בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca2 +-הדמיה, מבחני Degranulation

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד ולטפח מאתר תאי פיטום הצפק. אנו גם מתארים שני פרוטוקולים עבור שלהם אפיון פונקציונלי: הדמיה פלורסנט תאיים חינם Ca^{2 +} ריכוז ואת וזמינותו degranulation בהתבסס על ערכי צבע מוחלטים כימות β-ההקסוזאמינידאז שוחרר.

Abstract

תאי פיטום (MCs), כחלק של המערכת החיסונית, לשחק תפקיד מרכזי בהגנה על המחשב המארח נגד פתוגנים מספר, אתחול של התגובה החיסונית אלרגית. ההפעלה של MCs דרך cross-linking של משטח IgE מאוגד לקולטן IgE זיקה גבוהה (FcεRI), וכן באמצעות הגירוי של מספר רצפטורים אחרים, יוזם את עליית חינם תאיים Ca^{2 +} רמת ([Ca^{2 +}]_אני) זה מקדם את השחרור של מתווכים דלקתיים ואני אלרגית. זיהוי מולקולרי המרכיבים המעורבים איתות המסלולים האלה חיונית להבנת ברגולציה של הפונקציה MC. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול הבידוד של רקמת חיבור מאתר סוג MCs על ידי שטיפת הצפק, טיפוח של MCs הצפק (PMCs). של מודלים שונים של העכבר נוקאאוט על ידי מתודולוגיה זו תרבויות של MCs מייצגים גישה שימושי לזיהוי של החלבונים המעורבים MC מסלולי איתות. בנוסף, אנו גם לתאר את פרוטוקול תא בודד Fura-2 הדמיה כמו טכניקה חשוב עבור כימות של Ca^{2 +} איתות ב MCs. מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית ניטור של [Ca^{2 +}]_אני הוא אמין, נפוץ גישה לימוד Ca^{2 +} איתות האירועים, כולל ערך סידן המופעלים באמצעות החנות, אשר הוא בעל חשיבות עליונה עבור הפעלת MC. לניתוח של MC degranulation, נתאר assay שחרור של β-ההקסוזאמינידאז. הכמות של β-ההקסוזאמינידאז שוחרר לתוך המדיום תרבות נחשב סמן degranulation כל שלושה שונים הפרשה קבוצות משנה שמתואר MCs. β-ההקסוזאמינידאז בקלות ניתן לכמת את התגובה שלה עם מצע colorigenic ב צלחת microtiter assay ערכי צבע מוחלטים. טכניקה מאוד לשחזור זו היא חסכונית ואינו דורש שום ציוד מיוחד. בסך הכל, פרוטוקול שסופקו מדגים תשואה גבוהה של MCs ביטוי אופייני MC סמני פני השטח, הצגת תכונות אופייניות פנוטיפי מורפולוגיים של MCs ולאחר הוכחת תגובות מאוד לשחזור secretagogues ב Ca^{2 +}- מבחני הדמיה ו degranulation.

Introduction

MCs תפקיד בולט במהלך תגובות חיסוניות מולדת ולא נרכשת. באופן ספציפי, MCs להשתתף ברצח של פתוגנים, כגון חיידקים, טפילים, ולבזות גם פפטידים אנדוגני רעיל או הרכיבים של venoms (עבור ראה סקירה גאלי ואח . 2008¹). תפקיד פיזיולוגי MCs חסינות מולדת, מסתגלת הוא הנושא של ויכוחים. לכן, הסתירות נתונים רבות במחקרים המתבצעים באמצעות מודלים שונים של העכבר חשוכת-MC דורשים הערכה מחדש שיטתית של פונקציות אימונולוגי של MCs מעבר אלרגיה². MCs בוגרת מותאמים בעיקר רקמות ואיברים כגון עור, ריאות, בטן, נמצאים בדרך כלל רק במספרים קטנים בדם. MCs שואבים מבשרי hematopoietic, כגון MC אבות, והשלם שלהם בידול ההבשלה ב microenvironments של רקמות vascularized כמעט כל¹. T-תא-derived factor אינטרלויקין (IL)-3 מקדם באופן סלקטיבי את הכדאיות, התפשטות, הבידול של אוכלוסיה pluripotent של העכבר MCs שלהם אבות hematopoietic³. תא גזע פקטור (SCF) המיוצר על ידי בתאי הרקמות מבנית ומשחק תפקיד מכריע MC פיתוח, הישרדות, הגירה, הפונקציה⁴. המאפיינים של MCs בודדות עשויות להשתנות בהתאם יכולתם לסנתז ולאחסן פרוטאזות או proteoglycans שונים. בעכברים, נבדלים של MCs כביכול רקמת חיבור מסוג MCs הרירית על פי שלהם לוקליזציה אנטומיים, מורפולוגיה ותוכן של הפארין ו פרוטאזות⁵.

