복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

요약

여기, 우리는 격리 하 고 murine 복 막 돛대 세포 배양 프로토콜을 제시. 우리는 또한 그들의 기능 특성에 대 한 두 개의 프로토콜 설명: 출시 된 β-hexosaminidase의 색도계 정량화를 기반으로 하는 무료 세포내 캘리포니아^{2 +} 농도와 degranulation 분석 결과 형광 영상.

초록

돛대 세포 (MCs), 면역 체계의 일환으로 여러 병원 균에 대 한 호스트를 방어 하 고 알레르기 면역 반응의 개시에 중요 한 역할을 재생 합니다. IgE 바인딩된 높은 선호도 IgE 수용 체 (FcεRI), 뿐만 아니라 다른 여러 가지 수용 체의 자극 표면의 cross-linking를 통해 MCs의 활성화 시작 무료 세포내 캘리포니아^{2 +} 레벨의 상승 ([캘리포니아^{2 +}]_난) 그는 염증 및 알레르기 중재자의 출시를 촉진합니다. 분자 성분이 신호 경로에 관련 된 식별은 엠씨 기능의 규칙을 이해 하는 데 중요 합니다. 이 문서에서는, 우리는 murine 결합 조직 유형 복 막 게 하 여 MCs의 고립과 복 MCs (PMCs)의 재배에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법론에 의해 다양 한 녹아웃 마우스 모델에서 MCs의 문화 MC 신호 경로에 관련 된 단백질의 식별에 유용한 접근 방식을 나타냅니다. 또한, 우리 또한 단일 셀 Fura-2는 신뢰할 수 있는 Ca^{2 +} MCs. 형광 기반 모니터링 [캘리포니아^{2 +}]_내가 신호의 정량화에 대 한 중요 한 기술으로 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 일반적으로 사용 하는 접근 캘리포니아^{2 +} 신호 이벤트, MC 활성화에 대 한 최대 중요성 이다 칼슘 저장소 운영 항목을 포함 하 여 공부 합니다. MC degranulation의 분석에 대 한 β-hexosaminidase 자료 분석 결과 설명합니다. 모든 3 개의 다른 분 비 하위 집합에 대해 MCs. β-hexosaminidase에서 설명한 degranulation 마커 colorigenic 기판에와 그것의 반응에 의해 쉽게 정해질 수 β-hexosaminidase 문화 매체에 발표의 양을 간주 됩니다 한 결정 플레이트 색도계 분석 이 높은 재현 기술은 비용 효율적인 고 특수 장비를 요구 한다. 전반적으로, 제공 된 프로토콜 높은 수확량을 보여줍니다 일반적인 MC 표면 마커를 표현 하는 MCs의 MCs의 일반적인 형태학 및 phenotypic 기능을 표시 하 고 캘리포니아^{2 +}-secretagogues에 대 한 높은 재현성 응답 시연 이미징 및 degranulation 분석 실험입니다.

서문

MCs 타고 난과 획득 면역 반응 동안에 저명한 역할을 한다. 특히, MCs 병원 균, 기생충, 박테리아 등의 살해에 참여 하 고 또한 잠재적으로 유독한 내 인 성 펩 티 드 또는 구성 요소 (검토 Galli 외. 2008¹참조)에 대 한 venoms의 저하. 타고 난 및 적응형 면역에 MCs의 생리 적 역할 열띤된 논쟁의 주제 이다. 따라서, 다른 MC 불충분 한 마우스 모델을 사용 하 여 수행 하는 연구에서 수많은 데이터 불일치 알레르기²넘어 MCs의 면역 기능의 체계적인 재평가 필요 합니다. 성숙한 MCs 조직 및 피부, 폐, 창 자, 등 장기에 지역화 주로 고 있다 일반적으로 혈액에 작은 숫자에만. MCs MC 창시자, 등 조 혈 선구자에서 파생 하 고 그들의 차별화 및 거의 모든 vascularized 조직¹는 microenvironments에서 성숙. 선택적으로 T-세포 파생 요소 인터 루 킨 (IL)-3에 그들의 조 혈 창시자³에서 생존, 확산, 그리고 마우스 MCs의 만능 인구의 승진 시킨다. 줄기 세포 요소 (SCF) 구조 세포 조직에 의해 생산 되 고 MC 개발, 생존, 마이그레이션, 및 기능⁴에서 중요 한 역할. 개별 MCs의 속성은 그들의 능력을 합성 하 고 다양 한 프로 테아 제 또는 proteoglycans 저장에 따라 달라질 수 있습니다. 마우스에 소위 결합 조직 형 MCs는 그들의 해부학 지역화, 형태학, 헤 파 린 및 프로 테아 제⁵의 내용에 따라 점 막 MCs에서 구별 된다.

