Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca2 +-imaging und Degranulation Assays

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu isolieren und kultivieren murinen peritonealen Mastzellen. Wir beschreiben auch zwei Protokolle für ihre funktionelle Charakterisierung: eine fluoreszierende Imaging der intrazellulären freien Ca^{2 +} Konzentration und eine Degranulation Assay anhand der kolorimetrischen Quantifizierung der veröffentlichten β-Hexosaminidase.

Zusammenfassung

Mastzellen (MCs), Rolle als Teil des Immunsystems, eine zentrale bei der Verteidigung der Gastgeber gegen mehrere Krankheitserreger und bei der Auslösung der allergischen Immunantwort. Die Aktivierung des MCs über die Vernetzung der Oberfläche IgE, hohe Affinität IgE-Rezeptoren (FcεRI) sowie durch die Stimulation von mehreren anderen Rezeptoren gebunden, initiiert den Aufstieg des freien intrazellulären Ca^{2 +} Levels ([Ca^{2 +}]_ich) Das fördert die Freisetzung von entzündlichen und allergischen Mediatoren. Die Identifizierung von molekularen Bestandteile dieser Signalwege beteiligt ist entscheidend für das Verständnis der Verordnung der MC-Funktion. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung von murinen Bindegewebe Typ MCs von peritoneal Lavage und Anbau von peritonealen MCs (PMCs). Kulturen von MCs aus verschiedenen Knockout-Maus-Modellen durch diese Methode darstellen einen sinnvoller Ansatz zur Identifizierung von Proteinen in MC Signalwege beteiligt. Darüber hinaus wir auch beschreiben ein Protokoll für die einzelne Zelle Fura-2 imaging wie eine wichtige Technik für die Quantifizierung von Ca^{2 +} Signalisierung in MCs. Fluoreszenz-basierte Überwachung [Ca^{2 +}]_ich ein zuverlässiges und gängigen Ansatz zur studieren Sie Ca^{2 +} Veranstaltungen, darunter Kalzium Shop betrieben Eintrag, die von größter Bedeutung für die MC-Aktivierung-Signalisierung. Für die Analyse von MC Degranulation beschreiben wir einen β-Hexosaminidase-Release-Assay. Die Höhe der β-Hexosaminidase in das Kulturmedium abgegeben wird als Degranulation Marker für alle drei verschiedenen sekretorischen Teilmengen in MCs. β-Hexosaminidase beschrieben durch seine Reaktion mit einem Colorigenic Substrat in leicht quantifizierbar sind ein Mikrotiter-Platte kolorimetrischen Probe. Diese hoch reproduzierbare Technik ist kostengünstiger und erfordert keine spezielle Ausrüstung. Das angegebene Protokoll zeigt insgesamt eine hohe Ausbeute von MCs typischen oberflächenmarker MC zum Ausdruck zu bringen, anzeigen typischen morphologischen und phänotypischen Merkmale der MCs und hoch reproduzierbare Reaktionen auf Secretagogues in Ca^{2 +}- Nachweis Bildgebung und Degranulation Assays.

Einleitung

MCs spielen eine herausragende Rolle bei angeborenen und erworbenen Immunantwort. Insbesondere MCs teilnehmen an der Tötung von Krankheitserreger wie Bakterien und Parasiten, und auch potentiell toxischen endogene Peptide oder Komponenten der Gifte (für Überprüfung siehe Galli Et Al. 2008¹) abgebaut. Die physiologische Rolle von MCs in angeborenen und der adaptiven Immunität ist Gegenstand hitziger Debatten. Daher erfordern zahlreiche Daten Diskrepanzen in den Studien mit verschiedenen MC-defizienten Maus-Modellen eine systematische Neubewertung der immunologischen Funktionen von MCs über Allergie². Reife MCs sind meistens in Geweben und Organen wie Darm, Haut und Lunge beschränkt und sind in der Regel nur in geringen Stückzahlen im Blut gefunden. MCs stammen aus hämatopoetischen Vorläufer, wie z. B. MC Stammväter, und füllen Sie ihre Differenzierung und Reifung in die Mikroumgebungen von fast allen vaskularisierte Gewebe¹. T-Cell-derived Factor Interleukin (IL)-3 fördert gezielt die Lebensfähigkeit, Proliferation und Differenzierung von pluripotenten Einwohner Maus MCs aus ihrer hämatopoetischen Vorläuferzellen³. Stem Cell Factor (SCF) entsteht durch strukturelle Zellen in den Geweben und spielt eine entscheidende Rolle in der MC-Entwicklung, überleben, Migration und Funktion⁴. Die Eigenschaften der einzelnen MCs können je nach ihrer Fähigkeit zu synthetisieren und verschiedenen Proteasen oder Proteoglykane zu speichern. Bei Mäusen sind die so genannten Bindegewebe-Typ MCs von Schleimhaut MCs entsprechend ihrer anatomischen Lokalisation, Morphologie und Inhalte von Heparin und Proteasen⁵unterscheiden.

