Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca2 +-imagens e ensaios de degranulação

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar os mastócitos peritoneais murino. Também descrevemos dois protocolos para a sua caracterização funcional: uma imagem fluorescente de enciclopédia Ca^{2 +} concentração intracelular e um ensaio de degranulação baseado na quantificação colorimétrica de β-hexosaminidase a liberado.

Resumo

Mastócitos (MCs), como parte do sistema imunológico, um papel fundamental na defesa do hospedeiro contra vários patógenos e no início da resposta imune alérgica. A ativação de MCs através do cross-linking de superfície IgE ligado ao receptor de IgE de alta afinidade (FcεRI), bem como através da estimulação de vários outros receptores, inicia a ascensão do livre intracelular Ca^{2 +} nível ([Ca^{2 +}]_eu) que promove a liberação de mediadores inflamatórios e alérgicos. A identificação dos constituintes moleculares envolvidos nessas vias de sinalização é crucial para a compreensão da regulação da função MC. Neste artigo, descrevemos um protocolo para o isolamento do tipo murino tecido conjuntivo MCs pela lavagem peritoneal e cultivo de MCs peritoneais (EPM). Culturas de MCs de vários modelos de rato nocaute por esta metodologia representam uma abordagem útil para a identificação das proteínas envolvidas na MC vias de sinalização. Além disso, podemos também descrever um protocolo para unicelulares Fura-2 de imagens como uma técnica importante para a quantificação de Ca^{2 +} sinalização no MCs. baseada em fluorescência monitoramento de [Ca^{2 +}] é um confiável e comumente usado abordagem estudo de Ca^{2 +} sinalização de eventos, incluindo a entrada de cálcio operada a loja, que é de extrema importância para a ativação do MC. Para a análise de MC degranulação, descrevemos um ensaio de liberação de β-hexosaminidase. A quantidade de β-hexosaminidase lançado no meio de cultura é considerada como um marcador de degranulação para todos os três diferentes secretoras subconjuntos descrito no MCs. β-hexosaminidase facilmente pode ser quantificado pela sua reação com um substrato de colorigenic em um ensaio colorimetric da placa da microplaca. Esta técnica altamente reprodutível é cost-effective e exige nenhum equipamento especializado. No geral, o protocolo fornecido demonstra um alto rendimento de MCs expressando marcadores de superfície típicas MC, exibindo características fenotípicas e morfológicas típicas da MCs e demonstrando respostas altamente reprodutíveis para secretagogues de Ca^{2 +}- ensaios de imagem e degranulação.

Introdução

MCs desempenham um papel proeminente durante respostas de imune inatas e adquiridas. Especificamente, MCs participarem na morte de patógenos, como bactérias e parasitas e também degradam peptídeos endógenos potencialmente tóxicos ou componentes de venenos (para revisão, consulte Galli et al . 2008¹). O papel fisiológico de MCs na inata e imunidade adaptativa é objecto de debate acalorado. Portanto, as inúmeras discrepâncias de dados nos estudos realizados com diferentes modelos de rato MC-deficientes exigem uma reavaliação sistemática de funções imunológicas de MCs além de alergia². MCs maduros são localizadas principalmente em tecidos e órgãos como a pele, pulmão e intestino e normalmente são encontrados apenas em pequenas quantidades no sangue. MCs derivam de precursores hematopoiéticos, como progenitores de MC e completar a sua diferenciação e maturação no microambiente que de quase todos os tecidos vascularizados¹. Fator derivado de T-células interleucina (IL) -3 promove seletivamente a viabilidade, proliferação e diferenciação de uma população de pluripotentes de rato MCs de seus progenitores hematopoiéticos³. Fator de célula-tronco (SCF) é produzido por células estruturais nos tecidos e desempenha um papel crucial no desenvolvimento da MC, sobrevivência, migração e função⁴. As propriedades de MCs individuais podem variar dependendo de sua capacidade de sintetizar e armazenar várias proteases ou proteoglicanos. Nos ratos, os tipo de tecido conjuntivo chamados MCs são distintos dos MCs da mucosa de acordo com sua localização anatômica, morfologia e conteúdo de heparina e proteases⁵.