MCs의 증가 무료 cytosolic 캘리포니아^{2 +} ([캘리포니아^{2 +}]_난)은 필수 degranulation 및 eicosanoids의 생산을 위한 뿐만 아니라 cytokines의 합성과 항 원에 대 한 응답에서 녹음 방송 요인의 활성화 및 다양 한 secretagogues⁶. 이러한 자극의 주요 다운스트림 목표 hydrolyzes diacylglycerol (DAG) 및 이노 시 톨 1,4,5-trisphosphate phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate phospholipase C, 이다. DAG는 단백질 키 니 아 제 C를 활성화 하 고 IP3 바인딩과 그물에서 캘리포니아^{2 +} 이온을 출시 하였습니다. 이러한 저장소의 고갈 캘리포니아^{2 +} 원형질 막 캘리포니아^{2 +} 채널, 저장 운영된 칼슘 항목 (SOCE)로 이어지는 통해 유입을 활성화 합니다. 이 과정은 캘리포니아^{2 +}의 상호 작용을 통해 되 살려-센서, stromal 상호 작용 분자-1 (Stim1), Orai1⁷ 뿐만 아니라 일시적인 수용 체 잠재력 정식 (TRPC) 채널의 활성화를 통해 떠다니고 그물에 (자세한 리뷰 참조 Freichel 그 외 여러분 단백질 2014⁸) 원형질 막에.

공부 하는 여러 약물이 채널의 생리 적인 역할 (채널 차단제의 응용 프로그램) 또는 유전 접근 일반적으로 사용 됩니다. 후자의 경우, 단백질 발현의 억제 mRNA (최저)를 대상으로 하 여 이루어집니다 또는 genomic DNA 코딩 기 공 채널 (녹아웃)의 소 단위를 형성 하는 exon의 전역 또는 조직 관련⁹ 삭제 편집. 이 채널에 대 한 충분 한 특이성으로 차단기의 가용성은 제한 됩니다. 또한, 최저 접근 필요, 예를 사용 하 여 그 유효성의 주의 제어., 서쪽 오 점 분석, 그리고 많은 경우에 대상된 채널 단백질을 위한 특정 항 체의 불가능에 의해 방해 된다. 따라서, 녹아웃 마우스 모델의 사용은 여전히 이러한 분석에 대 한 황금 표준으로 간주 됩니다. 엠씨 기능 조사에 대 한 선호 체 외에 모델은 격리 된 비보 전 완전히 성숙한 인구로 서 수 있는 PMCs의 재배 (에서 예를 들어 생체 외에서 MCs 차별 반대., 골 수 세포)¹⁰ . 골 수 파생 된 MCs (BMMCs), 또한 일반적으로 엠씨 기능에서 생체 외에서FcεRI와 베타-hexosaminidase 자극을 공부 하는 데 사용 되는 비교 릴리스는 8-fold 고 약에 증가 PMCs, 각각. 이 문서에서는, 우리 격리 하는 방법 및 재배 murine PMCs의 2 주 높은 수가 순수 결합 조직 배양의 MCs, 추가 분석에 대 한 충분 한 입력을 얻을 수 있는 설명 합니다.