In MCs, ein Anstieg von freien cytosolischen Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_ich) ist unentbehrlich für die Degranulation und Produktion von Eicosanoids sowie für die Synthese von Zytokinen und Aktivierung von Transkriptionsfaktoren in Reaktion auf Antigen und verschiedenen Secretagogues⁶. Eine nachgeschaltete Hauptziel dieser Reize ist Phospholipase C, die Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-Trisphosphate hydrolysiert. DAG aktiviert Proteinkinase C und IP3 gibt Ionen von Ca^{2 +} aus dem endoplasmatischen Retikulum frei. Raubbau an diesen Geschäften aktiviert Ca^{2 +} Zustrom durch Plasmamembran Ca^{2 +} Kanäle, was zu betriebenen Kalzium Eintrag (SOCE) speichern. Dieser Prozess wird hervorgerufen durch das Zusammenspiel von Ca^{2 +}-Sensor, Stromale Interaktion Molekül-1 (Stim1), in dem endoplasmatischen Retikulum mit Orai1⁷ sowie durch die Aktivierung von Transienten Rezeptor potenzielle kanonische (TRPC) Kanal Proteine (für Überprüfung siehe Freichel Et al. 2014-⁸) in der Plasmamembran.

Zur Untersuchung werden die physiologische Rolle dieser Kanäle, mehrere pharmakologische (Anwendung des Kanal-Blocker) oder gentechnische Ansätze in der Regel verwendet. Im letzteren Fall wird die Unterdrückung der Proteinexpression durch gezielte mRNA (Zuschlag) erreicht oder genomischer DNA mit globalen oder gewebespezifische⁹ löschen ein Exon Codierung eine Pore bilden Untereinheit eines Kanals (Knockout) bearbeiten. Die Verfügbarkeit eines Blockers mit ausreichender Spezifität für diese Kanäle beschränkt. Darüber hinaus der Knockdown Ansatz erfordert sorgfältige Kontrolle über seine Effektivität verwenden, z. B.., Western blot Analyse, und durch das Fehlen von spezifischen Antikörpern für die gezielte Kanal-Protein in vielen Fällen behindert wird. So ist die Verwendung von Knockout-Maus-Modellen nach wie vor als Goldstandard für eine solche Analyse betrachtet. Eine bevorzugte in Vitro Modell zur Untersuchung von MC-Funktionen ist der Anbau von PMCs, die isolierte ex Vivo als voll ausgereifte Population werden können (im Gegensatz zu differenzieren MCs in Vitro aus, zB., Knochenmarkzellen)¹⁰ . Im Vergleich zu dem Knochenmark abgeleitet MCs (BMMCs), die auch häufig verwendet werden, zu studieren, MC-Funktion in Vitro, die Stimulation der FcεRI und Beta-Hexosaminidase Release 8-fach und 100fach PMCs, bzw. erhöht. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von murinen PMCs, die es erlaubt, um zu erhalten, nach 2 Wochen der Kultivierung einer hohen Anzahl von reinen Bindegewebe MCs, ausreichend für die weitere Analyse geben.

Trotz der jüngsten Fortschritte in der Entwicklung und Anwendung von genetisch codierte Kalzium Indikatoren ist deren Nutzung noch durch Schwierigkeiten bei der Lieferung von Genen an Zielzellen, insbesondere in hoch spezialisierten Zellen wie primäre kultivierten MCs begrenzt. Darüber hinaus fehlt diese Gruppe von fluoreszierenden Indikatoren für [Ca^{2 +}]_ich Messungen noch ratiometrischen Farbstoffe mit einem hohen Dynamikumfang. Aus diesen Gründen ist die bevorzugte Methode für ratiometrischen [Ca^{2 +}]_ich Messung noch die Verwendung von fluoreszierenden Farbstoff "Fura-2"¹¹.