No MCs, um aumento de livre citosólico Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_eu) é indispensável para a degranulação e a produção de eicosanoides, bem como para a síntese de citocinas e a ativação de fatores de transcrição em resposta ao antígeno e vários secretagogues⁶. Um grande alvo a jusante estes estímulos é a fosfolipase C que hidrolisa fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato diacilglicerol (DAG) e inositol 1, 4,5-triphosphate. DAG ativa a proteína quinase C e IP3 libera íons de Ca^{2 +} do retículo endoplasmático. Esgotamento destas lojas ativa Ca^{2 +} fluxo através da membrana plasmática Ca^{2 +} canais, levando para armazenar a entrada de cálcio operados (SOCE). Este processo é evocado através da interação do Ca^{2 +}-sensor, estromais interação molécula-1 (Stim1), no retículo endoplasmático com Orai1⁷ , bem como através da ativação de canal potencial de (TRPC) canônico transitória do receptor proteínas (para revisão, ver Freichel et al . 2014⁸) na membrana plasmática.

Para estudar o papel fisiológico desses canais, vários farmacológicos (aplicação de bloqueadores dos canais) ou abordagens genéticas são normalmente usadas. Neste último caso, supressão da expressão da proteína é alcançado pela segmentação do mRNA ("knockdown") ou edição de DNA genômico com exclusão global ou tecido-específica⁹ de um exon codificação um poro formando a subunidade de um canal (nocaute). A disponibilidade de um bloqueador com especificidade suficiente para estes canais é limitada. Além disso, a abordagem "knockdown" requer controle cuidadoso de sua efetividade, usando, por exemplo., Western blot análise e é dificultado pela indisponibilidade de anticorpos específicos para a proteína do alvo do canal em muitos casos. Assim, o uso de modelos de rato nocaute ainda é considerado como o padrão ouro para tal análise. Um modelo preferencial em vitro para a investigação das funções do MC é o cultivo da EPM que pode ser isolada ex vivo como uma população totalmente madura (em oposição a diferenciar MCs em vitro de, por exemplo., células da medula óssea)¹⁰ . Em comparação com MCs derivada de medula óssea (BMMCs), que também são comumente usados para estudar MC função em vitro, a estimulação de FcεRI e beta-hexosaminidase lançamento é aumento 8-fold e 100-fold na EPM, respectivamente. Neste artigo, descrevemos um método de isolamento e cultivo de murino PMCs, que permite para obter após 2 semanas de cultivo um elevado número de puro tecido conjuntivo digite MCs, suficientes para uma análise mais aprofundada.

Apesar dos recentes progressos no desenvolvimento e aplicação de indicadores de cálcio geneticamente codificado, seu uso é ainda limitado por dificuldades na entrega de genes nas células-alvo, especificamente, em células altamente especializados como principais culturas MCs. Além disso, este grupo de indicadores fluorescentes para [Ca^{2 +}]_eu medições ainda carece de corantes ratiometric com uma alta gama dinâmica. Por estas razões, o método preferido para a medição ratiometric [Ca^{2 +}]_eu ainda é o uso do corante fluorescente "Fura-2"¹¹.

Atualmente, os mais usados abordagem para a avaliação da ativação de MC e degranulação é a medição da atividade de β-hexosaminidase. Β-hexosaminidase, um mediador alérgico, é um dos componentes do grânulo de MC que é co lançado com histamina em proporção constante de MCs¹². Β-hexosaminidase pode ser prontamente e com precisão medido através de sua reação com um substrato específico, que produz uma quantidade mensurável de um produto de colorigenic que é facilmente detectável em um ensaio colorimétrico de microplacas. Neste artigo, é relatada uma aplicação desta técnica de análise de degranulação PMCs em resposta a uma variedade de estímulos.