개발 및 인코딩된 유전자 칼슘 표시기의 응용 프로그램에서 최근 진행에도 불구 하 고 그들의 사용은 여전히 제한 대상 세포에 유전자의 납품에 어려움에 의해 특히, 기본 교양된 MCs 같은 고도로 전문화 된 세포에서. 또한, 형광 지표 측정을 위해 [캘리포니아^{2 +}]_나 의이 그룹은 아직 높은 동적 범위와 비율 염료가 없다. 이러한 이유로, 비율 [캘리포니아^{2 +}]_나 측정에 대 한 선호 하는 방법 아직도 형광 염료 "Fura-2"¹¹의 사용 이다.

현재, 가장 일반적으로 사용 되는 접근 MC 활성화의 평가 degranulation β-hexosaminidase 활동의 측정 이다. Β-hexosaminidase, 알레르기 중재자, MCs¹²에서 일정 비율에 히 스타 민을 공동 출시는 MC과 립 구성 요소 중 하나입니다. Β-hexosaminidase 쉽게 그리고 정확 하 게 측정할 수 microplate 색도계 분석 실험에서 쉽게 감지 colorigenic 제품의 측정 수량을 생산 하는 특정 기질과의 반응을 통해. 이 문서에서는, PMCs degranulation 다양 한 자극에 대 한 응답에서의 분석에 대 한이 기술의 응용 프로그램이 보고 됩니다.

높은 선호도 plasmalemmal IgE 수용 체 (FcɛRI)의 집계 MCs에 주변 세포 외 공간에 분 비과 립 콘텐츠 출시로 이어지는 다양 한 세포내 신호 전달 경로 활성화 합니다. 특정 항 원 뿐만 아니라 다른 많은 자극 immunomodulatory 중재자, 보완 anaphylatoxins 등의 다양 한 배열을 풀어 MCs를 활성화할 수 있습니다 (예., C3a와 C5a)¹³, vasoconstrictor 펩 티 드 endothelin 1 (ET1)¹⁴ , 잘 수많은 양이온 물질 및 pseudoallergic 반응을 자극 하는 약물 (예., icatibant) MRGPRX2¹⁶에 바인딩하여¹⁵ . MRGPR 유도 MCs degranulation에 관련 된 세포내 신호 통로 저조한 FcɛRI 중재 세포내 신호; 비교 특징 이러한 경로 단지 수용 체 식별¹⁶후¹⁷ 지난 몇 년 동안 집중적으로 공부를 시작 했다. 크게, 원형질 막 이온 채널 칼슘 항목 뒤에 MRGPRX2 자극에에서 관련 된 이해 남아 있다. 따라서, 현재 문서는 또한 세포내 칼슘 신호에 초점을 맞추고 및 MCs의 degranulation MRGPR 촉진제와 자극.

프로토콜

모든 동물 절차 관리 및 실험실 동물 (카를스루에 지역 위원회에 의해 승인)의 사용에 대 한 독일 입법 지침에 따라 수행 했다.

1. PMC 고립과 재배 복 게에 의해

1	얼음
2	10 mL 주사기
3	27 G 바늘
4	20 G 바늘
5	스티로폼 블록 및 핀
6	컬렉션 튜브 (50ml 플라스틱 원심 관)
7	70% 에탄올
8	RPMI 매체 (냉장 하 고 얼음에 보관 중)
9	PMC 매체: RPMI 매체 + 20 %FCS (송아지 태아 혈 청) + 1% 페니실린 스 솔루션 (펜-연쇄 상)
10	Dulbecco의 인산 염-(캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +) 없이 DPBS 버퍼링
11	문화 플라스 크 (25 cm)
12	성장 인자 재고 솔루션 (IL-3: 1 μ g/μ; SCF: 2.5 μ g/mL)
13	혈 청 학적인 펫 (10 mL)
14	펫 팁 불 임 (20-200 µ L)
15	Hemocytometer
16	벤치 원심 분리기
17	가 위와 집게
18	마우스에 대 한 CO2 챔버
19	살 균 오픈 후드
20	닫힌된 살 균 후드
21	셀 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)
22	펫 (20-200 µ L) 전송

표 1: 1 단계에 대 한 자료입니다.