ב MCs, גידול של חינם Ca cytosolic^{2 +} ([Ca^{2 +}]_אני) היא הכרחית על degranulation וייצור של eicosanoids, כמו גם עבור הסינתזה של ציטוקינים והפעלה של גורמי שעתוק בתגובה אנטיגן, שונים secretagogues⁶. יעד במורד הזרם של גירויים אלה הוא phospholipase C, אשר הידרוליזה phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate diacylglycerol (DAG), אינוזיטול טריפוספט-1,4,5. דאג מפעיל חלבון קינאז C ו- IP3 משחרר יונים של Ca^{2 +} מ רשתית תוך-פלזמית. דלדול של חנויות אלה מפעיל Ca^{2 +} זרם דרך קרום פלזמה Ca^{2 +} ערוצים, מובילים כדי לאחסן ערך סידן המופעלים (SOCE). תהליך זה ברמיזות האינטראקציה של Ca^{2 +}-חיישן, אינטראקציה סטרומה המולקולה 1-(Stim1), רשתית תוך-פלזמית עם Orai1⁷ , כמו גם דרך ההפעלה של ערוץ פוטנציאלי קולטן ארעי (TRPC) הקנונית חלבונים (עבור סקירה ראה Freichel. et al. 2014⁸) ב קרום פלזמה.

ללמוד תפקיד פיזיולוגי של הערוצים הללו, מספר תרופתי (יישום של חוסמי ערוצים) או גישות גנטיות משמשים בדרך כלל. במקרה האחרון, דיכוי של ביטוי חלבון מושגת על ידי מיקוד mRNA (נוקאאוט) או דנ א גנומי עריכה עם מחיקת גלובלי או רקמות ספציפיות⁹ אקסון קידוד נקבובית ויוצרים יחידת משנה של ערוץ (הסתרה). הזמינות של חוסם עם ירידה לפרטים מספיק עבור הערוצים הללו הוא מוגבל. בנוסף, הגישה תמונות ציפורים דורש זהירות השליטה שלה ולייעל באמצעות, למשל-מערביות, כתם ניתוח, היא הקשו על ידי אי זמינות של נוגדנים ספציפיים עבור החלבון ערוץ יישוב במקרים רבים. לפיכך, השימוש של נוקאאוט העכבר מודלים עדיין נחשב תקן הזהב לניתוח כזה. מודל המועדפת במבחנה על חקירת פונקציות MC היא טיפוח של PMCs זה יכול להיות מבודד שמחוץ כאוכלוסייה לבגרות מלאה (לעומת הבחנה MCs במבחנה מ, למשל., תאים במח העצם)¹⁰ . לעומת מח עצם נגזר MCs (BMMCs), אשר גם משמשות ללמוד MC פונקציה במבחנה, הגירוי של FcεRI ובטא-ההקסוזאמינידאז שחרור גדל 8-fold ו 100-fold ב PMCs, בהתאמה. במאמר זה נתאר שיטת בידוד ואת טיפוח של מאתר PMCs, אשר מאפשר להשיג לאחר 2 שבועות של culturing מספר גבוה של רקמת חיבור טהור הקלד MCs, מספיקים לצורך ניתוח נוסף.