Derzeit die am häufigsten verwendete Ansatz für die Bewertung von MC-Aktivierung und Degranulation ist die Messung der Aktivität der β-Hexosaminidase. Β-Hexosaminidase, eine allergische Mediator ist eine MC Modul Komponenten, die in einem konstanten Verhältnis von MCs-¹²zusammen mit Histamin freigegeben ist. Β-Hexosaminidase ist leicht und präzise durch die Reaktion mit einem speziellen Substrat messbar erzeugt eine messbare Menge eines Colorigenic Produkts, das in einer Mikrotestplatte kolorimetrischen Probe leicht nachweisbar ist. In diesem Artikel wird eine Anwendung dieser Technik für die Analyse von PMCs Degranulation in Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen berichtet.

Aggregation von der hohen Affinität plasmalemmal IgE-Rezeptor (FcɛRI) wird im MCs eine vielseitige intrazellulären Signalweg führt zu einer Freisetzung von sekretorischen Granulat Inhalt in den extrazellulären Raum aktiviert. Neben den spezifischen Antigen, können viele andere Reize aktivieren MCs um vielfältige immunmodulatorische Mediatoren wie Ergänzung Anaphylatoxins freizugeben (zB., C3a und C5a)¹³, Vasokonstriktor Peptid Endothelin 1 (ET1)¹⁴ , als auch zahlreiche kationischen Substanzen und Drogen pseudoallergische Reaktionen zu provozieren (zB., Icatibant)¹⁵ durch Bindung an MRGPRX2¹⁶. Intrazelluläre Signalwege MRGPR-induzierte MCs Degranulation beteiligt sind schlecht im Vergleich zu FcɛRI-vermittelten intrazelluläre Signale gekennzeichnet; Diese Wege erst während der letzten paar Jahre¹⁷ nach der Rezeptor Identifikation¹⁶intensiv untersucht werden. Weitgehend, bleiben die Plasmamembran Ionenkanäle beteiligt Kalzium Eintrag gefolgt von MRGPRX2 Anregung verstanden werden. Daher der vorliegende Artikel konzentriert sich auch auf intrazellulären Calcium-Signalisierung und Degranulation der MCs mit MRGPR Agonisten stimuliert.

Protokoll

Alle tierische Verfahren wurden nach den deutschen Rechtsvorschriften Leitlinien zur Pflege und Verwendung von Labortieren (offiziell genehmigt durch das Regierungspräsidium Karlsruhe) durchgeführt.

1. PMC Isolierung und Kultivierung von intraperitoneale Lavage

1	Eis
2	10 mL Spritzen
3	27 G Nadeln
4	20 G Nadeln
5	Styropor-Block und Stifte
6	Röhrchen (50 mL Zentrifuge Kunststoffrohre)
7	70 % igem ethanol
8	RPMI Medium (Pre gekühlt und auf Eis gehalten)
9	PMC-Medium: RPMI Medium + 20 % FCS (fetalen Kälberserum) + 1 % Penicillin-Streptomycin Lösung (Pen-Strep)
10	Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung - DPBS (ohne Ca2 + und Mg2 +)
11	Kulturflaschen (25 cm)
12	Wachstumsfaktoren Lager Lösungen (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL)
13	Serologische Pipetten (10 mL)
14	Pipetten Spitzen steril (20-200 µL)
15	Hemocytometer
16	Bank-Zentrifuge
17	Scheren und Pinzetten
18	CO2 -Kammer für Mäuse
19	Offene steriler Haube
20	Steriler Haube geschlossen
21	Zelle Inkubator (37 ° C und 5 % CO2)
22	Pipetten (20-200 µL) übertragen

Tabelle 1: Materialien für die Schritt 1.