1. PMC 격리 복 게
   1. 셀 격리 전에 표 1에 나열 된 재료를 준비 합니다.
   2. 8 14 주 된 남성 마우스를 사용 하 여 PMC 격리에 대 한. CO₂ 흡입에 의해 마우스를 안락사 고 반사의 손실에 의해 죽음을 확인 합니다. 70% 에탄올으로 마우스를 살포 하 고 핀 (지 느 러 미 쪽 아래)를 사용 하 여 거품 블록에 그것을 해결. 무딘 가장자리가 위를 사용 하 여 마우스의 복 부 피부를 제거 합니다. 복 막 구멍을 손상 하지 마십시오.
      참고: 우리가 일반적으로이 프로토콜을 사용 마우스 C57BL/6N 스트레인 유전 배경으로 합니다.
   3. 7 mL 차가운 RPMI 매체의 및 27 G 니 들을 갖춘 10 mL 주사기를 사용 하 여 복 막 구멍에 있는 공기의 5 ml를 주사. 복 막에 신중 하 게 바늘을 밀어 하 고 어떤 장기를 꿰뚫기 하지 마십시오. Epididymal 지방 지역에 자리를 사용 하 여 기관 구멍 뚫 기의 위험을 줄이기 위해.
   4. 주입 후 RPMI 매체에 복 막 세포 분리를 1 분 동안 마우스를 흔들어. 할 동요 마우스 너무 강력 하 게, 내부 장기 손상 및 혈액과 복 막 구멍을 오염 방지 하기 위해.
   5. 새로운 20 G 정 장착 하 여 10 mL 주사기를 다시 사용 합니다. 거품 블록을 기울이기 고 부드럽게 중간 포부를 보다 쉽게 다른 측면에서 벤치에 활용 하 여 1 개의 측에 내부 장기를 이동 합니다. 20 G 바늘을 삽입, 베벨 및 액체는 복 부를 부드럽게 그리고 천천히 발음 (~0.5 mL/s)를 내부 기관에 의해 막힘을 방지. (일반적으로 5-6 mL) 가능한 많은 액체를 수집 합니다.
   6. 주사기에서 바늘을 제거 하 고 얼음에 컬렉션 튜브에 수집 된 세포 현 탁 액을 전송. 보이는 혈액 오염 경우 샘플 튜브를 삭제 합니다.
   7. 5 분 ~ 300 x g 에서 셀 서 스 펜 션 튜브 원심 살 균 후드 아래는 상쾌한 발음. 각 마우스에 대 한 감기 (4-10 ° C)의 4 ml 샘플 펠 릿 결합 PMC 매체와 전송 25 cm² 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액. 추가 최종 농도 10 ng/mL에 성장 요인 IL-3 및 SCF 30 ng/mL, 각각. 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO₂)에 있는 셀을 포함 하는 플라스 크를 배치 하 고 절차까지 ~ 48 h에 대 한 품 어.
2. PMC 문화
   1. 주 2 (격리 후 ~ 48 h): 중간 변경
      1. 제거 하려면 표면에 뜨는 및 비 점착 세포 (적혈구 및 죽은 세포), 플라스 크의 가장자리에 파스퇴르 피 펫 팁을 배치 하 고 플라스 크를 거의 수평으로 들고 여 플라스 크에서 매체를 발음. 마우스 당 미리 따뜻하게 PMC 매체의 4 mL를 추가 합니다. 추가 성장 요인 IL-3 (10 ng/mL) 및 SCF (30 ng/mL). 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO₂)에 있는 셀을 포함 하는 플라스 크를 놓습니다.
   2. 주 9: 셀 분
      1. 50 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액 셀 문화 플라스 크에서 전송. 세 번 10 mL 사전 예 열 (37 ° C) Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)와 플라스 크를 씻고, 동일한 50 mL에서 분리 된 세포와 세포 현 탁 액을 수집 플라스틱 원심 관. hemocytometer에 의해 셀 농도 계산 하 고 셀의 총 수를 계산.
      2. ~ 300 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한 발음. 셀 농도 1 x 10⁶ 셀/mL를 미리 데워 PMC 매체 (37 ° C)에 펠 릿을 복구 합니다. 새로운 25 cm² 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 바닥에 고착 하는 섬유 아 세포와 오래 된 플라스 크를 삭제 합니다.
      3. 추가 성장 요인 IL-3 (10 ng/mL) 및 SCF (30 ng/mL), 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO₂)에 있는 셀을 포함 하는 플라스 크를 놓습니다.
   3. 12-15 일: 측정 셀
      1. FcɛRI 수용 체의 자극으로 어떤 실험을 계획 하는 경우 표준 문화 매체에 ige의 안티-DNP의 300 ng/mL와 하룻밤 셀을 pretreat. 2 단계와 3 단계를 진행 합니다.