למרות התקדמותו האחרונה של פיתוח, יישום של סידן מקודדים גנטית אינדיקטורים, השימוש שלהם עדיין מוגבל על ידי קשיים בלידה של גנים לתאים היעד, באופן ספציפי, בתאים הפערים מיוחדים כגון ראשי MCs בתרבית. בנוסף, קבוצה זו של אינדיקטורים פלורסנט למדידות [Ca^{2 +}]_אני עדיין חסרה רציומטרי צבע עם טווח דינמי גבוה. מסיבות אלו, השיטה המועדפת על רציומטרי [Ca^{2 +}]_אני מידה הוא עדיין השימוש הפלורסנט "Fura-2"¹¹.

כיום, הכי נפוץ הגישה על ההערכה של הפעלת MC, degranulation המדידה של β-ההקסוזאמינידאז פעילות. Β-ההקסוזאמינידאז, מתווך אלרגי, הוא אחד מרכיבי גרגר של MC זה שפורסמו במשותף עם היסטמין ביחס קבוע MCs¹². Β-ההקסוזאמינידאז ניתן בקלות ובדייקנות למדוד באמצעות התגובה שלה עם מצע ספציפיים, אשר מייצרת כמות למדידה של מוצר colorigenic יצירותי ב assay ערכי צבע מוחלטים microplate. במאמר זה, מדווח יישום שיטה זו לניתוח של PMCs degranulation בתגובה מגוון רחב של גירויים.

צבירה של זיקה גבוהה קולטן IgE plasmalemmal (FcɛRI) מפעילה ב MCs רב-תכליתי תאיים איתות שביל, המוביל אל שחרור של גרגר הפרשה תוכן במרחב שמסביב חוץ-תאית. בנוסף אנטיגן ספציפי, הרבה גירויים אחרים יכולים להפעיל MCs לשחרר את מערך מגוון של מגשרים immunomodulatory, כגון anaphylatoxins המשלים (למשל., C3a, C5a)¹³, endothelin פפטיד את מצר את כלי הדם 1 (ET1)¹⁴ , כמו כן כמו רבים cationic חומרים ותרופות מעוררות תגובות pseudoallergic (למשל., icatibant)¹⁵ על ידי איגוד MRGPRX2¹⁶. תאיים המעורבים MCs MRGPR-induced degranulation איתות המסלולים מאופיינים לקוי לעומת בתיווך FcɛRI איתות תאיים; המסלולים הללו רק החל להילמד באופן אינטנסיבי במהלך האחרון כמה שנים¹⁷ לאחר ה-זיהוי הקולטן¹⁶. במידה רבה, תעלות היונים קרום פלזמה מעורב ערך סידן ואחריו MRGPRX2 גירוי להישאר להיות מובן. לכן, המאמר הנוכחי מתמקד גם סידן תאיים באיתות, degranulation של MCs מגורה עם אגוניסטים MRGPR.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי החקיקה הגרמנית הנחיות טיפול ושימוש של חיות מעבדה (אושר באופן רשמי על ידי המועצה האזורית קארלסרוהה).

1. PMC בידוד וטיפוח על ידי שטיפה בקרום הבטן

1	קרח
2	מזרקים 10 מ
3	מחטים 27 G
4	20 גרם מחטים
5	בלוק קלקר וסיכות
6	אוסף צינורות (צינורות צנטריפוגה פלסטיק 50 מ)
7	70% אתנול
8	RPMI בינוני (טרום מקורר ושמר על הקרח)
9	PMC בינוני: RPMI בינוני + 20% FCS (סרום עגל עוברית) + 1% פתרון סטרפטומיצין פניצילין (עט-דלקת)
10	באגירה פוספט של Dulbecco תמיסת מלח - DPBS (ללא Ca2 + ו Mg2 +)
11	תרבות מבחנות (25 ס מ)
12	גורמי גדילה במניה פתרונות (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2.5 μg/mL)
13	פיפטות סרולוגית (10 מ"ל)
14	פיפטות טיפים סטרילי (200-20 µL)
15	Hemocytometer
16	ספסל צנטריפוגה
17	מלקחיים ומספריים
18	תא2 CO עכברים
19	הוד סטרילי פתוח
20	סגור את מכסה המנוע סטרילי
21	תא חממה (37 ° C ו- 5% CO2)
22	פיפטות העברה (200-20 µL)

טבלה 1: חומרים עבור שלב 1.