1. PMC-Isolierung durch intraperitoneale lavage
   1. Bereiten Sie vor der Zelle isoliert die Materialien, die in Tabelle 1aufgeführt.
   2. Verwenden Sie 8 bis 14 Wochen alten männlichen Mäusen für PMC-Isolierung. Einschläfern Sie eine Maus durch CO₂ Einatmen, und bestätigen Sie den Tod durch Verlust von Reflexen. Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol und befestigen Sie es an einem Schaumstoffblock mit Hilfe der Pins (dorsale Seite nach unten). Entfernen Sie die ventrale Haut der Maus mit einer stumpfen Kante Schere. Beschädigung der Bauchhöhle zu vermeiden.
      Hinweis: Wir verwenden in der Regel dieses Protokoll für Mäuse mit einem C57BL/6N Stamm genetischen Hintergrund.
   3. Injizieren Sie 7 mL eiskaltes RPMI Medium und 5 ml Luft in der Bauchhöhle mit einer 10 mL Spritze mit einer 27 G Nadel ausgestattet. Schieben Sie die Nadel vorsichtig in das Peritoneum und perforieren Sie keine Organe. Verwenden Sie einen Platz in der Region der epididymal Fett zur Verringerung des Risikos von einer Orgel-Perforation.
   4. Nach der Injektion schütteln Sie die Maus für 1 min peritoneale Zellen in das RPMI Medium lösen. Schütteln Sie die Maus nicht zu stark um schädigen die inneren Organe und verunreinigen die Bauchhöhle mit dem Blut zu vermeiden.
   5. Wiederverwenden Sie die 10-mL-Spritze, indem Sie mit eine neue Kanüle 20 G auszustatten. Verschieben Sie die inneren Organe auf der einen Seite durch Kippen der Schaumstoffblock und leichtes Klopfen sie auf der Bank, mittlere Aspiration von der anderen Seite zu erleichtern. 20 G Nadel, oben abgeschrägt und Aspirieren Sie die Flüssigkeit aus dem Bauch, langsam und vorsichtig (~0.5 mL/s), Verstopfung durch die inneren Organe zu vermeiden. Sammeln Sie so viel Flüssigkeit wie möglich (in der Regel 5 – 6 mL).
   6. Entfernen Sie die Nadel von der Spritze und übertragen Sie die gesammelten Zellsuspension in ein Sammelrohr auf Eis zu. Ein Probenröhrchen zu verwerfen, wenn es sichtbare Blut Verschmutzung gibt.
   7. Zentrifugieren Sie die Rohre mit der Zellsuspension bei ~ 300 X g für 5 min. Aspirieren Sie unter einer sterilen Haube überstand. Für jede Maus kombinieren die Probe Pellets in 4 mL kalt (4 – 10 ° C) PMC Medium und Übertragung der Zellsuspension auf einem 25 cm² Kultur Kolben. Fügen Sie die Wachstumsfaktoren IL-3 und SCF die Endkonzentrationen 10 ng/mL und 30 ng/mL, beziehungsweise. Legen Sie die Flasche mit der Zellen in einem Inkubator (37 ° C und 5 % CO₂) und inkubieren Sie ~ 48 h bis zum nächsten Verfahren.
2. PMC-Kultur
   1. Tag2 (~ 48 h nach Isolierung): mittlere Änderung
      1. Zum Entfernen Aspirieren der überstand und nicht-anhaftende Zellen (Erythrozyten und abgestorbene Zellen), das Medium aus der Flasche durch Platzierung einer PIPETTENSPITZE Pasteur am Rand des Kolbens und halten die Flasche fast horizontal. 4 mL vorgewärmten PMC Medium per Mausklick hinzufügen. Fügen Sie die Wachstumsfaktoren IL-3 (10 ng/mL) und SCF (30 ng/mL). Legen Sie die Flasche mit der Zellen in einem Inkubator (37 ° C und 5 % CO₂).
   2. 9. Tag: Zelle teilen
      1. Übertragen Sie die Zellsuspension aus der Zelle-Kultur-Flasche in ein 50 mL Kunststoff Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Küvette dreimal mit 10 mL vorgewärmt (37 ° C) Dulbecco den Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS), sammeln die Zellsuspension mit den freistehenden Zellen in der gleichen 50 mL Kunststoff Röhrchen Zentrifugieren. Zählen Sie die Zellkonzentration durch eine Hemocytometer und berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen zu.
      2. Die Zellsuspension bei ~ 300 X g für 5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt. Wiederherstellen Sie das Pellet in vorgewärmten PMC Medium (37 ° C), die Zelle Konzentration 1 x 10⁶ Zellen/mL zu erhalten. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine neue 25 cm² Kultur Kolben. Entsorgen Sie die alte Flasche mit Fibroblasten festhalten an der Unterseite.
      3. Fügen Sie die Wachstumsfaktoren IL-3 (10 ng/mL) und SCF (30 ng/mL), und legen Sie die Flasche mit der Zellen in einem Inkubator (37 ° C und 5 % CO₂).
   3. Tag 12 – 15: Handy-Messungen
      1. Keine Experimente mit Stimulation der Rezeptoren FcɛRI geplant, Vorbehandeln Sie die Zellen über Nacht mit 300 ng/mL des IgE Anti-DNP in standard Kulturmedium. Fahren Sie mit Schritt 2 oder Schritt 3.