Agregação de receptor de IgE plasmalemmal de alta afinidade (FcɛRI) ativa no MCs versátil via de sinalização intracelular, levando a uma liberação do conteúdo do grânulo secretor no espaço extracelular circundante. O antígeno específico, além de muitos outros estímulos podem ativar MCs para liberar um diversificado leque de mediadores de imunomoduladores, como anafilatoxinas do complemento (ex., C3a e C5a)¹³, a vasoconstritor peptídeo endotelina 1 (ET1)¹⁴ , como bem como numerosas substâncias catiônicas e drogas provocando reações pseudoallergic (EG., Icatibanto)¹⁵ por ligação a MRGPRX2¹⁶. Vias de sinalização intracelulares envolvido na degranulação induzida por MRGPR MCs caracterizam-se mal em comparação com FcɛRI mediada por sinalização intracelular; essas vias só começaram a ser estudada intensamente durante os últimos poucos anos¹⁷ após o receptor identificação¹⁶. Em grande parte, os canais iônicos de membrana plasmática envolvidos na entrada de cálcio, seguida de estimulação MRGPRX2 permanecem para ser compreendido. Portanto, o presente artigo centra-se na sinalização intracelular do cálcio e degranulação de MCs estimulada com agonistas MRGPR.

Protocolo

Todos os animais procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes da legislação alemã para cuidados e uso de animais de laboratório (oficialmente aprovado pelo Conselho regional de Karlsruhe).

1. PMC isolamento e cultivo por lavagem Intraperitoneal

1	Gelo
2	seringas de 10 mL
3	Agulhas 27 G
4	Agulhas de 20 G
5	Pinos e blocos de isopor
6	Tubos de colheita (tubos de centrífuga plástico de 50 mL)
7	etanol a 70%
8	Meio RPMI (pré refrigeradas e mantidas no gelo)
9	PMC médio: Meio RPMI + 20% FCS (soro Fetal da panturrilha) + 1% solução de estreptomicina penicilina (Pen-Strep)
10	Tampão fosfato de Dulbecco salino - DPBS (sem o Ca2 + e Mg2 +)
11	Frascos de cultura (25 cm)
12	Soluções de ações de fatores de crescimento (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL)
13	Pipetas (10ml)
14	Pontas de pipetas estéreis (20 a 200 µ l)
15	Hemocytometer
16	Centrífuga de bancada
17	Tesoura e pinça
18	Câmara de CO2 para ratos
19	Capô aberto de estéril
20	Fechado estéril capa
21	Incubadora de célula (37 ° C e 5% CO2)
22	Pipetas de transferência (20 a 200 µ l)

Tabela 1: Materiais para a etapa 1.

