, 以及每个 ROI 的比率值和没有背景校正的比值。和每个测量时间点。在采集程序中, 依次按下按钮: "启动刀"、"全部标记"、"全部转换"、"生理学测量"、"确定"、"确定"。将文件保存为表和图像堆栈以进行离线分析。

3. hexosaminidase 释放量的测试

1	PMC (12–15天) 1 x 106细胞/毫升
2	抗扩散抗体 (IgE) 库存解决方案
3	白蛋白库存解决方案
4	复合48/80 库存解决方案
5	Ionomycin
6	96-井板, v 形底部
7	96-井板, 平底
8	塑料离心管 (15 毫升)
9	血清吸管
10	细胞孵化器 (37 °c 和 5% CO2)
11	台式离心机
12	用于光学密度测量的微量滴定板读取器
13	多通道吸管 (20–200 ul)
14	Hemocytometer

表 3: 步骤3的材料。

1. 在测量之前, 准备表 3中列出的材料。
   注: β-hexosaminidase 释放从 MCs 后, 他们的刺激水解对硝基苯基-乙酰氨基葡萄糖 (pNAG) 成对硝基酚和 n-乙酰氨基葡萄糖。样品中β-hexosaminidase 的数量与将形成的对硝基酚的数量成正比。在 "停止溶液" 的高 pH 环境下, 对硝基酚作为完全 deprotonated 的 nitrophenolat 存在, 可通过其光吸收率在 405 nm 上检测到。
2. 准备 Tyrode 的溶液, 含130毫米氯化钠, 5 毫米氯化钾, 1.4 毫米 CaCl₂, 1 毫米氯化镁₂, 10 毫米 HEPES, 5.6 毫米葡萄糖和 BSA 0.1%。用3米氢氧化钠将 pH 值调整为7.4。
3. 在 Tyrode 的溶液中加入1% 体积的海卫 X-100 来制备裂解液。
4. 制备由 200 mM 甘氨酸组成的止水溶液, 并用氢氧化钠调整 pH 值为10.7。
5. pNAG 溶液 (4-硝基苯基 2-acetamido 2-脱氧β D-glucopyranoside) 溶液通过溶解 pNAG 在 0.4 M 柠檬酸到最后浓度4毫米。
6. 计算化验所需的细胞量 (重复执行化验)。每井使用20万个临时市政局。使用2口井作为负控制 (Tyrode 的解决方案, 如 secretagogues 或复合 48/80) 和2井作为正控制 (Tyrode 的解决与10µM Ionomycin) 为每个基因型。
7. 将这些细胞转换成15毫升的塑料离心管, 用 Tyrode 的溶液调整体积到15毫升, 离心机在 200 x g处进行4分钟. 用巴斯德吸管取出上清液, 并并用重悬 Tyrode 溶液中的细胞为 2 x 10⁶细胞毫升.
8. 将细胞悬浮液的100µL 转移到一个96井的 V 型井底井板上。将刺激或控制解决方案的25µL 添加到每个井中 (根据图 3A所示的吹打方案)。孵化细胞45分钟在37°c 和 5% CO₂。
9. 把96井板放在冰上5分钟, 停止反应。然后, 离心板在4°c 为4分钟在 120 x g。用多通道吸管将上清的120µL 转移到平底96井板上, 放在冰上。小心避免接触细胞小球, 但完全吸入上清。
10. 将125µL 的溶解缓冲液添加到细胞颗粒中。在室温下孵化细胞颗粒5分钟, 并在孵化后并用重悬, 重复吹打 (约5次)。
11. 吸管25µL 的 pNAG 溶液 (4 毫米) 在所需的井中的一个新的平底96井板。添加25µL 从每个上清到准备好的 pNAG 溶液以及每个细胞裂解液的25µL。
12. 在37摄氏度孵育1小时的反应批次。孵化后, 吸管150µL 的停止溶液, 使各井停止反应。
13. 使用 405 nm 的双波长设置与参考 630 nm 进行自动背景减法分析, 微板块读取器。在采集程序中, 勾选框 "参考", 并在 "吸光度" 程序元素菜单中, 从下拉列表中选择 "630 nm"。如果样品的光学密度太高, 在 remeasuring 之前准备适当稀释探针。
14. 根据以下公式计算β hexosaminidase 释放的百分比:
    
    如果释放 [%] 是特定β-hexosaminidase 释放的百分比, [上清] 是对上清的背景校正吸收, 而 [裂解] 是对相应细胞裂解的背景校正吸收。

结果

在无菌湿润条件下, 经腹腔灌洗并进一步培养 RPMI 培养基中的3种野生小鼠 (C57BL/6N), 在生长因子 (IL-3 10 ng/毫升和 30 ng/毫升) 的情况下, 对其进行了进一步养殖。37°c 和 5% CO₂。媒介在天2和9被改变了在细胞隔离以后。用透射光 DIC 成像 (见图 1A, B) 对细胞形态学进行分析。细胞的对比度和粒度表现出良好的细胞活力。在这些条件下培?...

讨论

mc 模型可以成功地用于研究 mc 脱粒, 趋化性, 黏附性, 以及阐明细胞内信号传导通路参与 mc 激活。一些研究人员使用人体 mcs 模型, 如永生化的线 (LAD2 和 HMC1) 或由脐血祖细胞 (CD133+) 和外周血祖细胞 (CD34+) 所衍生的人 mcs。其他人更喜欢啮齿动物 MC 模型, 如永生化 (大鼠嗜碱性颗粒白血病 RBL-2H3 MC 线) 或初级培养 (小鼠骨髓源性 MCs BMMCs, 局) 模型。小鼠原发性 MCs 可用于分析多种 "敲出" 老鼠模型中的 MC ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI Medium	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
Anti-DNP-Antibody	Sigma-Aldrich	D-8406
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
Compound 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	X100
4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell Imaging Chamber	Sigma-Aldrich	GBL635051
96-Well plate, v-shaped bottom	Corning	3896
96-Well plates, flat bottom	Greiner Bio-One	655180
Microtiter plate reader with "i-control" software	Tecan	Nano Quant, infinite M200 Pro
Flat bottom plate	Greiner Bio-One	655180
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62.547.254
Culture Flasks (25 cm)	Greiner Bio-One	69160
Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1	Menzel	CB00250RA1
Hemocytometer	VWR	631-0696
Inverted Microscope	Zeiss	Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil	Zeiss	440260-9900
HC Filter Set Fura 2	AHF	H76-521
CCD Camera	Zeiss	AxioCam MRm
Monochromatic Light Source	Sutter Instruments	Lambda DG-4
Imaging Acquisition Program	Zeiss	AxioVision 4.8.2
Gravity fed solution application system	Custom Made	4-channel
15 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62,554,502
Bench Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.0R