2. fluorometric 세포내 무료 칼슘 농도 측정 PMCs에

1. 측정을 하기 전에 표 2에 나열 된 재료를 준비 합니다. 또한,의 구성 하는 이미징 설치 준비: 거꾸로 형광 현미경; 목표: 40 X / 1.3 기름; Fura 2 필터 설정; CCD 카메라; 여기 광원; 영상 수집 프로그램; 중력 공급 솔루션 응용 프로그램 시스템.

1	PMC (12-15 일) 1 x 106 셀/mL
2	Concanavalin A
3	Fura-2 오전
4	Pluronic F-127 20% 솔루션
5	커버 슬립 안경 라운드; ø 25 m m; 제 1
6	DNP HSA (dinitrophenol-인간 혈 청 알 부 민) 재고 솔루션
7	안티-DNP-항 체 (IgE) 재고 솔루션
8	플랫 바닥 플레이트 (12 정)
9	복합 48/80 재고 솔루션
10	잘 이미징 챔버 커버
11	Hemocytometer
12	펫 (20-200 µ L) 전송

표 2: 2 단계에 대 한 자료입니다.

2. Fura-2 이미지 준비
   1. 세포 수는 hemocytometer를 사용 하 여 수행 하 고 셀 농도 1 x 10⁶ 셀/mL를 조정. (3-5 회)는 세포 현 탁 액 1 mL 피 펫 팁을 부드럽게 pipetting으로 PMCs 식민지를 분할.
   2. 준비는 캘리포니아^{2 +}-소금 솔루션 버퍼링 HEPES 포함 (캘리포니아^{2 +}-HBSS) 135 mM NaCl, 6 m m KCl, 2mm CaCl₂, 1.2 m m MgCl₂, 10 mM HEPES, 및 12 mM 포도 당으로 구성. 3 M NaOH와 7.4에 pH를 조정 합니다.
   3. 준비 concanavalin A 각 25 m m에 pipetting concanavalin A 솔루션 (0.1 mg/mL에서 H₂O) 1 방울에 의해 코팅된 슬라이드 라운드 살 균 후드 커버 유리. 적어도 1 분 동안 커버 슬립에 방울을 두고 그 피 펫 및 하자 커버 미끄러져 건조 45 분 신중 하 게 고무 챔버 이미징에 concanavalin A 처리 커버 전표를 눌러에 대 한 솔루션의 대부분을 제거 ( 재료의 표참조)까지 그들은 현미경 이미징 챔버를 연결 합니다.
      참고: 폴 리-L-리 신 코팅 슬라이드 대신 사용할 수 있습니다.
   4. 형광 Ca^{2 +} 염료 Fura-2 녹 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 오전 (1 mM). 빛에서 보호 하는이 솔루션을 저장 합니다.
   5. Fura 2 희석 캘리포니아^{2 +}에서 오전 재고 솔루션-HBSS "로딩 버퍼"를 준비 하기 위해 5 µ M의 최종 농도에. DMSO에 20% pluronic F-127의 5 µ L/mL와 함께 보충.
   6. PMC 세포 현 탁 액의 500 µ L로 "로딩 버퍼" 믹스 500 µ L. 이미징 챔버로 혼합물을 플라스틱 하 고 어둠 속에서 실 온에서 20-30 분에 대 한 셀을 품 어.
   7. 응용 프로그램 시스템 자극 프로토콜에 따라 서로 다른 솔루션을 공급 하는 중력을 설정 합니다. 주사기 1 캘리포니아^{2 +}-HBSS 솔루션의 40 mL와 함께 보충, 2 캘리포니아^{2 +}-HBSS 포함 된 솔루션 100 ng/mL DNP의 40 mL 주사기, 주사기 캘리포니아^{2 +}-HBSS 솔루션에 포함 된 50 µ g/mL 복합 48/80의 40 mL로 3, 4의 40 mL 주사기 명목상 캘리포니아^{2 +}-무료-HBSS 솔루션, 5에 명목상으로 캘리포니아의^{2 +}40 mL 주사기 및-무료-HBSS 솔루션 2 µ M 포함 된 Thapsigargin.