(2) fluorometrisch intrazellulären freien Calcium-Konzentrationsmessung in PMCs

1. Bereiten Sie vor den Messungen die Materialien, die in Tabelle 2aufgeführt. Außerdem bereiten Sie ein Imaging-Setup bestehend aus: invertiert Fluoreszenzmikroskop; Ziel: 40 X / 1,3 Öl; Fura-2 Filter festlegen; CCD-Kamera; Erregung Lichtquelle; Imaging-Erwerb Programm; Schwerkraft zugeführt Lösung Anwendungssystem.

1	PMC (12 – 15 Tage alt) 1 x 106 Zellen/mL
2	Concanavalin A
3	Fura-2 Uhr
4	Pluronic F-127 20 % Lösung
5	Runde Abdeckung rutscht Gläser; Ø 25 mm; Nr. 1
6	DNP-HSA (Dinitrophenol-Human Serum Albumin) Stammlösung
7	Anti-DNP-Antikörper (IgE)-Stammlösung
8	Flache Bodenplatte (12 Brunnen)
9	Zusammengesetzte 48/80-Stammlösung
10	Decken auch Imaging-Kammern
11	Hemocytometer
12	Pipetten (20-200 µL) übertragen

Tabelle 2: Werkstoffe für Schritt 2.

2. Fura-2 bildgebende Vorbereitung
   1. Durchführen Sie einer Zellzahl unter Verwendung einer Hemocytometer und passen Sie die Zellkonzentration bis 1 x 10⁶ Zellen/mL. Teilen Sie die PMCs-Kolonien, indem sanft pipettieren (3 – 5 mal) die Zellsuspension mit einer PIPETTENSPITZE 1 mL.
   2. Bereiten Sie eine Ca^{2 +}-mit HEPES gepufferte Salzlösung (Ca^{2 +}- HBSS) bestehend aus 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES und 12 mM Glukose. Den pH-Wert 7,4 mit 3 M NaOH einstellen.
   3. Bereiten Sie Concanavalin A beschichtete Folien durch pipettieren 1 Tropfen Concanavalin A-Lösung (0,1 mg/mL in H₂O) auf jeweils 25 mm Runde Deckglas unter einer sterilen Kapuze. Lassen Sie die Tropfen auf der Cover-Zettel für mindestens 1 min, dann entfernen Sie die meisten der Lösung mit einer Pipette und lassen das Deckel rutscht an der Luft trocknen für 45 min. Drücken Sie vorsichtig das Concanavalin A behandelt Deckel rutscht auf der Kautschuk imaging Kammer (siehe Tabelle der Materialien) bis Sie legen um Mikroskopie imaging Kammern zu erhalten.
      Hinweis: Poly-L-Lysin beschichtete Folien können als Alternative verwendet werden.
   4. Auflösen der Ca^{2 +} Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 AM (1 mM) in Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Bewahren Sie diese Lösung vor Licht geschützt auf.
   5. Verdünnen Sie die Fura-2 AM-Stammlösung in Ca^{2 +}- HBSS, eine Endkonzentration von 5 µM um den "Laden-Puffer" vorzubereiten. Ergänzen Sie mit 5 µL/mL 20 % Pluronic F-127 in DMSO.
   6. Mix 500 µL "Loading Buffer" mit 500 µL Zellsuspension PMC. Pipette die Mischung in die bildgebenden Kammer und die Zellen für 20-30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
   7. Richten Sie die Schwerkraft zugeführt Anwendungssystem mit unterschiedlichen Lösungen gemäß dem Protokoll der Stimulation. Spritze 1 mit 40 mL Ca^{2 +}- HBSS Lösung ergänzen, Spritze 2 mit 40 mL Ca^{2 +}- HBSS Lösung enthaltend 100 ng/mL DNP, Spritze 3 mit 40 mL Ca^{2 +}- HBSS Lösung enthaltend 50 µg/mL Compound 48/80, 4 mit 40 mL Spritze nominell Ca^{2 +}-frei-HBSS Lösung und Spritze 5 mit 40 mL nominell Ca^{2 +}-frei-HBSS Lösung mit 2 µM Thapsigargin.
   8. Bereiten Sie ein 40 X High-Blende Öl eintauchen Ziel indem man einen kleinen Tropfen Immersionsöl darauf vor.