1. PMC בידוד על ידי שטיפה בקרום הבטן
   1. לפני לתא הבידוד, להכין את החומרים המופיעים בטבלה 1.
   2. השתמש 8-14 בת שבוע עכברים זכרים PMC בידוד. המתת חסד עכבר באמצעות אינהלציה₂ CO, לאשר את מותו על ידי אובדן רפלקסים. לרסס את העכבר עם 70% אתנול ולתקן אותה על גוש קצף באמצעות סיכות (בצידו הגבי למטה). מסירים את העור הגחון של העכבר באמצעות מספריים קצה קהה. למנוע נזק חלל הצפק.
      הערה: אנו משתמשים בדרך כלל פרוטוקול זה עבור עכברים עם רקע גנטי של זן C57BL/6N.
   3. להזריק 7 מ של המדיום RPMI קר כקרח, 5 מ של אוויר בחלל הצפק באמצעות מזרק 10 מ ל מצויד עם מחט 27 גרם. לדחוף את המחט בקפידה הצפק, לא לנקב בכל האיברים. השתמש נקודה באזור של השומן epididymal כדי להפחית את הסיכון ניקוב האיבר.
   4. לאחר ההזרקה, לנער את העכבר עבור 1 דקות להתנתק תאים הצפק אל המדיום RPMI. אל תלחץ על העכבר הנשים האלה, כדי למנוע פגיעה האיברים הפנימיים מזהמות חלל הצפק עם הדם.
   5. שימוש חוזר המזרק 10-mL על-ידי אספקה. זה עם בצינורית חדש 20 גרם. משמרת את האיברים הפנימיים לצד אחד על ידי הטיית הרחוב הקצף בעדינות טפיחות על הספסל כדי להקל על השאיפה בינוני מהצד השני. להכניס מחט 20 גרם, מסגרת משופעת למעלה, וארוקן את הנוזלים מהבטן ובאיטיות (~0.5 mL/s) כדי למנוע סתימת מאת האברים הפנימיים. לאסוף את כל הנוזל ככל האפשר (בדרך כלל 5-6 מ"ל).
   6. הסר את המחט של המזרק ולהעביר התליה תא שנאספו בשפופרת איסוף על קרח. להתעלם צינור לדוגמה אם יש זיהום דם גלוי.
   7. Centrifuge הצינורות עם התליה תא ב x ~ 300 גרם במשך 5 דקות. ברדס סטרילי וארוקן את תגובת שיקוע. כל עכבר, לשלב את כדורי מדגם ב מ 4 ל קר (4 – 10 מעלות צלזיוס) בינוני PMC והעברת התליה תא אל בקבוק תרבות² 25 ס מ. להוסיף את גורמי גדילה IL-3 ו- SCF כדי ריכוזים הסופי 10 ננוגרם למ"ל ו 30 ננוגרם למ"ל, בהתאמה. מקם את הבקבוקון המכילות את התאים בתוך אינקובטור (37 ° C ו- 5% CO₂) ולאחר תקופת דגירה של h ~ 48 עד ההליך הבא.
2. PMC תרבות
   1. יום 2 (~ 48 שעות לאחר בידוד): שינוי בינוני
      1. כדי להסיר את התאים supernatant ושאינם-חסיד (אריתרוציטים, תאים מתים), תשאף האמצעי הבקבוק על ידי הצבת טיפ פיפטה פסטר בקצה הבקבוקון והחזקת את הבקבוק כמעט אופקית. להוסיף 4 מיליליטר בינוני PMC ומחוממת מראש לכל העכבר. הוסף את גורמי גדילה IL-3 (10 ng/mL) ו- SCF (30 ng/mL). מקם את הבקבוקון המכילות את התאים בתוך אינקובטור (37 ° C ו- 5% CO₂).
   2. יום 9: תא פיצול
      1. להעביר את המתלים תא מ הבקבוקון התרבות התא לתוך שפופרת צנטרפוגה פלסטיק 50 מל. לשטוף את הבקבוק שלוש פעמים בתמיסת 10 מ"ל מראש חימם (37 ° C) Dulbecco של באגירה פוספט (DPBS), צנטריפוגה פלסטיק איסוף התליה תא עם תאי מנותקת ב- 50 מ ל אותו צינור. לספור את הריכוז תא על-ידי hemocytometer ולאחר לחשב את המספר הכולל של התאים.
      2. Centrifuge התליה תא ב x ~ 300 גרם במשך 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע. לשחזר בגדר בינוני PMC ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) כדי להשיג את התא ריכוז עונה 1 פרק 10⁶ התאים למ"ל. העברת התליה תא אל בקבוק חדש של תרבות² 25 ס מ. למחוק את הבקבוק הישן עם fibroblasts הקפדה על התחתון.
      3. הוסף את גורמי גדילה IL-3 (10 ng/mL) ו- SCF (30 ng/mL), ומניחים את הבקבוקון המכילות את התאים בתוך אינקובטור (37 ° C ו- 5% CO₂).
   3. ימים 12-15: תא מדידות
      1. אם כל הניסויים עם גירוי של קולטני FcɛRI מתוכננים, pretreat את התאים בין לילה עם 300 ננוגרם למ"ל של anti IgE-DNP במדיום תרבות רגיל. להמשיך עם שלב 2 או שלב 3.