   8. 그것에 침수 기름의 작은 방울을 배치 하 여 40 X 높은 조리개 기름 침수 목표를 준비 합니다.
   9. 거꾸로 한 현미경의 스테이지에서 응용 프로그램 시스템을 탑재 합니다. 응용 프로그램 시스템에 로드 된 세포 이미징 챔버를 넣고 녹음 하는 동안 움직임을 방지 하기 위해 보안. 전송 된 라이트 켜고 셀 초점.
   10. 캘리포니아^{2 +}-HBSS 버퍼 중력 먹인 응용 프로그램 시스템을 사용 하 여 세 번 셀 린스 합니다.
   11. 캘리포니아^{2 +}세포를 품 어-HBSS Fura-2에 대 일 분 대 한 오전 드 에스테 르 화.
   12. 린스는 세포는 이미징 시작 하기 전에 한 번 더, 잠재적으로 제거를 유출 형광 성 염료.
3. 세포 이미징
   1. 생리 적 획득 모드에서 이미지 수집 프로그램을 시작 합니다. 설치 창을 열고 포커스와 최적의 수집 시간 조절 (340와 여기에 대 한 동일 해야하는 nm 및 380 nm 및 일반적으로 50-150 ms 사이의 범위).
      참고: Fura-2의 노출을 최소화 모든 빛을 염료의 photobleaching을 피하기 위해 로드 셀.
   2. 참고 그림을 이미지 하 고 관심 (ROI)의 영역으로 셀을 표시 합니다. 셀에 존재 하 고 배경으로 정의 지역에서 마지막 투자 수익을 표시 합니다.
   3. 설치를 완료 하 고 5 s 수집 속도 측정을 시작 합니다.
      참고: 셀 것 이다 될 또는 조명 340의 여기 빛 nm 및 380 nm, 그리고 방출된 형광 (> 510 nm) CCD 카메라를 사용 하 여 수집 됩니다. 이미지 비율 (F340 nm/F380 nm) 뿐만 아니라 형광 신호 F340 nm와 F380 nm의 3 개의 창에 표시 됩니다. 개별 ROIs 형광 강도의 시간 과정의 차트 의미 값 또한 지속적으로 표시 됩니다.
   4. 실험의 디자인에 따라 적절 한 주기 수에 솔루션을 추가:
      1. [캘리포니아^{2 +}]_나, 항 원 유도 측정 상승 하려면 그림 2, 2B에서 볼 수 있듯이 20, 주기와 주기 150 후 기록 중지 후 주사기 2 솔루션을 적용 합니다.
      2. [캘리포니아^{2 +}] 48/80 복합 유도 고도 측정_{, i},C, 그림 2그림으로 20, 주기와 주기 150 후 기록 중지 후 주사기 3 솔루션을 적용 합니다.
      3. D 그림 2볼 수 있듯이 [캘리포니아^{2 +}]_내가 SOCE에 의해 evoked의 고도 측정, 주기 10 후 주사기 4 솔루션을 적용, 사이클 70 후 주사기 5 솔루션을 적용, 주기 120, 후 주사기 4 솔루션을 적용 사이클 150, 후 주사기 1 솔루션을 적용 하 고 사이클 220 후 녹음을 중지.
   5. 마친 후 측정, 변환 결과 배경 보정 없이 여기 파장 뿐만 아니라 비율 값와 모든 투자 수익에 대 한 배경 보정 없이 측정된 농도 포함 하는 비율 테이블 그리고 모든 측정 시간 점입니다. 수집 프로그램에서 연속적으로 버튼을 눌러: "시작 커터", "모두 표시", "모든 변환", "생리학 측정", "좋아,"확인". 테이블 및 오프 라인 분석을 위해 이미지 스택 파일을 저장.