   9. Montieren Sie das Anwendungssystem auf der Bühne des inversen Mikroskop. Setzen der bildgebenden Kammer mit den geladenen Zellen im Anwendungssystem und sichern Sie es um Bewegung während der Aufnahme zu verhindern. Das transmittierte Licht schalten und die Zellen zu konzentrieren.
   10. Spülen Sie die Zellen dreimal mit Ca^{2 +}- HBSS Puffer mit der Schwerkraft-gefütterten Anwendungssystem.
   11. Inkubieren Sie die Zellen in Ca^{2 +}- HBSS für 5 min für Fura-2 AM de-Veresterung.
   12. Spülen Sie die Zellen noch einmal vor Beginn der Bildgebung, um potenziell entfernen sickerte Fluoreszenzfarbstoff.
3. Cell imaging
   1. Starten Sie das bildgebende Erwerb Programm in der physiologischen Akquisitionsmodus. Das Setup-Fenster zu öffnen, und passen Sie den Fokus und die optimale Erfassungszeit (sollten die gleiche Erregung mit 340 nm und 380 nm und in der Regel bewegt sich zwischen 50 – 150 ms).
      Hinweis: Minimierung die Exposition von Fura-2 geladenen Zelle Licht Immunofluoreszenz des Farbstoffs zu vermeiden.
   2. Bild ein Referenzbild, und markieren Sie die Zellen als Regionen von Interesse (ROI). Markieren Sie den letzten ROI in einem Gebiet wo keine Zellen vorhanden sind und definieren es als Hintergrund.
   3. Abzuschließen Sie die Installation, und starten Sie die Messung mit einem 5 s Abtastrate.
      Hinweis: Die Zellen werden abwechselnd mit beleuchtet werden das Anregungslicht von 340 nm und 380 nm und die emittierte Fluoreszenz (> 510 nm) wird mit der CCD-Kamera erfasst werden. Die Bilder der Fluoreszenz Signale F340 nm sowie F380 nm und das Verhältnis (F340 nm/F380 nm) werden in drei Fenstern angezeigt. Die Charts von zeitlichen Verlauf der einzelnen ROIs Fluoreszenzintensität bedeutet Werte auch ständig angezeigt werden.
   4. Fügen Sie Lösungen auf die richtige Zykluszahl nach der Form des Experiments:
      1. Maßnahme, die Antigen-induzierte Höhe [Ca^{2 +}]_ichwie in Abbildung 2A, 2 bdargestellt, gelten Sie die Spritze 2-Lösung nach Zyklus 20 und stoppen der Aufnahme nach Zyklus 150.
      2. Zur Messung der Compound 48/80-induzierte Höhe [Ca^{2 +}] auftragen_i, wie in Abbildung 2C, dargestellt die Spritze 3 Lösung nach Zyklus 20 und stoppen der Aufnahme nach Zyklus 150.
      3. Um die Höhe der [Ca^{2 +}]_ich hervorgerufen durch SOCE, Messen wie in Abbildung 2Ddargestellt, gelten Sie die Spritze 4 Lösung nach Zyklus 10, wenden Sie die Spritze 5-Lösung nach Zyklus 70, wenden Sie die Spritze 4 Lösung nach Zyklus 120, wenden Sie die Spritze 1 Lösung nach Zyklus 150, und stoppen Sie die Aufnahme nach Zyklus 220.
   5. Nach Beendigung der Mess, umwandeln Sie die Ergebnisse in einem Ratio-Tabelle enthält die gemessenen Intensitäten für Erregung Wellenlängen mit und ohne Untergrundkorrektur sowie die Verhältniswerte mit und ohne Untergrundkorrektur für jeden ROI und jedes Mal Messpunkt. Im Erwerb Programm, drücken Sie nacheinander die Tasten: "Start-Cutter", "alle markieren", "alle konvertieren", "Physiologie Messungen", "Ok,"Ok". Speichern Sie die Dateien als Tabellen und Bild-Stacks für Offline-Analyse.