1. Isolamento de PMC pela lavagem intraperitoneal
   1. Antes o isolamento de célula, prepare os materiais listados na tabela 1.
   2. Use 8 a 14 semanas de ratos masculinos para isolamento do PMC. Eutanásia em um rato por inalação de CO₂ e confirmar a morte por perda de reflexos. Pulverize o mouse com 70% de etanol e corrigi-lo em um bloco de espuma usando pinos (lado dorsal para baixo). Retire a pele ventral do mouse usando a tesoura de ponta romba. Evite danificar a cavidade peritoneal.
      Nota: Nós usamos normalmente este protocolo para ratos com um fundo genético de estirpe C57BL/6N.
   3. Injete 7 mL do meio RPMI gelado e 5 ml de ar na cavidade peritoneal, utilizando uma seringa de 10 mL, equipada com uma agulha 27G. Empurre a agulha cuidadosamente no peritônio e não perfurar a nenhum órgão. Use um ponto na região da gordura epidídimo para reduzir o risco de uma perfuração de órgão.
   4. Após a injeção, aperte o mouse por 1 min desanexar peritoneais células entram no meio RPMI. Não agite o mouse também fortemente, para evitar danificar os órgãos internos e contaminando a cavidade peritoneal com o sangue.
   5. Reutilize a seringa de 10 mL, equipando-o com uma nova cânula de 20 G. Deslocar os órgãos internos para um lado, pela inclinação do bloco de espuma e batendo-lhe suavemente no banco para facilitar a aspiração média do outro lado. Inserir uma agulha 20g, bisel para cima e aspirar o fluido no abdômen, devagar e com cuidado (~0.5 mL/s) para evitar entupimentos pelos órgãos internos. Recolha todo o líquido possível (tipicamente 5-6 mL).
   6. Retire a agulha da seringa e transferir a suspensão de células coletadas em um tubo de coleta no gelo. Descarte um tubo de amostra se houver contaminação do sangue visível.
   7. Centrifuga os tubos com a suspensão de eritrócitos a ~ 300 x g por 5 min. Sob uma capa esterilizada Aspire o sobrenadante. Para cada rato, combinar as pelotas de amostra em 4 mL de frio (4 a 10 ° C) médio de PMC e a suspensão de células de transferência para um balão de cultura 25 cm² . Adicione os fatores de crescimento IL-3 e SCF para a concentrações finais 10 ng/mL e 30 ng/mL, respectivamente. Coloque o frasco que contém as células em uma incubadora (37 ° C e 5% CO₂) e incube por ~ 48 h, até o próximo procedimento.
2. Cultura do PMC
   1. Dia 2 (~ 48 h após isolamento): mudança média
      1. Para remover as células do sobrenadante e não-aderente (hemácias e células mortas), Aspire o meio do recipiente, colocando uma ponta de pipeta Pasteur na borda do frasco e segurando o balão quase horizontalmente. Adicione 4 mL de meio de PMC pré-aquecido por rato. Adicionar os fatores de crescimento, IL-3 (10 ng/mL) e SCF (30 ng/mL). Coloque o frasco que contém as células em uma incubadora (37 ° C e 5% CO₂).
   2. Dia 9: Célula dividindo
      1. Transferi a suspensão de células de balão de cultura de células em um tubo de centrífuga plástico de 50 mL. Lavar o balão três vezes com fosfato salino do 10ml pré aquecido (37 ° C) Dulbecco (DPBS), coletando a suspensão de células com as células destacadas no mesmo 50 mL plástico tubo de centrifugação. Contar a concentração de células por um hemocytometer e calcular o número total das células.
      2. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a ~ 300 x g por 5 min e aspirar o sobrenadante. Recupere a pelota médio pré-aquecido e PMC (37 ° C) para obter a célula concentração 1 x 10⁶ células/mL. Transferi a suspensão de células para um novo frasco de cultura² 25 cm. Descarte o frasco velho com fibroblastos aderindo ao fundo.
      3. Adicionar os fatores de crescimento, IL-3 (10 ng/mL) e SCF (30 ng/mL) e coloque o frasco que contém as células em uma incubadora (37 ° C e 5% CO₂).
   3. Dias 12 – 15: medições de célula
      1. Se quaisquer experimentos com estimulação dos receptores FcɛRI são planejados, pré-tratamento das células durante a noite com 300 ng/mL de IgE anti-DNP em meio de cultura padrão. Prossiga com a etapa 2 ou etapa 3.

2. medição de concentração fluorométrica de cálcio livre intracelular em EPM

1. Antes as medições, prepare os materiais listados na tabela 2. Além disso, preparar uma configuração de imagem consiste em: microscópio de fluorescência invertido; Objectivo: 40 X / 1,3 de óleo; Fura 2 filtro definido; Câmera do CCD; Fonte de luz de excitação; Programa de aquisição de imagem; Gravidade alimentados com sistema de aplicação de solução.

1	PMC (12 – 15 dias de idade) 1 x 106 células/mL
2	Concanavalina A
3	Fura-2h
4	Solução a 20% Pluronic F-127
5	Lamínulas óculos redondos; ø 25 mm; N. º 1
6	Solução-mãe de DNP-HSA (albumina de soro humano-dinitrofenol)
7	Solução anti-DNP-anticorpos (IgE)
8	Placa de fundo plano (12 cavidades)
9	Solução de reserva composta 48/80
10	Cubra bem imagem Chambers
11	Hemocytometer
12	Pipetas de transferência (20 a 200 µ l)

Tabela 2: Materiais para a etapa 2.