3. 베타-hexosaminidase 릴리스 측정 PMCs에

1	PMC (12-15 일) 1 x 106 셀/mL
2	안티-DNP-항 체 (IgE) 재고 솔루션
3	DNP HSA 재고 솔루션
4	복합 48/80 재고 솔루션
5	Ionomycin
6	96 잘 접시, v 자형 하단
7	96 잘 접시, 플랫 바닥
8	플라스틱 원심 관 (15 mL)
9	혈 청 학적인 펫
10	셀 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)
11	벤치 원심 분리기
12	광학 밀도 측정을 위한 결정 플레이트 리더
13	멀티 채널 피 펫 (20-200 μ)
14	Hemocytometer

표 3: 3 단계에 대 한 자료입니다.

1. 측정, 이전 표 3에 나열 된 재료를 준비 합니다.
   참고: β-hexosaminidase 그들의 자극 후 MCs에서 출시 된 p-nitrophenol 및 N-아 세 틸-D-글루코사민으로 p-nitrophenyl-아 세 틸-D-글루코사민 (pNAG) hydrolyzes. 샘플에서 β-hexosaminidase 양은 형성 될 것 이다 p-nitrophenol의 크기에 비례 이다. "중지 솔루션"의 높은 pH 환경에서 p-nitrophenol 완전히 deprotonated p-nitrophenolat으로 존재 하 고 405에서의 빛 흡수도 의해 검출 될 수 있다 nm.
2. 130 mM NaCl, KCl 5mm, 1.4 m m CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 5.6 m m 포도 당, 및 BSA 0.1%를 포함 하는 Tyrode의 솔루션을 준비 합니다. 3 M NaOH와 7.4에 pH를 조정 합니다.
3. 1% 트라이 톤 X-100 양의 Tyrode의 솔루션에 추가 하 여 세포의 용 해 솔루션을 준비 합니다.
4. 200mm 글리신의 구성 중지 솔루션을 준비 하 고 NaOH와 10.7에 pH를 조정.
5. 4 m m의 최종 농도를 0.4 M 구 연산 산 성 pNAG를 용 해 하 여 pNAG 솔루션 (4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) 솔루션을 준비 합니다.
6. 분석 결과에 필요한 세포의 양을 계산 (중복에서 분석 결과 수행). 잘 당 200000 PMCs를 사용 합니다. 2 웰 스를 사용 하 여 부정적인 컨트롤 (Tyrode의 솔루션 없이 DNP 같은 어떤 secretagogues 또는 복합 48/80)와 긍정적인 컨트롤로 2 우물 (10 µ M와 Tyrode의 솔루션 Ionomycin) 모든 유전자에 대 한.
7. 15 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브에 세포를 전송, Tyrode의 솔루션, 15 mL를 볼륨을 조정 하 고 4 분 파스퇴르 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 resuspend Tyrode의 솔루션 2 x 10⁶ 셀에 셀에 대 한 200 x g 에서 원심 /mL입니다.
8. 96-잘 V-아래 잘 접시에 잘 당 세포 현 탁 액의 100 µ L를 전송. ( 그림 3Apipetting 계획)에 따라 각 잘을 자극 또는 제어 솔루션의 25 µ L를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO₂시 45 분에 대 한 셀을 품 어.
9. 5 분 동안 얼음에 96 잘 접시를 두어서 반응을 중지 합니다. 그런 다음 판 120 x g에서 4 분 4 ° C에서 원심. 평면-바닥 96 잘 접시에 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 상쾌한의 120 µ L를 전송 하 고 얼음에 두십시오. 신중 하 게 셀 펠 릿을 만지지 마십시오 하지만 완전히는 상쾌한 발음.
10. 셀 펠 릿에 세포의 용 해 버퍼의 125 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 5 분 동안 셀 펠 릿을 품 어와 반복 pipetting (약 5 시간)으로 부 화 후 그들을 resuspend.
11. 새로운 평면 아래 96 잘 접시의 필요한 우물에 pNAG 솔루션 (4mm)의 25 µ L 플라스틱 준비 된 pNAG 솔루션으로 각 세포 lysate의 25 µ L를 각 상쾌한에서 25 µ L를 추가 합니다.
12. 37 ° c.에서 1 h 반응 일괄 처리 품 어 부 화, 후 각 잘 반응을 중지 중지 솔루션의 150 µ L 플라스틱.
13. 405에 듀얼-파장 설정을 사용 하 여 microplate 리더와 함께 접시를 분석 자동 배경 빼기에 대 한 참조 630 nm nm. 수집 프로그램에서 똑 딱 상자 "참조" 및 "흡 광도" 프로그램 요소 메뉴에서 선택 "630 nm" 드롭 다운 목록에서. 샘플의 광학 밀도 너무 높은 경우에, 측정 전에 프로브 적절 한 희석을 준비 합니다.
14. 다음 방정식에 따르면 β-hexosaminidase 방출의 비율을 계산:
    