2. fluorometric סידן חינם תאיים מדידת ריכוז ב- PMCs

1. לפני המדידות, להכין את החומרים הרשומים בטבלה מס ' 2. בנוסף, להכין התקנה הדמיה המורכב: מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה; המטרה: 40 X / 1.3 שמן; לוקחת 2 להגדיר מסנן; מצלמת CCD; מקור האור עירור; הדמיה תוכנית הרכישה; כוח המשיכה להזנה פתרון יישום המערכת.

1	PMC (בן 12-15 ימים) עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל...
2	Concanavalin א
3	Fura-2 AM
4	פתרון 20% Pluronic F-127
5	שער גולשת משקפיים עגולים; ø 25 מ מ; מס ' 1
6	פתרון מניות DNP-HSA (אדם-dinitrophenol אלבומין)
7	פתרון מניות אנטי-DNP-נוגדנים (IgE)
8	צלחת התחתון שטוח (12 וולס)
9	מתחם פתרון מניות 48/80
10	מכסים היטב הדמיה צ'יימברס
11	Hemocytometer
12	פיפטות העברה (200-20 µL)

טבלה 2: חומרים עבור שלב 2.

2. הכנת הדמיה Fura-2
   1. לבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולהתאים את הריכוז תא עונה 1 פרק 10⁶ תאים/מ ל.... לפצל את המושבות PMCs על ידי בעדינות pipetting (3-5 פעמים) התליה תא עם טיפ פיפטה 1 מ"ל.
   2. להכין Ca^{2 +}-המכיל HEPES buffered תמיסת מלח (Ca^{2 +}- HBSS) מורכב 135 מ"מ NaCl, 6 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ CaCl₂, MgCl 1.2 מ מ₂, 10 מ מ HEPES ו- 12 מ"מ גלוקוז. להתאים את ה-pH ל 7.4 עם 3 M NaOH.
   3. להכין concanavalin A מצופה השקופיות על-ידי pipetting טיפה 1 של concanavalin A פתרון (0.1 mg/mL H₂O) על כל 25 מ מ מסביב כיסוי זכוכית תחת כיסוי סטרילי. להשאיר את הטיפות שער גולשת לפחות 1 דקות, ואז להסיר את מרבית הפתרון עם פיפטה, תן שער גולשת מילה נהדרת עבור 45 דקות ללחוץ בזהירות concanavalin א התייחס שער גולשת על הגומי הדמיה קאמרית (ראה טבלה של חומרים) עד הם לצרף להשיג מיקרוסקופ הדמיה צ'יימברס.
      הערה: פוליפוני-L-ליזין מצופה שקופיות יכול לשמש כחלופה.
   4. להמיס את Ca^{2 +} הפלורסנט Fura-2 בבוקר דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) (1 מ"מ). אחסן את הפתרון הזה מוגן מפני אור.
   5. לדלל את Fura-2 פתרון מניות AM ב Ca^{2 +}- HBSS כדי ריכוז הסופי של 5 מיקרומטר לשם הכנת המאגר"העמסה". תוספת עם 5 µL/mL של 20% pluronic F-127 ב דימתיל סולפוקסיד.
   6. µL מיקס 500 "טעינת מאגר" עם 500 µL של התליה תא PMC. Pipette את התערובת לתוך החדר הדמיה, דגירה התאים למשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
   7. להגדיר את כוח המשיכה האכיל יישום מערכת עם פתרונות שונים לפי הפרוטוקול גירוי. תוספת של מזרק 1 40 מ של Ca^{2 +}פתרון - HBSS, מזרק 2 עם 40 מ של Ca^{2 +}- HBSS פתרון המכיל 100 ננוגרם למ"ל DNP, מזרק 3 עם 40 מ של Ca^{2 +}- HBSS פתרון המכיל 50 µg/mL מורכבות 48/80, מזרק 4 עם 40 מ ל נומינלית Ca^{2 +}-חינם-פתרון HBSS, ואת מזרק 5 מ ל 40 של נומינלית Ca^{2 +}-חינם-2 מיקרומטר, לאודנום HBSS Thapsigargin.