2. Preparação de imagem fura-2
   1. Realizar uma contagem de células usando um hemocytometer e ajustar a concentração de células a 1 x 10⁶ células/mL. Dividi as colônias PMCs pipetando suavemente (3 a 5 vezes) a suspensão de células com uma ponta de pipeta de 1 mL.
   2. Preparar um Ca^{2 +}-contendo HEPES sal solução tampão (Ca^{2 +}- HBSS) composto de 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM MgCl₂, 10mm HEPES e glicose de 12 mM. Ajuste o pH para 7,4 com 3 M de NaOH.
   3. Preparar a Concanavalina A corrediças revestidas por pipetagem 1 gota de solução Concanavalina A (0,1 mg/mL em H₂O) em cada 25 mm redondo tampa vidro sob uma capa de estéril. Deixe as gotas sobre as lamínulas pelo menos 1 min, em seguida, remover a maioria da solução com uma pipeta e deixe as lamínulas secar por 45 min. Pressione cuidadosamente as Concanavalina A tratados lamínulas sobre a borracha de câmara de imagem (consulte a Tabela de materiais) até Eles atribuem para obter microscopia câmaras de imagem.
      Nota: Slides de poli-L-Lysine revestido podem ser usados como uma alternativa.
   4. Dissolver o corante^{2 +} Ca fluorescente Fura-2 AM (1 mM) em dimetilsulfóxido (DMSO). Guarde esta solução protegida da luz.
   5. Diluir o Fura-2 solução em Ca^{2 +}AM - HBSS a uma concentração final de 5 µM para preparar o amortecedor do carregamento do"". Suplemento com 5 µ l/mL de 20% pluronic F-127 em DMSO.
   6. Mix de 500 µ l do buffer"carregando" com 500 µ l de suspensão de células o PMC. Pipetar a mistura para a câmara de imagem e incube as celulas por 20-30 min à temperatura ambiente no escuro.
   7. Configure a gravidade alimentada com sistema de aplicação com diferentes soluções de acordo com o protocolo de estimulação. Suplemento seringa 1 com 40 mL de solução de Ca^{2 +}- HBSS, 2 com 40 mL de Ca^{2 +}- HBSS solução contendo 100 ng/mL DNP a seringa, seringa 3 com 40 mL de Ca^{2 +}- HBSS solução contendo 50 µ g/mL composto 48/80, seringa 4 com 40 mL de nominalmente Ca^{2 +}-livre-solução HBSS e seringa 5 com 40 mL de nominalmente Ca^{2 +}-livre-solução HBSS contendo 2 µM Thapsigargin.
   8. Prepare um objectivo de imersão de óleo de alta-abertura X 40, colocando uma pequena gota de óleo de imersão sobre ele.
   9. Monte o sistema de aplicação no palco do microscópio invertido. Coloque a câmara de imagem com as pilhas carregadas no sistema de aplicação e fixá-lo para evitar movimento durante a gravação. Ligue a luz transmitida e concentrar as células.
   10. Enxague as células três vezes com Ca^{2 +}- HBSS buffer usando o sistema de aplicação de gravidade-alimentado.
   11. Incube as celulas em Ca^{2 +}- HBSS por 5 min para Fura-2 esterificação de AM.
   12. Enxagúe as células mais uma vez antes de iniciar a geração de imagens remover qualquer potencialmente vazou tintura fluorescente.
3. Imagem latente da pilha
   1. Inicie o programa de aquisição de imagens no modo de aquisição fisiológica. Abra a janela de configuração e ajustar o foco e o tempo de aquisição ideal (que deve ser o mesmo para a excitação com 340 nm e 380 nm e normalmente varia entre 50-150 ms).
      Nota: Minimizar a exposição do Fura-2 célula carregada à luz para evitar fotobranqueamento do corante.
   2. Uma foto de referência da imagem e marcar as células como regiões de interesse (ROI). Marca o último ROI em uma área onde não há células estão presentes e definem-la como plano de fundo.
   3. Complete a instalação e iniciar a medição com uma taxa de aquisição de s 5.
      Nota: As células serão alternadamente iluminadas com a luz de excitação de 340 nm e 380 nm e a fluorescência emitida (> 510 nm) serão coletados usando a câmera do CCD. As imagens de fluorescência sinais F340 nm e F380 nm, bem como a relação (F340 F380/nm nm) serão exibidas em três janelas. Os gráficos do curso do tempo da intensidade de fluorescência de ROIs individual quer dizer valores serão exibidos também continuamente.
   4. Adicione soluções com o número de ciclo adequado de acordo com o desenho do experimento:
      1. A medida induzida pelo antigénio elevação de [Ca^{2 +}]_eu, conforme ilustrado na Figura 2A, 2B, aplica a solução de seringa 2 após ciclo 20 e parar a gravação depois ciclo 150.
      2. Para medir a elevação induzida pelo composto 48/80 de [Ca^{2 +}]_i,como ilustrado na Figura 2C, aplicar a solução de seringa 3 após ciclo 20 e parar a gravação depois ciclo 150.
      3. Para medir a elevação da [Ca^{2 +}]_eu evocada por SOCE, conforme ilustrado na Figura 2D, aplicar a solução de seringa 4 após o ciclo 10, aplicar a solução de seringa 5 após ciclo 70, aplicar a solução de seringa 4 após ciclo 120, Aplique a solução de seringa 1 após ciclo 150 e parar a gravação após ciclo de 220.
   5. Depois de terminar a medição, converter os resultados em uma tabela de relação contendo as intensidades medidas para comprimentos de onda da excitação com e sem correção de fundo, bem como os valores de relação com e sem correção de fundo para cada ROI e cada ponto de medição do tempo. No programa de aquisição, consecutivamente, pressione os botões: "cortador de início", "marcar todos", "converter tudo", "medições de fisiologia", "Okey,"Okey". Salve os arquivos como tabelas e pilhas de imagem para análise off-line.