    [상쾌한] 배경 이다 출시 [%]는 특정 베타-hexosaminidase 릴리스의 %, 상쾌한의 흡수를 수정 하 고 [lysate] 배경 수정 해당 세포 lysate의 흡수.

결과

PMCs 복 게 여 3 야생 타입 마우스 (C57BL/6N) 으로부터 격리 되었고 추가 보충 RPMI 매체에 교양 20 %FCS 1% 펜-Strep 메 마른에서 성장 인자 (IL-3 10 ng/mL) 및 30 ng/mL에서 SCF의 습도 조건에서 37 ° C, 5% CO₂. 매체는 셀 격리 후 2, 9 일에 변경 되었습니다. 셀 형태 전송 사용 하 여 분석 DIC 이미징 빛 ( 그림 1A, B참조). 셀 대비 및 세분성 좋은 세포 생...

토론

MC 모델 MC degranulation, chemotaxis, 접착, 또한 세포내 신호 변환 통로 MC 활성화에 명료로 공부를 성공적으로 사용할 수 있습니다. 일부 연구 자들은 불멸 하 게 선 (LAD2 HMC1) 등 인간의 MCs 사용 인간의 MCs 모델, 코드에서 파생 된 조상 세포 (CD133 +)와 주변 혈액 조상 세포 (CD34 +) 혈액. 다른 선호 하는 설치류와 같은 불후의 명작 MC 모델 (쥐 basophilic 백혈병 RBL-2 H 3 MC 선) 또는 기본 교양 (마우스 뼈 골 수 유래...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI Medium	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
Anti-DNP-Antibody	Sigma-Aldrich	D-8406
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
Compound 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	X100
4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell Imaging Chamber	Sigma-Aldrich	GBL635051
96-Well plate, v-shaped bottom	Corning	3896
96-Well plates, flat bottom	Greiner Bio-One	655180
Microtiter plate reader with "i-control" software	Tecan	Nano Quant, infinite M200 Pro
Flat bottom plate	Greiner Bio-One	655180
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62.547.254
Culture Flasks (25 cm)	Greiner Bio-One	69160
Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1	Menzel	CB00250RA1
Hemocytometer	VWR	631-0696
Inverted Microscope	Zeiss	Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil	Zeiss	440260-9900
HC Filter Set Fura 2	AHF	H76-521
CCD Camera	Zeiss	AxioCam MRm
Monochromatic Light Source	Sutter Instruments	Lambda DG-4
Imaging Acquisition Program	Zeiss	AxioVision 4.8.2
Gravity fed solution application system	Custom Made	4-channel
15 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62,554,502
Bench Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.0R