   8. הכן מטרה טבילה גבוהה הצמצם שמן 40 X על-ידי הצבת טיפה קטנה של שמן טבילה על זה.
   9. הר מערכת יישום על הבמה של המיקרוסקופ הפוכה. להכניס לחדר ההדמיה עם תאי טעון יישום המערכת ואבטח אותו כדי למנוע תנועה במהלך ההקלטה. להדליק את האור המשודר ולהתמקד התאים.
   10. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם Ca^{2 +}- HBSS מאגר באמצעות מערכת הכבידה-fed היישום.
   11. דגירה התאים Ca^{2 +}- HBSS עבור 5 דקות Fura-2 דה-esterification AM.
   12. לשטוף את התאים פעם נוספת לפני התחלת ההדמיה, להסיר את כל פוטנציאל דלף הפלורסנט.
3. תא הדמיה
   1. להפעיל את תוכנית הרכישה הדמיה במצב פיזיולוגי רכישה. פתח חלון הגדרת, והתאימו את המוקד ואת הזמן האופטימלי רכישה (אשר אמור להיות זהה עבור עירור עם 340 nm 380 nm ו בדרך כלל נע בין 50 – 150 ms).
      הערה: למזער את החשיפה של Fura-2 תא טעון כל האור כדי להימנע photobleaching של לצבוע.
   2. תמונה תמונה הפניה, לסמן את התאים אזורים מעניינים (ROI). סמן רועי האחרון באזור שבו אין תאים קיימים ולהגדיר אותו כרקע.
   3. להשלים את ההתקנה ולהתחיל את המדידה עם קצב רכישת s 5.
      הערה: התאים תהיה לסירוגין מוארת עם אור עירור של 340 nm ו 380 nm, ו על ידי קרינה פלואורסצנטית הנפלט (> 510 ננומטר) ייאספו באמצעות מצלמת ה-CCD. התמונות של קרינה פלואורסצנטית אותות F340 nm ו F380 ננומטר, כמו גם היחס (F340 nm/F380 ננומטר) יוצגו משלושה חלונות. התרשימים כמובן זמן של עוצמת קרינה פלואורסצנטית ROIs בודדים מתכוון הערכים יוצגו גם ברציפות.
   4. הוסף פתרונות במספר מחזור תקין על פי העיצוב של הניסוי:
      1. כדי למדוד אנטיגן-induced העלאת [Ca^{2 +}]_אני, כמופיע באיור 2, 2B, החל הפתרון מזרק 2 לאחר מחזור 20, ולהפסיק הקלטה לאחר מחזור 150.
      2. כדי למדוד את מורכבות 48/80-induced העלאת רמת [Ca^{2 +}]_i,כמו מאויר איור 2C, החלת הפתרון מזרק 3 לאחר מחזור 20, ולהפסיק הקלטה לאחר מחזור 150.
      3. כדי למדוד את העלאת [Ca^{2 +}]_אני עורר על-ידי SOCE, כפי שמוצג באיור 2D, החלת הפתרון מזרק 4 לאחר מחזור 10, החלת הפתרון מזרק 5 לאחר מחזור 70, להחיל את הפתרון מזרק 4 לאחר מחזור 120, החלת הפתרון מזרק 1 לאחר מחזור 150, לעצור את ההקלטה לאחר מחזור 220.
   5. לאחר שסיים את המדידה, להמיר את התוצאות לטבלה יחס המכילה עוצמות נמדד עירור אורכי גל עם או בלי רקע תיקון, כמו גם את הערכים יחס עם או בלי רקע תיקון עבור כל רועי כל נקודת זמן המדידה. בתוכנית רכישה, לחץ על לחצני ברציפות: "התחל קאטר", "מארק כל", "להמיר את כל", "פיזיולוגיה של המידות", "בסדר,"Ok". לשמור את הקבצים טבלאות של אוספי תמונות לניתוח במצב לא מקוון.