(3) Beta-Hexosaminidase Release Messung in PMCs

1	PMC (12 – 15 Tage alt) 1 x 106 Zellen/mL
2	Anti-DNP-Antikörper (IgE)-Stammlösung
3	DNP-HSA-Stammlösung
4	Zusammengesetzte 48/80-Stammlösung
5	Ionomycin
6	96-Well-Platte, v-förmigen Boden
7	96-Well-Platten, flachen Boden
8	Kunststoff-Zentrifuge Röhren (15 mL)
9	Serologische Pipetten
10	Zelle Inkubator (37 ° C und 5 % CO2)
11	Bank-Zentrifuge
12	Mikrotiter-Platte-Reader für optische Dichtemessungen
13	Mehrkanal-Pipette (20-200 μl)
14	Hemocytometer

Tabelle 3: Materialien für Schritt 3.

1. Bereiten Sie vor den Messungen die in Tabelle 3aufgeführten Materialien.
   Hinweis: β-Hexosaminidase aus MCs entlassen, nachdem ihre Anregung hydrolysiert p-Nitrophenyl-Acetyl-D-Glucosamin (pNAG) in p-Nitrophenol und N-Acetyl-D-Glucosamin. Die Höhe der β-Hexosaminidase in der Probe ist proportional zur Menge des p-Nitrophenol, die gebildet wird. In einem Umfeld hoher pH-Wert von "Stop Solution" p-Nitrophenol existiert als vollständig deprotonierten p-Nitrophenolat und detektiert werden, durch seine leichte Extinktion bei 405 nm.
2. Bereiten Sie Tyrode Lösung mit 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,4 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 5,6 mM Glukose und BSA 0,1 %. Den pH-Wert 7,4 mit 3 M NaOH einstellen.
3. Bereiten Sie die Lyse-Lösung durch Zugabe von einem 1 % Volumen von Triton x-100 die Tyrode-Lösung.
4. Bereiten Sie die Stopplösung bestehend aus 200 mM Glycin und passen Sie den pH-Wert auf 10.7 mit NaOH.
5. Bereiten Sie die pNAG-Lösung (4-Nitrophenyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) durch Auflösen von pNAG in 0,4 M Zitronensäure, eine Endkonzentration von 4 mM.
6. Berechnen Sie die Menge der Zellen benötigt für den Assay (führen Sie den Test in zweifacher Ausfertigung). Verwenden Sie 200.000 PMCs pro Bohrloch. Verwenden Sie 2 Brunnen als Negativkontrollen (Tyrode Lösung ohne irgendwelche Secretagogues wie DNP oder zusammengesetzte 48/80) und 2 Brunnen als Positivkontrollen (Tyrode Lösung mit 10 µM Ionomycin) für jeden Genotyp.
7. Die Zellen in einer 15 mL Kunststoff Zentrifugenröhrchen zu übertragen, stellen Sie die Lautstärke auf 15 mL mit Tyrode Lösung und Zentrifugieren bei 200 X g für 4 min. Überstands mit einer Pasteurpipette entfernen und Aufschwemmen der Zellen in Tyrodes-Lösung, 2 x 10⁶ Zellen /mL.
8. Übertragen Sie 100 µL Zellsuspension pro Bohrloch auf einer 96-Well-V-Boden-well-Platte. Geben Sie 25 µL Stimulation oder Kontrolllösung in jeder (nach dem pipettieren Schema in Abbildung 3dargestellt). Inkubieren Sie die Zellen für 45 min bei 37 ° C und 5 % CO₂.
9. Die Reaktion zu stoppen, indem man die 96-Well-Platte für 5 min auf Eis. Dann Zentrifugieren Sie die Platte bei 4 ° C für 4 min bei 120 X g. 120 µL des Überstands mit einer Mehrkanal-Pipette auf eine flach-Boden-96-Well-Platte zu übertragen und auf Eis legen. Berühren Sie vorsichtig nicht die Zelle Pellets, aber Aspirieren Sie völlig überstand.
10. Die Zelle Pellets 125 µL Lyse Puffer hinzufügen. Inkubieren Sie die Zelle-Pellets für 5 min bei Raumtemperatur und Aufschwemmen sie nach der Inkubation durch wiederholte pipettieren (ca. 5 mal).
11. Pipette 25 µL der pNAG-Lösung (4 mM) in den erforderlichen Vertiefungen einer neuen flach-Boden 96-Well-Platte. 25 µL aus jeder überstand die vorbereiteten pNAG Lösung sowie 25 µL jeder Zelle lysate hinzufügen.
12. Inkubieren Sie die Reaktion Chargen für 1 h bei 37 ° c Nach der Inkubation pipette 150 µL Stopplösung in jede Vertiefung, die Reaktion zu stoppen.
13. Analysieren Sie die Platte mit einer Mikrotestplatte Leser mit einer Dual-Wellenlänge-Einstellung bei 405 nm mit Referenz 630 nm für automatische Hintergrundabzug. Im Übernahme-Programm aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Reference" und wählen Sie im Menü "Extinktion" Programm Element "630 nm" aus der Dropdown-Liste. Wenn die optische Dichte der Proben zu hoch ist, bereiten Sie eine entsprechende Verdünnung der Sonde vor nachmessen.
14. Berechnen Sie den Anteil der β-Hexosaminidase Freigabe nach der folgenden Gleichung:
    