3. beta-hexosaminidase lançamento medição em EPM

1	PMC (12 – 15 dias de idade) 1 x 106 células/mL
2	Solução anti-DNP-anticorpos (IgE)
3	Solução-mãe de DNP-HSA
4	Solução de reserva composta 48/80
5	Ionomycin
6	Placa de 96 poços, fundo em forma de v
7	Placas de 96 poços, fundo chato
8	Tubos de centrífuga plástico (15 mL)
9	Pipetas
10	Incubadora de célula (37 ° C e 5% CO2)
11	Centrífuga de bancada
12	Leitor de placas de microtitulação para medições de densidade óptica
13	Pipeta multicanal (20 – 200 μL)
14	Hemocytometer

Tabela 3: Materiais para a etapa 3.

1. Antes as medições, prepare os materiais listados na tabela 3.
   Nota: lançado de MCs após sua estimulação β-hexosaminidase hidrolisa p-nitrofenil-acetil-D-glucosamina (pNAG) p-nitrofenol e N-acetil-D-glucosamina. A quantidade de β-hexosaminidase na amostra é proporcional à quantidade de p-nitrofenol que será formada. Em um ambiente de pH elevado da "Solução de paragem", de p-nitrofenol existe como totalmente deprotonado p-nitrophenolat e pode ser detectado por sua luz absorbância em 405 nm.
2. Prepare a solução de Tyrode contendo 130 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,4 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10mm HEPES, glicose de 5,6 mM e BSA 0,1%. Ajuste o pH para 7,4 com 3 M de NaOH.
3. Prepare a solução de Lise adicionando um volume de 1% de Triton X-100 solução de Tyrode.
4. Preparar a solução de paragem composta por glicina de 200mm e ajustar o pH a 10,7 com NaOH.
5. Prepare a solução de pNAG (2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside 4-nitrofenil) dissolvendo-se pNAG em ácido cítrico de 0,4 M a uma concentração final de 4 mM.
6. Calcular a quantidade de células necessárias para o ensaio (realizar o ensaio em duplicado). Uso de 200.000 PMCs por bem. Use 2 poços como controles negativos (solução de Tyrode sem qualquer secretagogues como DNP ou composto 48/80) e 2 poços como controles positivos (solução de Tyrode, com 10 µM Ionomycin) para cada genótipo.
7. Transferir as células para um tubo de centrífuga plástico 15 mL, ajuste o volume para 15 mL com solução de Tyrode e centrifugar a x 200 g por 4 min. remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur e ressuspender as células em solução de Tyrode para 2 x 10⁶ células /mL.
8. Transferi 100 µ l de suspensão de células por poço em uma chapa bem V-fundo de 96 poços. Adicione 25 µ l de estimulação ou solução de controle a cada poço (de acordo com o esquema de pipetagem, ilustrado na Figura 3A). Incube as celulas por 45 min a 37 ° C e 5% de CO₂.
9. Pare a reação, colocando a placa de 96 poços no gelo por 5 min. Em seguida, centrifugar a placa a 4 ° C por 4 min a 120 x g. Transferência de 120 µ l do sobrenadante com uma pipeta multicanal para uma placa de 96 poços de fundo plano e colocá-lo no gelo. Com cuidado, evite tocar as pelotas de célula, mas completamente, aspirar o sobrenadante.
10. Adicione 125 µ l de tampão de Lise nas pelotas de célula. Incubar as pelotas de célula por 5 min à temperatura ambiente e ressuspendê-los após a incubação por pipetagem repetidas (aproximadamente 5 vezes).
11. Pipete 25 µ l da solução de pNAG (4mm) em poços necessários de uma nova placa de 96 poços de fundo plano. Adicione 25 µ l de cada sobrenadante para a solução de pNAG preparado, bem como 25 µ l de cada lisado celular.
12. Incubar os lotes de reação para 1 h a 37 ° C. Após a incubação, pipete 150 µ l de solução de paragem em cada poço para parar a reação.
13. Analisar a placa com um leitor de microplacas usando uma configuração dual-comprimento de onda de 405 nm com referência 630 nm para subtração de fundo automático. No programa de aquisição, marque a caixa "Referência" e no menu de elemento do programa de "Absorção", selecione "630 nm" da lista drop-down. Se a densidade óptica das amostras é muito alta, prepare uma diluição adequada da sonda antes de remeasuring.
14. Calcule a percentagem de β-hexosaminidase liberação de acordo com a seguinte equação:
    