3. בטא-ההקסוזאמינידאז מדידה השחרור ב- PMCs

1	PMC (בן 12-15 ימים) עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל...
2	פתרון מניות אנטי-DNP-נוגדנים (IgE)
3	פתרון מניות DNP-HSA
4	מתחם פתרון מניות 48/80
5	Ionomycin
6	צלחת 96-ובכן, התחתון בצורת v
7	96-ובכן צלחות, בתחתית שטוח
8	צינורות פלסטיק צנטריפוגה (15 מ)
9	פיפטות סרולוגית
10	תא חממה (37 ° C ו- 5% CO2)
11	ספסל צנטריפוגה
12	Microtiter קורא צלחת עבור מדידות צפיפות אופטית
13	פיפטה רב-ערוצי (200-20 μL)
14	Hemocytometer

טבלה 3: חומרים עבור שלב 3.

1. לפני המדידות, להכין את החומרים הרשומים בטבלה3.
   הערה: β-ההקסוזאמינידאז שוחרר MCs לאחר גירוי שלהם הידרוליזה p-nitrophenyl-אצטיל-D-גלוקוזאמין (pNAG) לתוך p-nitrophenol ו- N-acetyl-D-גלוקוזאמין. הכמות של β-ההקסוזאמינידאז לדוגמה הוא יחסי לסכום של p-nitrophenol זה יכול להיווצר. בסביבת pH גבוה של "לעצור את הפתרון", p-nitrophenol קיים במלואו deprotonated p-nitrophenolat, ניתן להבחין שלה ספיגת האור-405 ננומטר.
2. להכין הפתרון של Tyrode המכילה 130 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, CaCl 1.4 מ מ₂, MgCl 1 מ₂, 10 מ מ HEPES, גלוקוז 5.6 מ מ ו- BSA 0.1%. להתאים את ה-pH ל 7.4 עם 3 M NaOH.
3. הכינו את הפתרון פירוק על-ידי הוספת נפח 1% של טריטון X-100 הפתרון של Tyrode.
4. להכין את להפסיק פתרון מורכב 200 מ"מ גליצין ולהתאים את ה-pH ל 10.7 עם NaOH.
5. הכינו את הפתרון פתרון (4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) pNAG על ידי המסת pNAG 0.4 מ' בחומצת כדי ריכוז סופי של 4 מ מ.
6. לחשב את כמות התאים הדרושים וזמינותו (לבצע את הבדיקה ב כפילויות). השתמש 200,000 PMCs לכל טוב. השתמש בארות 2 כפקדי שלילי (פתרון של Tyrode ללא כל secretagogues כגון DNP או תרכובת 48/80) ו- 2 וולס כפקדי חיובי (הפתרון של Tyrode עם 10 מיקרומטר Ionomycin) עבור כל גנוטיפ.
7. להעביר את התאים לתוך שפופרת צנטרפוגה פלסטיק 15-mL, לכוונן את עוצמת הקול כדי 15 מ"ל עם הפתרון של Tyrode ו צנטריפוגה ב 200 x גרם 4 דק להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה פסטר, resuspend את התאים בפתרון של Tyrode 2 x 10⁶ תאים /mL.
8. העברת µL 100 של התליה תא לכל טוב צלחת טוב של V-התחתון 96-ובכן. להוסיף 25 µL של גירוי או פתרון בקרת מכל קידוח (על פי שיטת pipetting אילוסטרייטד איור 3א). דגירה התאים למשך 45 דקות-CO 37 ° C ו-5%₂.
9. לעצור את התגובה על ידי הצבת את הצלחת 96-ובכן בקרח במשך 5 דקות. לאחר מכן, centrifuge את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 120 x g. העברת µL 120 של תגובת שיקוע באמצעות פיפטה רב-ערוצי על צלחת 96-ובכן שטוח התחתונה ומניחים אותו על קרח. בזהירות להימנע מלגעת כדורי תא, אבל לגמרי מחוק לגמרי את תגובת שיקוע.
10. להוסיף µL 125 פירוק מאגר כדורי התא. דגירה כדורי תא עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, resuspend אותם לאחר הדגירה מאת חוזרות pipetting (כ- 5 פעמים).
11. פיפטה 25 µL של הפתרון pNAG (4 מ מ) ב הבארות הנדרש של צלחת חדשה של 96-ובכן שטוח התחתונה. הוסף 25 µL כל תגובת שיקוע הפתרון pNAG מוכן, כמו גם 25 µL של כל תא lysate.
12. דגירה של אצוות תגובה עבור h 1-37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, פיפטה µL 150 עצירה לפתרון כל טוב לעצור את התגובה.
13. לנתח את הצלחת עם קורא microplate באמצעות הגדרה כפולה באורך הגל ב 405 ננומטר עם הפניה 630 ננומטר על רקע אוטומטי חיסור. בתוכנית רכישה, סמן את התיבה "הפניה" ו "ספיגת" תוכנית יסוד בתפריט, בחר "630 ננומטר" מתוך הרשימה הנפתחת. אם הצפיפות האופטית של הדגימות הוא גבוה מדי, להכין דילול המתאים של המכשיר לפני remeasuring.
14. לחשב את אחוז β-ההקסוזאמינידאז שחרור לפי המשוואה הבאה:
    