    Release [%] Prozent des spezifischen Beta-Hexosaminidase Release ist, ist ein [überstand] Hintergrund Absorption des Überstands korrigiert, und [lysate] ist der Hintergrund Absorption von der entsprechenden Zelle lysate korrigiert.

Ergebnisse

PMCs wurden von 3 Wildtyp-Mäusen (C57BL/6N) durch intraperitoneale Lavage isoliert und weiter kultiviert in RPMI Medium ergänzt mit 20 % FCS und 1 % befeuchtet Pen-Strep in Anwesenheit von Wachstumsfaktoren (IL-3 bei 10 ng/mL) und SCF bei 30 ng/mL unter sterilen Bedingungen in 37 ° C und 5 % CO₂. Das Medium wurde an den Tagen 2 und 9 nach der Isolierung der Zelle geändert. Die Zellmorphologie wurde analysiert mit Licht DIC Bildgebung (siehe Abbildung 1<...

Diskussion

MC Modelle können erfolgreich zur Untersuchung MC Degranulation, Chemotaxis, Haftung, sowie intrazelluläre Signaltransduktion Signalwege MC Aktivierung beteiligt zu erhellen. Einige Forscher Verwendung menschlicher MCs-Modelle, wie verewigt Linien (LAD2 und HMC1) oder menschliche MCs aus Cord abgeleitet blood Vorläuferzellen (CD133 +) und Vorläuferzellen des peripheren Blutes (CD34 +). Andere bevorzugen Nagetier MC Modelle, wie z. B. verewigt (Ratte basophile Leukämie RBL - 2H 3 MC Linie) oder primäre kultiviert (M...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI Medium	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
Anti-DNP-Antibody	Sigma-Aldrich	D-8406
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
Compound 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	X100
4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell Imaging Chamber	Sigma-Aldrich	GBL635051
96-Well plate, v-shaped bottom	Corning	3896
96-Well plates, flat bottom	Greiner Bio-One	655180
Microtiter plate reader with "i-control" software	Tecan	Nano Quant, infinite M200 Pro
Flat bottom plate	Greiner Bio-One	655180
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62.547.254
Culture Flasks (25 cm)	Greiner Bio-One	69160
Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1	Menzel	CB00250RA1
Hemocytometer	VWR	631-0696
Inverted Microscope	Zeiss	Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil	Zeiss	440260-9900
HC Filter Set Fura 2	AHF	H76-521
CCD Camera	Zeiss	AxioCam MRm
Monochromatic Light Source	Sutter Instruments	Lambda DG-4
Imaging Acquisition Program	Zeiss	AxioVision 4.8.2
Gravity fed solution application system	Custom Made	4-channel
15 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62,554,502
Bench Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.0R