    onde lançamento [%] é a porcentagem de liberação de beta-hexosaminidase específico, um [sobrenadante] é o fundo corrigido a absorção do líquido sobrenadante, e um [lisado] é o fundo corrigida de absorção da célula correspondente lisada.

Resultados

EPM foram isoladas a partir de 3 ratos de tipo selvagem (C57BL/6N) por lavagem intraperitoneal e mais cultivadas em meio RPMI suplementado com FCS de 20% e 1% caneta-Strep na presença de fatores de crescimento (IL-3 a 10 ng/mL) e SCF em 30 ng/mL em estéreis humedecidas condições no 37 ° C e 5% CO₂. O meio foi mudado nos dias 2 e 9, após o isolamento da célula. A morfologia celular foi analisada usando transmissão luz imagem DIC (consulte a Figura 1<...

Discussão

Modelos MC podem ser usados com sucesso para estudar MC degranulação, quimiotaxia, adesão, bem como para elucidar intracelular vias de transdução sinalização envolvidas na ativação de MC. Alguns pesquisadores uso modelos humanos MCs, tais como linhas imortalizadas (LAD2 e HMC1) ou MCs humanas derivados da medula sangue células progenitoras (CD133 +) e células progenitoras de sangue periférico (CD34 +). Outros preferem roedores modelos MC, tais como imortalizados (leucemia basophilic do rato RBL - 2H 3 MC linh...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI Medium	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
Anti-DNP-Antibody	Sigma-Aldrich	D-8406
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
Compound 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	X100
4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell Imaging Chamber	Sigma-Aldrich	GBL635051
96-Well plate, v-shaped bottom	Corning	3896
96-Well plates, flat bottom	Greiner Bio-One	655180
Microtiter plate reader with "i-control" software	Tecan	Nano Quant, infinite M200 Pro
Flat bottom plate	Greiner Bio-One	655180
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62.547.254
Culture Flasks (25 cm)	Greiner Bio-One	69160
Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1	Menzel	CB00250RA1
Hemocytometer	VWR	631-0696
Inverted Microscope	Zeiss	Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil	Zeiss	440260-9900
HC Filter Set Fura 2	AHF	H76-521
CCD Camera	Zeiss	AxioCam MRm
Monochromatic Light Source	Sutter Instruments	Lambda DG-4
Imaging Acquisition Program	Zeiss	AxioVision 4.8.2
Gravity fed solution application system	Custom Made	4-channel
15 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62,554,502
Bench Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.0R