    איפה שחרור [%] האחוזים של שחרור מסוים בטא-ההקסוזאמינידאז, [תגובת שיקוע] הוא הרקע מתוקן ספיגת תגובת שיקוע, [lysate] הוא הרקע מתוקן הקליטה התא המתאים lysate.

תוצאות

PMCs הם בודדו אותנו מהמתרחש פראי סוג 3 עכברים (C57BL/6N) על ידי שטיפה בקרום הבטן ואת עוד יותר בתרבית בינוני RPMI בתוספת עם FCS 20%, 1% עט-דלקת בנוכחות גורמי גדילה (IL-3-10 ng/mL) ו- SCF ב 30 ננוגרם למ"ל תחת סטרילי humidified תנאים- 37 ° C ו- 5% CO₂. המדיום השתנה בימים 2 ו- 9 לאחר הבידוד התא. המורפולוגיה תא ...

Discussion

דגמי MC יכול לשמש בהצלחה ללמוד MC degranulation, כימוטקסיס, הדבקות, כמו גם באשר להסבר תאיים איתות התמרה חושית המסלולים המעורבים הפעלה MC. יש חוקרים שימוש אנושי MCs מודלים, כגון קווים מונצחים (LAD2 ו- HMC1) או MCs אנושי הנגזר כבל דם ובתאים (CD133 +) ודם היקפיים ובתאים (CD34 +). אחרים יעדיפו מכרסמים MC מודלים, כגון מונצח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI Medium	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
Anti-DNP-Antibody	Sigma-Aldrich	D-8406
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
Compound 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	X100
4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell Imaging Chamber	Sigma-Aldrich	GBL635051
96-Well plate, v-shaped bottom	Corning	3896
96-Well plates, flat bottom	Greiner Bio-One	655180
Microtiter plate reader with "i-control" software	Tecan	Nano Quant, infinite M200 Pro
Flat bottom plate	Greiner Bio-One	655180
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62.547.254
Culture Flasks (25 cm)	Greiner Bio-One	69160
Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1	Menzel	CB00250RA1
Hemocytometer	VWR	631-0696
Inverted Microscope	Zeiss	Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil	Zeiss	440260-9900
HC Filter Set Fura 2	AHF	H76-521
CCD Camera	Zeiss	AxioCam MRm
Monochromatic Light Source	Sutter Instruments	Lambda DG-4
Imaging Acquisition Program	Zeiss	AxioVision 4.8.2
Gravity fed solution application system	Custom Made	4-channel
15 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62,554,502
Bench Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.0R